ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit

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1 ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit C C Zum Nachweis des humanen ERBB2-Gens und der alpha-satelliten von Chromosom 17 durch chromogene in situ Hybridisierung (CISH).... In-vitro-Diagnostikum gemäß EU-Richtlinie 98/79/EG

2 Stand: 1. Januar 2015 (5.1) Warenzeichen: ZytoVision und ZytoDot sind Warenzeichen der ZytoVision GmbH.

3 Inhalt 1. Bestimmung der Anwendung Prinzip der Methode Sicherheitshinweise und Entsorgung Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit Komponenten Lagerung und Haltbarkeit Untersuchungsmaterial Zusätzlich benötigtes Material Wichtige Informationen Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit Protokoll Vorbereitende Schritte Vorbehandlung (Entparaffinieren/Proteolyse) [Tag 1] Denaturierung und Hybridisierung [Tag 1] Post-Hybridisierung und Detektion [Tag 2] Interpretation der Ergebnisse CISH-Ergebnisse Positiv-Kontrolle Literatur Probleme und mögliche Ursachen... 11

4 1. Bestimmung der Anwendung Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit ist für den Nachweis des humanen ERBB2-Gens sowie der alpha-satelliten von Chromosom 17 in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebe- oder Zellproben mittels chromogener in situ Hybridisierung (CISH) bestimmt. Die Interpretation der Ergebnisse muss im Kontext der klinischen Anamnese unter Einbeziehung weiterer klinischer und pathologischer Daten des Patienten durch einen qualifizierten Pathologen erfolgen. 2. Prinzip der Methode Das Vorkommen bestimmter Nukleinsäuresequenzen in Zellen oder Geweben kann mit Hilfe markierter DNA-Sonden durch in situ Hybridisierung nachgewiesen werden. Die Hybridisierung führt zur Duplexbildung zwischen im Untersuchungsgegenstand vorliegenden Sequenzen und der entsprechenden DNA- Sonde. Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit verwendet die Sonde ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe EmaNOF. Diese Sonde besteht aus Digoxigeninmarkierten Polynukleotiden, die spezifisch gegen Sequenzen des ERBB2-Gens gerichtet sind, und DNP-markierten Polynukleotiden, die spezifisch gegen alpha-satelliten-sequenzen von Chromosom 17 gerichtet sind. Die Duplexbildung der markierten Sonde wird über primäre (nicht markierte) Antikörper, die von sekundären polymerisierten Enzym-konjugierten Antikörpern detektiert werden, nachgewiesen. Die enzymatische Umsetzung der Substrate führt zur Entstehung starker, permanenter, roter und grüner Signale, die lichtmikroskopisch mit einer 40x-Trockenlinse dargestellt werden können. 3. Sicherheitshinweise und Entsorgung Bedienungsanleitung vor Durchführung der Anwendung lesen! Reagenzien nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht mehr benutzen! Kreuzkontaminationen und mikrobakterielle Kontaminationen der Reagenzien vermeiden! Einige der System-Komponenten enthalten gesundheitsgefährdende Stoffe in geringen Konzentrationen und Volumina. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien muss vermieden werden. Entsprechende Schutzmaßnahmen sind zu treffen (Benutzung von Einmalhandschuhen, Schutzbrille und Laborbekleidung)! Bei Kontakt mit den Reagenzien müssen die betroffenen Stellen sofort mit viel Wasser gespült werden! - 1 -

