ZytoDot CISH Polymer Detection Kit

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1 ZytoDot CISH Polymer Detection Kit C C Für die Detektion DIG-markierter Sonden durch chromogene in situ Hybridisierung (CISH).... In-vitro-Diagnostikum gemäß EU-Richtlinie 98/79/EG

2 ZytoDot CISH Polymer Detection Kit C C Für die Detektion DIG-markierter Sonden durch chromogene in situ Hybridisierung (CISH).... In-vitro-Diagnostikum gemäß EU-Richtlinie 98/79/EG

3 Stand: 24. September 2012 (5.0) Warenzeichen: ZytoVision und ZytoDot sind Warenzeichen der ZytoVision GmbH.

4 Inhalt 1. Bestimmung der Anwendung Sicherheitshinweise und Entsorgung Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit Komponenten Lagerung und Haltbarkeit Untersuchungsmaterial Zusätzlich benötigtes Material Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit Protokoll Vorbereitende Schritte Post-Hybridisierung und Detektion [Tag 2] Interpretation der Ergebnisse Literatur Probleme und mögliche Ursachen... 8

5 1. Bestimmung der Anwendung Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit ist für den Nachweis Digoxigenin (DIG)-markierter Sonden in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeoder Zellproben mittels chromogener in situ Hybridisierung (CISH) bestimmt. DIG-markierte Sonden werden unter Verwendung von primären (nicht-markierten) Anti-DIG Antikörpern, sekundären polymerisierten HRP-konjugierten Antikörpern und HRP-Green nachgewiesen. Die Interpretation der Ergebnisse muss im Kontext der klinischen Anamnese unter Einbeziehung weiterer klinischer und pathologischer Daten des Patienten durch einen qualifizierten Pathologen erfolgen. 2. Sicherheitshinweise und Entsorgung Bedienungsanleitung vor Durchführung der Anwendung lesen! Reagenzien nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht mehr benutzen! Kreuzkontaminationen und mikrobakterielle Kontaminationen der Reagenzien vermeiden! Einige der System-Komponenten enthalten gesundheitsgefährdende Stoffe in geringen Konzentrationen und Volumina. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien muss vermieden werden. Entsprechende Schutzmaßnahmen sind zu treffen (Benutzung von Einmalhandschuhen, Schutzbrille und Laborbekleidung)! Bei Kontakt mit den Reagenzien müssen die betroffenen Stellen sofort mit viel Wasser gespült werden! Niemals Lösungen mit dem Mund pipettieren! Die Entsorgung der Reagenzien unterliegt den örtlichen Regularien! Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage für den berufsmäßigen Verwender erhältlich! - 1 -

6 3. Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit 3.1 Komponent omponenten Das Kit besteht aus folgenden Komponenten: Code Komponente Menge Gefäß BS1 Blocking Solution 4 ml 1 ml Tropfflasche, oranger Verschluss AB1 Mouse-Anti-DIG 4 ml 1 ml Tropfflasche, pinker Verschluss AB2 Anti-Mouse-HRP-Polymer 4 ml 1 ml Tropfflasche, violetter Verschluss SB1a DAB Solution A 0,3 ml 0,1 ml Tropfflasche, grüner Verschluss SB1b DAB Solution B 10 ml 2 ml Tropfflasche, grauer Verschluss CS1 Mayer s Hematoxylin Solution 20 ml 4 ml Schraubdeckelflasche, schwarz MT4 Mounting Solution (alcoholic) 4 ml 1 ml Glasflasche, braun Gebrauchsanleitung 1 1 C (40 Tests): Alle Komponenten sind ausreichend für 40 Anwendungen. C (10 Tests): Alle Komponenten sind ausreichend für 10 Anwendungen. 3.2 Lagerung und Haltbarkeit Die Bestandteile des Kits müssen bei 2 8 C gelagert werden. Unter den angegebenen Lagerungsbedingungen sind die Komponenten des Kits bis zu den auf den einzelnen Etiketten angegebenen Haltbarkeitsdaten stabil