5 Niemals Lösungen mit dem Mund pipettieren! Die Entsorgung der Reagenzien unterliegt den örtlichen Regularien! Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage für den berufsmäßigen Verwender erhältlich! 4. Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit 4.1 Komponenten Das Kit besteht aus folgenden Komponenten: Code Komponente PT2 Heat Pretreatment Solution EDTA Menge Gefäß 500 ml 150 ml Schraubdeckelflasche (groß) ES1 Pepsin Solution 4 ml 1 ml Tropfflasche, weißer Verschluss PD12 ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe WB1 Wash Buffer SSC WB5 20x Wash Buffer TBS 0,4 ml 0,1 ml Reaktionsgefäß, brauner Deckel 500 ml 150 ml Schraubdeckelflasche (groß) 2x 50 ml 50 ml Schraubdeckelflasche AB14 Anti-DIG/DNP-Mix 4 ml 1 ml Tropfflasche, gelber Verschluss AB13 HRP/AP-Polymer-Mix 4 ml 1 ml Tropfflasche, blauer Verschluss SB6a AP-Red Solution A 0,4 ml 0,1 ml Tropfflasche, roter Verschluss (klein) SB6b AP-Red Solution B 15 ml 4 ml Tropfflasche, roter Verschluss SB7a HRP-Green Solution A 0,8 ml 0,2 ml Tropffl., grüner Verschluss (klein) SB7b HRP-Green Solution B 15 ml 4 ml Tropfflasche, grüner Verschluss CS2 Nuclear Blue Solution 20 ml 4 ml Schraubdeckelflasche, schwarz MT4 Mounting Solution (alcoholic) 4 ml 1 ml Glasflasche, braun SC2 ERBB2 Control Slide 2 1 Kunststoffmappe AP-Red Reaktionsgefäß 2 1 Graduiertes Reaktionsg., roter Deckel HRP-Green Reaktionsgefäß 2 1 Graduiertes Reaktionsg., grüner Deckel Gebrauchsanleitung 1 1 C (40 Tests): Die Komponenten EmaNOF, EbpNF, E^_NQF, E^_NPF, Ep_S~J ÄF, Ep_T~JÄF, E`pOF und EjqQF sind ausreichend für 40 Anwendungen. Die Komponenten EmqOF und Et_NF sind ausreichend für jeweils 7 Küvetten à 70 ml. Die Komponente Et_RF ist ausreichend für 27 Küvetten à 70 ml. C (10 Tests): Die Komponenten EmaNOF, EbpNF, E^_NQF, E^_NPF, Ep_S~J ÄF, Ep_T~JÄF, E`pOF und EjqQF sind ausreichend für 10 Anwendungen. Die Komponenten EmqOF und Et_NF sind ausreichend für jeweils 2 Küvetten à 70 ml. Die Komponente Et_RF ist ausreichend für 14 Küvetten à 70 ml

6 4.2 Lagerung und Haltbarkeit Die Bestandteile des Kits müssen bei 2 8 C gelagert werden. Unter den angegebenen Lagerungsbedingungen sind die Komponenten des Kits bis zu den auf den einzelnen Etiketten angegebenen Haltbarkeitsdaten stabil. 4.3 Untersuchungsmaterial Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit ist auf formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe- und Zellproben optimiert. Die Verwendung des Kits für andere Gewebe- und Zellproben (z. B. Methanol/Eisessig-fixierte Zellen oder Zellausstriche) ist grundsätzlich möglich; abweichend fixiertes oder eingebettetes Untersuchungsmaterial kann allerdings die Anpassung des Protokolls durch den Anwender erfordern. Eine notwendige Anpassung wird von unseren Experten gerne unterstützt. Wir empfehlen folgende Gewebeaufbereitung: Fixierung in 10% neutralgepuffertem Formalin für 24 h bei RT Um eine optimale und gleichmäßige Fixierung und Paraffineinbettung zu erzielen, sollte die Probengröße nicht mehr als 0,5 cm 3 betragen. Standardmäßige Prozessierung und Paraffineinbettung Benutzen Sie qualitativ hochwertiges Paraffin. Die Infiltration und Einbettung sollte bei Temperaturen unter 65 C stattfinden. Mikrotomschnitte von 3-5 µm-schnittdicke anfertigen Ziehen Sie die Schnitte auf Silan-beschichtete Objektträger oder Adhäsions- Objektträger (z. B. HistoBond ) und fixieren Sie für 2-16 h bei C. Verwendung des Objektträgers ERBB2 Control Slide Ep`OF als Kontrolle: Die Kontroll-Objektträger wurden bei 58 C für 15 min vorfixiert. Falls gewünscht, kann das zu untersuchende Gewebe neben die Kontroll-Zellproben aufgezogen werden. In jedem Fall müssen die Kontroll-Objektträger vor Benutzung bei 60 C für 2-16 h fixiert werden. 4.4 Zusätzlich benötigtes Material Folgende Reagenzien, Materialien und Geräte sind nicht im System enthalten: Reagenzien und Materialien - Klebepistole mit Heißkleber oder Rubber Cement (Fixogum) - Ethanol 100%, vergällt - Deionisiertes oder destilliertes Wasser - Xylol - Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) 30% - Methanol 100% Geräte - 3 -

7 - Wasserbad (80 C, kochend) - Wärmeplatte - Hybridisierungsofen (Wärmeschrank) - Waschküvetten, ml - Feuchte Kammer - Pipette (10 µl, 1000 µl) - Deckgläser (22 mm x 22 mm, 24 mm x 32 mm) - Lichtmikroskop 4.5 Wichtige Informationen Folgende Dinge sind zu beachten: Die Gewebe- und Zellschnitte dürfen während der Hybridisierungs- und Waschschritte nicht austrocknen! Die in der Anleitung beschriebenen Temperaturen für Denaturierungen und Waschungen sollten generell eingehalten werden. Abhängig vom Alter und von der Fixierung des Untersuchungsmaterials kann jedoch eine Erhöhung oder Absenkung der Denaturierungs- bzw. Waschtemperaturen zu einer Verbesserung der Hybridisierungsergebnisse führen! 5. Das ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe Kit Protokoll 5.1 Vorbereitende Schritte Tag 1: Herstellung der Ethanolreihe (70%, 90% und 100% Ethanol): Jeweils 7, 9 und 10 Teile Ethanol (100%) mit 3, 1 und 0 Teilen deionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen. Die Ethanolreihe kann bei Verwahrung in geeigneten Flaschen wiederholt verwendet werden. Heat Pretreatment Solution EDTA EmqOF: In einer abgedeckten Küvette, in einem kochenden Wasserbad stehend, auf mindestens 95 C erhitzen. Pepsin Solution EbpNF: Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Herstellung der 3% H 2 O 2 : 1 Teil 30% H 2 O 2 mit 9 Teilen 100% Methanol verdünnen. Tag 2: Wash Buffer SSC Et_NF: Zwei Küvetten mit Wash Buffer SSC vorbereiten, eine bei Raumtemperatur (RT), die andere auf 75 C erhitzen (die Temperatur sollte bei mehr als zwei Objektträgern um jeweils 1 C pro Objektträger erhöht werden; 80 C dürfen allerdings nicht überschritten werden)

8 Herstellung des 1x Wash Buffer TBS: 1 Teil 20x Wash Buffer TBS Et_RF mit 19 Teilen deionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen. Verdünnter 1x Wash Buffer TBS ist bei 2-8 C eine Woche haltbar. Anti-DIG/DNP-Mix E^_NQF, HRP/AP-Polymer-Mix E^_NPF, Nuclear Blue Solution E`pOF, Mounting Solution (alcoholic) EjqQF: Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Herstellung der AP-Red Solution: Direkt vor Gebrauch einen Tropfen (30 µl) AP-Red Solution A Ep_S~F in ein graduiertes Reaktionsgefäß (z. B. AP-Red Reaktionsgefäß) geben, bis zu 1 ml mit AP-Red Solution B Ep_SÄF auffüllen und gut mischen. Keinem starken direkten Lichteinfall aussetzen. Herstellung der HRP-Green Solution: Direkt vor Gebrauch zwei Tropfen (2x 20 µl) HRP-Green Solution A Ep_T~F in ein graduiertes Reaktionsgefäß (z. B. HRP-Green Reaktionsgefäß) geben, bis zu 1 ml mit HRP-Green Solution B Ep_TÄF auffüllen und gut mischen. 5.2 Vorbehandlung (Entparaffinieren/Proteolyse) [Tag 1] N. Objektträger für 10 min bei 70 C inkubieren (z. B. auf einer Wärmeplatte) OK= PK= QK= RK= Objektträger 2x 5 min in Xylol inkubieren 3x 3 min in 100% Ethanol inkubieren Alternativ können auch andere Entparaffinierungsprotokolle aus der Routine- Immunhistochemie verwendet werden, wie z. B. 2x 15 min Xylol, 2x 5 min 100% Ethanol, 2x 5 min 96% Ethanol, 1x 5 min 70% Ethanol. Objektträger 5 min in 3% H 2 O 2 inkubieren 2x 1 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen SK= Objektträger in die vorab erhitzte Heat Pretreatment Solution EDTA EmqOF überführen und für 15 min inkubieren TK= Objektträger sofort in deionisiertes oder destilliertes Wasser überführen, 2x 2 min waschen und anschließend das Wasser abtupfen oder ablaufen lassen UK= Pepsin Solution EbpNF gewebe-/zellbedeckend (tropfenweise) auf die Objektträger aufträufeln und bei RT für 5 min in einer feuchten Kammer inkubieren Abhängig von mehreren Faktoren, z. B. von der Art und Dauer der Fixierung, der Dicke der Schnitte und der Art des Gewebes/der Zellen können unterschiedliche Inkubationszeiten notwendig sein. Als Richtwert kann bei Gewebeproben und bei Zellproben eine Inkubation von 3-10 min angegeben werden. Generell empfehlen wir die optimale Proteolysezeit in Vortests zu bestimmen. VK= Objektträger in deionisiertes oder destilliertes Wasser tauchen und anschließend Wasser abtupfen oder ablaufen lassen NMK=In 70%, 90% und 100% Ethanol für jeweils 1 min dehydrieren Anschließend die Schnitte an der Luft trocknen lassen