7 3.3 Untersuchungsmaterial Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit ist auf formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe- und Zellproben optimiert. Die Verwendung des Kits für andere Gewebe- und Zellproben (z. B. Methanol/Eisessig-fixierte Zellen oder Zellaus-striche) ist grundsätzlich möglich; abweichend fixiertes oder eingebettetes Untersuchungsmaterial kann allerdings die Anpassung des Protokolls durch den Anwender erfordern. Eine notwendige Anpassung wird von unseren Experten gerne unterstützt. Vor dem Nachweis hybridisierter Digoxigenin-markierter Sonden empfehlen wir folgende Schritte: Gewebevorbereitung: Fixierung in 10% neutralgepuffertem Formalin für 24 h bei RT. Standardmäßige Paraffin-Einbettung und Anfertigung von Mikrotomschnitten mit einer Schnittdicke von 3-5 µm. Vorbehandlung: Die Vorbehandlung (Entparaffinieren/Proteolyse) der Zellund Gewebeschnitte sollte nach Standardprotokollen durchgeführt werden. Generell empfehlen wir die optimale Proteolysezeit in Vortests zu bestimmen. Hybridisierung: Die Hybridisierung sollte in einer feuchten Kammer bei 37 C über Nacht durchgeführt werden. Die Objektträger vor der Detektion waschen. Quenching: Objektträger für 10 min in 3% H 2 O 2 in Methanol inkubieren. Das Quenching kann entweder nach der Entparaffinierung der Objektträger oder nach der Hybridisierung durchgeführt werden. 3.4 Zusätzlich benötigtes Material Folgende Reagenzien, Materialien und Geräte sind nicht im System enthalten: Reagenzien und Materialien Geräte - Ethanol 100%, vergällt - Deionisiertes oder destilliertes Wasser - PBS/Tween - Xylol - Waschküvetten, ml - Deckgläser (22 mm x 22 mm, 24 mm x 32 mm) - Lichtmikroskop - 3 -

8 4. Das ZytoDot CISH Polymer Detection Kit Protokol oll 4.1 Vorbereitende Schritte Blocking Solution E_pNF, Mouse-Anti-DIG E^_NF, Anti-Mouse-HRP-Polymer E^_OF, Mayer s Hematoxylin Solution E`pNF, Mounting Solution (alcoholic) EjqQF: Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Herstellung der DAB Solution: Direkt vor Gebrauch DAB Solution B Ep_NÄF tropfenweise in ein graduiertes Reaktionsgefäß bis zu 1 ml geben und einen Tropfen DAB Solution A Ep_N~F zugeben. Die Lösung ist 2 h bei Raumtemperatur (RT) stabil. 4.2 Detektion NK Jeweils 3x 2 min in PBS/Tween (nicht enthalten) waschen OK Blocking Solution E_pNF tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 10 min bei RT inkubieren PK Vorsichtiges Abtupfen der Blocking Solution E_pNF; nicht abspülen! QK Mouse-Anti-DIG E^_NF tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 30 min bei RT inkubieren RK Jeweils 3x 2 min in PBS/Tween (nicht enthalten) waschen SK Anti-Mouse-HRP-Polymer E^_OF tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 30 min bei RT inkubieren TK Jeweils 3x 2 min in PBS/Tween (nicht enthalten) waschen UK Während der Waschschritte DAB Solution ansetzen durch Vorlage von 1 ml DAB Solution B Ep_NÄF in einem graduierten Reaktionsgefäß und Zugabe von einem Tropfen DAB Solution A Ep_N~F VK DAB Solution tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 30 min bei RT inkubieren NMK Objektträger in Küvette überführen und 2 min mit laufendem Leitungswasser waschen NNK= Gegenfärbung der Gewebe-/Zellproben für 8-10 s mit Mayer s Hematoxylin Solution E`pNF NOK= Objektträger in Küvette überführen und 2 min mit laufendem Leitungswasser waschen NPK= In 70%, 85%, 95% und 2x 100% Ethanol für jeweils 2 min dehydrieren NQK= Inkubation für 2x 2 min in Xylol (möglichst reines Xylol verwenden) - 4 -