9 5.3 Denaturierung und Hybridisierung [Tag 1] NK= ZytoDot 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe EmaNOF vortexen und je 10 µl auf verschiedene Schnitte des Untersuchungsmaterials pipettieren Sonde tropfenweise auf der gesamten Zielfläche verteilen, um eine lokale Konzentration der Sonde zu vermeiden. Alternativ Sonde in die Mitte des Deckgläschen geben, Deckglas umdrehen und auf Schnitt legen. Das unmittelbare leichte Erwärmen sowie der Einsatz einer abgeschnittenen Pipettenspitze erleichtern gegebenenfalls das Pipettieren der Sonde. OK= Die Schnitte mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm) luftblasenfrei abdecken und versiegeln. Deckglasränder z. B. mit einer Schicht Heißkleber mit Hilfe einer Klebepistole oder mit Rubber Cement abdichten PK= Die Objektträger für 5 min bei C (z. B. auf einer Wärmeplatte) denaturieren QK= Die Objektträger in eine feuchte Kammer überführen und zur Hybridisierung über Nacht bei 37 C (z. B. in einem Wärmeschrank) inkubieren Die Gewebe-/Zellschnitte dürfen während der Hybridisierung nicht austrocknen. 5.4 Post-Hybridisierung und Detektion [Tag 2] NK= Rubber Cement oder Heißkleber vorsichtig entfernen= OK Deckgläser durch kurze Inkubation für 5 min in Wash Buffer SSC Et_NF bei RT entfernen PK= 5 min in Wash Buffer SSC Et_NF bei C waschen Der Wash Buffer SSC sollte ausreichend vorgewärmt sein. Bei mehr als 2 Objektträgern muss die Temperatur um jeweils 1 C pro Objektträger erhöht werden. Die Temperatur von 80 C darf nicht überschritten werden! Gegebenenfalls Temperatur mit einem Thermometer überprüfen. QK 2x 1 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen RK Objektträger in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) tauchen und anschließend 1x Wash Buffer TBS abtupfen oder ablaufen lassen SK Anti-DIG/DNP-Mix E^_NQF tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 15 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren TK 3x 1 min in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) waschen und anschließend 1x Wash Buffer TBS abtupfen oder ablaufen lassen UK HRP/AP-Polymer-Mix E^_NPF tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 15 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren VK Während der Waschschritte AP-Red Solution ansetzen durch Vorlage von einem Tropfen (30 µl) AP-Red Solution A Ep_S~F in einem graduierten Reakti

10 onsgefäß (z. B. AP-Red Reaktionsgefäß) und Auffüllen bis 1 ml mit AP-Red Solution B Ep_SÄF, anschließend gut mischen Keinem starken direkten Lichteinfall aussetzen. NMK 3x 1 min in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) waschen NNK AP-Red Solution tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 10 min bei RT inkubieren (geschützt vor starkem direkten Licht). Bei Bedarf kann die Inkubationszeit verkürzt oder verlängert werden (7-15 min) NOK Während der Inkubation HRP-Green Solution ansetzen durch Vorlage von zwei Tropfen (2x 20 µl) HRP-Green Solution A Ep_T~F in einem graduierten Reaktionsgefäß (z. B. HRP-Green Reaktionsgefäß) und Auffüllen bis 1 ml mit HRP- Green Solution B Ep_TÄF, anschließend gut mischen NPK Objektträger 2 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen und anschließend Wasser abtupfen oder ablaufen lassen NQK HRP-Green Solution tropfenweise (3-4 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 10 min bei RT inkubieren (geschützt vor starkem direkten Licht). Bei Bedarf kann die Inkubationszeit verkürzt oder verlängert werden (5-15 min) NRK 2 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen NSK=Gegenfärbung der Gewebe-/Zellproben für 2 min mit Nuclear Blue Solution E`pOF Die Gegenfärbung ist abhängig von den verwendeten Gewebe-/Zellproben und sollte daher optimiert werden. Zu dunkle Gegenfärbung sollte vermieden werden, da dies positive Signale überdecken könnte. NTK= Objektträger in Küvette überführen und 2 min mit laufendem Leitungswasser waschen NUK=3x 30 s in 100% Ethanol dehydrieren (möglichst reines Ethanol verwenden) NVK=Inkubation für 2x 30 s in Xylol (möglichst reines Xylol verwenden) Eine längere Inkubationszeit kann zu Signalverlust führen! OMK=Die Schnitte mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32 mm) luftblasenfrei unter Verwendung der Mounting Solution (alcoholic) EjqQF eindecken und ca. 30 min lufttrocknen lassen ONK=Die Auswertung des Untersuchungsmaterials erfolgt an einem Lichtmikroskop - 7 -

11 6. Interpretation der Ergebnisse 6.1 CISH-Ergebnisse Das CISH Hybridisierungssignal einer ERBB2-Genkopie erscheint als dunkelgrünes, distinktes, punktförmiges Signal, das Signal einer Kopie einer Chromosom-17-Zentromerregion erscheint als hellrotes, distinktes, punktförmiges Signal. Die Signale lassen sich deutlich vom mit Hämatoxylin gegengefärbten Zellhintergrund unterscheiden. Die Visualisierung der Signale sollte mit einem 40x-Objektiv erfolgen. Hierbei sollten die Signale deutlich sichtbar sein. Die Benutzung von kontrastverstärkenden Filtern kann die Farbdarstellung negativ beeinflussen. Um leuchtstarke Signale zu erhalten, öffnen Sie bitte die Aperturblende des Kondensors. Bei Evaluierung der Zellkerne muss auf und ab fokussiert werden, da rote und grüne Signal übereinander liegen können. Vor Auszählung der Signale sollte die Gewebe-/Zellprobe mit einem 10x- oder 20x-Objektiv nach einer möglichen intratumoralen Heterogenität abgesucht werden. Im Falle einer Heterogenität muss ein für die Bestimmung des Amplifikationsstatus repräsentativer Bereich ausgewählt werden. Für die Bestimmung der Signalzahl sollten nekrotische Bereiche, überlappende Zellkerne und Kerne mit schwacher Signalintensität vermieden werden. In normalen diploiden Kernen ohne Genamplifikation sind pro Nukleus 2 grüne und 2 rote punktförmige Signale mit glatten, runden Kanten sichtbar (s. Abb. 1). Aufgrund von Mitose können auch in einem kleinen Prozentsatz nicht-neoplastischer Zellen zusätzliche Signale sichtbar sein. Gelegentlich werden in paraffineingebetteten Gewebeproben Zellkerne mit weniger Signalen beobachtet. In Fällen mit geringem Amplifikationsgrad (s. Abb. 3) oder mit einer Aneusomie von Chromosom 17 (s. Abb. 2) treten ERBB2-Gen-spezifische Signale als multiple grüne Signale oder kleine Cluster auf. Kleine Cluster sind unregelmäßig geformte Signale mit einer Größe von bis zu 5 punktförmigen Signalen. Zum Größenvergleich muss ein einzelner grüner Punkt einer normalen Zelle desselben Objektträgers als Referenz herangezogen werden. Zusätzlich sind rote Chromosom-17-Signale sichtbar. In Fällen mit starker Genamplifikation können in den Nuklei eine große Anzahl grüner Punkte oder große Signal-Cluster mit einer Größe von mehr als 5 punktförmigen Signalen beobachtet werden (s. Abb. 4). Zum Größenvergleich muss ein einzelner grüner Punkt einer normalen Zelle desselben Objektträgers als Referenz herangezogen werden. Einzelne rote Signale sind möglicherweise durch Überlagerung nicht sichtbar. Um die Spezifität der Hybridisierungssignale sowie den korrekten Verlauf der Methode zu beurteilen, sollten bei jeder Hybridisierung Kontrollen mitgeführt werden. Wir empfehlen die Verwendung eines Gewebes mit bekannter Chromosom-17- und ERBB2-Genkopienzahl. Die in der ZytoDot 2C SPEC - 8 -