9 Anschließend die Schnitte für etwa 15 min lufttrocknen lassen NRK= Die Schnitte mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32 mm) luftblasenfrei unter Verwendung der Mounting Solution (alcoholic) EjqQF eindecken und ca. 30 min lufttrocknen lassen NSK= Die Auswertung des Untersuchungsmaterials erfolgt an einem Lichtmikroskop - 5 -

10 5. Interpretation der Ergebnisse Die mit Digoxigenin (DIG) markierten Sonden erscheinen als braune, distinkte, punktförmige DAB-Signale, welche sich deutlich vom mit Hämatoxylin gegengefärbten Zellhintergrund unterscheiden lassen. In normalen diploiden Kernen ohne chromosomale Aberrationen sind pro Nukleus 2 punktförmige Signale mit glatten, runden Kanten sichtbar, mit Ausnahme von Sonden, die gegen Gonosomen gerichtet sind und die zu 0 bis 2 Signalen pro Sonde in Abhängigkeit vom Geschlecht führen. Aufgrund von Mitose können auch in einem kleinen Prozentsatz nicht-neoplastischer Zellen zusätzliche Signale sichtbar sein. Gelegentlich werden in paraffineingebetteten Gewebeproben Zellkerne mit weniger Signalen beobachtet. In Zellen mit chromosomalen Aberrationen sind abweichende Signalmuster zu erkennen. Die Visualisierung der Signale sollte mit einem 40x-Objektiv erfolgen. Hierbei sollten die Signale deutlich sichtbar sein. Die Gegenfärbungszeit ist abhängig von den verwendeten Gewebe-/Zellproben und sollte daher optimiert werden. Zu dunkle Gegenfärbung sollte vermieden werden, da dies positive Signale überdecken könnte. Das endgültige Ergebnis ist stark von den vorangegangenen experimentellen Schritten abhängig, wie z. B. der Fixierung des Gewebes, Vorbehandlung, Denaturierung der DNA-Sonde, Hybridisierung und der Waschschritte. Für eine anwenderfreundliche Durchführung empfehlen wir das ZytoDot-Hybridisierungssystem der ZytoVision. Für die Fehlerbehebung siehe Kapitel

11 6. Literatur Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Speel EJ, et al. (1994) J Histochem Cytochem 42: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN

12 7. Probleme und mögliche Ursachen Jede Abweichung von den Vorgaben der Bedienungsanleitung kann zu einem fehlenden oder zu schwachen Färbeergebnis führen. Problem Mögliche Ursache Präzipitatbildung Schwaches oder kein Signal Keine Zielsequenzen vorhanden Ungleichmäßige, z. T. schwache Färbung Schlieren auf dem OT nach Abstoppen der Pepsinbehandlung Kreuzhybridisierungssignale; hohe Hintergrundfärbung Schnitt löst sich vom Objektträger Fixierung der Gewebe-/Zellprobe nicht optimal Proteolytische Vorbehandlung nicht optimal Denaturierungstemperatur nicht korrekt Hybridisierungstemperatur nicht korrekt Hybridisierungszeit zu kurz Inkubationszeit mit chromogenem Substrat zu kurz Zu dunkle Gegenfärbung Unvollständige Entparaffinierung Aufgetragenes Sondenvolumen pro Areal zu groß Proteolytische Vorbehandlung zu stark Dehydrierung der Schnitte zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Waschtemperatur nach der Hybridisierung zu niedrig Proteolytische Vorbehandlung zu stark Ungeeignete Objektträgerbeschichtung Maßnahme sofortiges Waschen der OT in deionisiertem oder destilliertem Wasser Verwendung des Kontroll-OT Optimierung der Fixierungszeit Optimierung der Inkubationszeit Temperatur überprüfen Temperatur überprüfen Hybridisierungszeit verlängern Verlängerung der Inkubationszeit Optimierung der Inkubationszeit frische Lösungen verwenden, Entparaffinierungszeiten überprüfen Reduktion des Sondenvolumens pro Schnitt/Areal, Auftragung der Sonde tropfenweise um lokale Konzentrationen zu vermeiden Optimierung der Inkubationszeit Dehydrierung vermeiden Temperatur überprüfen Inkubationszeit verkürzen Geeignete Objektträger verwenden - 8 -

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