12 ERBB2/CEN 17 Probe EmaNOF enthaltenen Polynukleotide, die gegen die humane alpha-satelliten-sequenzen des Zentromers von Chromosom 17 gerichtet sind, dienen als interne Kontrolle für eine erfolgreiche, fachgerecht durchgeführte Hybridisierung. Außerdem wird die Intaktheit der zellulären DNA nach-gewiesen. Ein negatives oder unspezifisches Ergebnis kann verschiedene Ursachen haben. Für die Fehlerbehebung siehe Kapitel 8... = rotes Signal = grünes Signal = rotes Signal = grünes Signal 1) Normale Zellen 2) Aneusomie des Chromosom 17.. = rotes Signal = grünes Signal 3) Geringe Genamplifikation 4) Starke Genamplifikation = rotes Signal = grünes Signal 6.2 Positiv-Kontrolle Die mitgelieferten Kontroll-Objektträger ERBB2 Control Slides Ep`OF=dienen der Überprüfung der korrekten Durchführung des CISH-Experiments. Neben der Verwendung als separate Kontrolle kann das zu untersuchende Gewebe auch direkt neben den Zellproben des Kontrollobjektträgers aufgebracht werden, bevor der Objektträger fixiert wird. Ein ERBB2 Control Slide Ep`OF enthält vier verschiedene Zelllinien (siehe unten), die unterschiedliche ERBB2-Amplifikationen aufweisen, und ein Gewebe (Herzmuskel, Hund). Die Zellen wurden in rot-farbigem Paraffin eingebettet und in 10% neutralgepuffertem Formalin für 24 h bei ph 7,0 fixiert. Die auf den positiv geladenen Objektträgern aufgetragenen Zellschnitte haben eine Schnittdicke von 4 µm und wurden bei 58 C für 15 min vorfixiert

13 Der Kontroll-Objektträger ERBB2 Control Slide Ep`OF ist wie folgt aufgebaut: : keine ERBB2-Amplifikation, 1-2 ERBB2- und 1-2 CEN-17-Signale pro Kern 2: keine ERBB2-Signale, keine CEN-17-Signale 3: keine ERBB2-Amplifikation, 1-2 ERBB2- und 1-2 CEN-17-Signale pro Kern 4: Chromosom-17-Aneusomie, 3-6 ERBB2- und 3-6 CEN-17-Signale pro Kern 5: starke ERBB2-Amplifikation, große ERBB2-Cluster pro Kern Vor Gebrauch der Kontroll-Objektträger ERBB2 Control Slide Ep`OF muss das Etikett entfernt, die Objektträger mit einem Stift beschriftet und wahlweise das zu untersuchende Gewebe aufgetragen werden. Anschließend müssen die Kontroll-Objektträger bei 60 C für 2-16 h fixiert werden, bevor mit Kapitel 5.2 Vorbehandlung (Entparaffinierung/Proteolyse) unter Berücksichtigung einer Pepsin-Inkubationszeit von 10 min fortgefahren werden kann. 7. Literatur Bhargava R, et al. (2005) Am J Clin Pathol 123: Coussens L, et al. (1985) Science 230: Hauser-Kronberger C, Dandachi N (2004) J Mol Histol 35: Hopman AHN, et al. (1997) Histochem Cell Biol 108: Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Kounelis S, et al. (2005) Anticancer Res 25: Mayr D, et al. (2009) Histopathology 55: Speel EJ, et al. (1994) J Histochem Cytochem 42: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN

14 8. Probleme und mögliche Ursachen Jede Abweichung von den Vorgaben der Bedienungsanleitung kann zu einem fehlenden oder zu schwachen Färbeergebnis führen. Problem Mögliche Ursache Maßnahme Schlechte Gewebemorphologie Schwache oder keine Signale Schwache rote Signale Schwache grüne Signale Zu stark angedautes Gewebe Keine Zielsequenzen vorhanden Fixierung der Gewebe-/Zellprobe nicht optimal Inkubationszeit mit Pepsin verkürzen Verwendung von Kontroll-Präparaten Optimierung der Fixierungszeit; Überprüfung der Qualität des Fixativs und seiner Kompatibilität mit in-situ- Hybridisierungs-Systemen Über- oder unterverdautes Gewebe Optimierung der proteolytischen Inkubationszeit Denaturierungstemperatur nicht korrekt Hybridisierungstemperatur nicht korrekt Temperatur der Stringenzwaschung nicht korrekt Temperatur der Antikörperinkubationen nicht korrekt Hybridisierungszeit zu kurz Inkubationszeit mit chromogenem Substrat zu kurz Chromogene Substrate wurden zu früh angesetzt Zu dunkle Gegenfärbung Unzureichende Herstellung der chromogenen Substrate AP-Red Solution wurde starkem direkten Lichteinfall ausgesetzt Inkubationszeiten der Waschschritte nach Färbung mit HRP-Green waren zu lang Gegenfärbungszeit zu lang Temperatur überprüfen und ggf. anpassen Hybridisierungszeit mind. 12 h; ggf. verlängern Verlängerung der Inkubationszeit Ansetzen der chromogenen Substrate direkt vor Gebrauch Verkürzung der Inkubationszeit Statt Verwendung von einem Tropfen AP- Red Solution A 30 µl verwenden und statt Verwendung von zwei Tropfen HRP-Green Solution A 40 µl verwenden, anschließend mit der entsprechenden Solution B auf 1 ml auffüllen Weder das Ansetzten noch die Färbung mit AP-Red Solution sollte bei starkem direkten Lichteinfall erfolgen Angegeben Inkubationszeiten nicht überschreiten Verkürzung der Gegenfärbungszeit

15 Grüne Signale bleichen oder laufen aus Ungleichmäßige, z. T. schwache Färbung Starke Hintergrundfärbung Schnitt löst sich vom Objektträger Es wurde ein ungeeignetes Eindeckmedium verwendet Schnitte wurden nicht ausreichend dehydriert Substrat-Reaktion ist zu intensiv Benutzen sie ausschließlich das Eindeckmedium aus dem Kit oder Xylolbasierte Eindeckmedien frei von Verunreinigungen; benutzen sie keine Eindeckfolie Nur frische Ethanol und Xylol-Lösungen verwenden; nur reines Xylol verwenden Substrat-Inkubationszeit verkürzen; Substrat-Lösung nicht auf über 25 C erwärmen; Inkubation nur bei Raumtemperatur durchführen Unvollständige Entparaffinierung Frische Lösungen verwenden, Entparaffinierungszeiten überprüfen Zu geringes Reagenzvolumen Lufteinschlüsse vor der Hybridisierung oder während des Eindeckens Reagenzvolumen muss ausreichend groß sein, um den Gewebebereich abzudecken Luftblasen vermeiden Schnitte nicht ausreichend gespült Benutzen sie frische Waschpuffer bzw. wo angegeben deionisiertes oder destilliertes Wasser Schnitte sind während der Hybridisierung oder danach ausgetrocknet Waschtemperatur nach der Hybridisierung zu niedrig Substrat-Inkubationszeit zu lang Endogene Levamisol-resistente Phosphatase vorhanden Ungeeignete Objektträgerbeschichtung Austrocknung vermeiden; Feuchte Kammer verwenden; Deckglasränder gründlich versiegeln Temperatur überprüfen und ggf. anpassen Substrat-Inkubationszeit verkürzen Zusätzliche Blockierung mit Bouin 's Lösung oder 1 M Zitronensäure für 1-10 min Verwenden Sie Silan-beschichtete oder Adhäsions-Objektträger

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