Abbildende Massenspektrometrie an biologischen Proben

Transkript

1 Abbildende Massenspektrometrie an biologischen Proben Bernhard Lendl Institut für chemische Technologien und Analytik

2 Inhalt der Vorlesung Motivation Anwendungsbereiche Gerätetechnik (MALDI, SIMS, DESI) Probennahme, Probenvorbereitung Messung Auswertetechniken Beispiele Lipide Peptide/Proteine Zusammenfassung und Ausblick Stärken/Schwächen Zukünftige Entwicklungen

3 Ziele der Vorlesung Vermittlung eines grundlegenden Verständnisses über die Funktionsprinzipien moderner Techniken der abbildenden Massenspektrometrie Kennenlernen der Stärken/Schwächen der vorgestellten Techniken Beispiele sollen auch Interesse hervorrufen diese Techniken in der eigenen Forschung anwenden zu wollen

4 Motivation Anwendungsbereiche 100 kda Ortsaufgelöste Information bzgl. der chemischen Zusammensetzung einer biologischen Probe Massenspektrometrie: Identifizierung von Atomen, kleinen und großen Molekülen: Medikamente, Lipide, Peptide, Proteine, Metabolite, Polymere, Kohlenhydrate,... Markierungsfrei Anwendungsbereiche Verständins von biochemischen Vorgängen in biologischen Systemen Wirkstoffentwicklung und Wirkstofflokalisierung Medizinische Diagnostik

5 Historische Entwicklung analytischer Messgeräte Protocols for Mass Microscopy, Ed. M. Setou, Springer 2010

6 Experimentelle Realisierung S. Luxembourg, Anal. Chem. 2004, 76,

7 Wichtigste MS Techniken für die bildgebende Analyse von biologischen Proben MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation) SIMS (secondary ion mass spectrometry) DESI (desorption electrospray ionisation) MALDI SIMS DESI Druck Vakuum Vakuum Atmospährendruck Massenbereich < 40 kda < 1 kda < 5 kda Probenvorbereitung hoch mittel gering Ortsauflösung ~10-20 µm Sub-µm bis 50 nm ~200 µm

8 Aufgabe der Matrix MALDI Isolierung des Analyten durch Verdünnung, Verhinderung der Aggregatbildung Stabilisierung des Matrix-Analyt Co-Kristalls im Vakuum Absorption der Laserenergie Schonender Zerfall des Co-Kristalls Wichtige Matrixmaterialien Sinapinsäure, SA (3,5-dimethoxy-4-hydroxy-Zimtsäure) Geringe Löslichkeit in H 2 O, löslich in MeOH/ H 2 O sowie in polaren org. LM Proteine (4-30 kda), hohes S/N CHCA (a-cyano-4-hydroxy-zimtsäure) Geringe Löslichkeit in H 2 O, löslich in MeOH/ H 2 O sowie in polaren org. LM Lipide und Peptide (~8 kda) DHB (2,5-dihydroxy-Benzoesäure) löslich in H 2 O, sowie in MeOH/ H 2 O u. polaren org. LM Qualität des Massenspektrums hängt von der Qualität des Matrixkristalls ab Lipide und Peptide (~5 kda)

9 MALDI Time of Flight Mass Spectrometry MALDI Linear TOF Laser DESORPTION IONISIERUNG TRENNUNG Linearer Modus DETEKTION BESCHLEUNIGUNG VERZÖGERTE EXTRAKTION (DELAYED EXTRACTION) Reflectron Modus DETEKTION

10 Unterschiede zu konventionellem MALDI Analyten liegen nicht getrennt vor Ionenunterdrückungseffekte Probenvorbehandlung oftmals notwendig Konzentrationsverhältnis Matrix/Analyt Nicht konstante Oberflächeneigenschaften Rauhigkeit Permitivität der Probe

11 Orthogonale MALDI - MS Apparative Trennung der Prozesse: zb.: Generation von Analytionen Massenanalyse

12 Beispiel zum Ionenunterdrückungseffekt Probe jeweils 0.5 µl 100 nm ACTH Matrix: gesprayt 10 mg/ml a-chca in 50% ACN und 0.1% TFA ITO: Indium Tin Oxide (leitend) Protocols for Mass Microscopy, Ed. M. Setou, Springer 2010

13 Work flow für MALDI Imaging - Herausforderungen Schritt Probennahme: dünne, gut erhaltenen (repräsentative) Probe Waschschritte Zugabe von Reagentien Herausforderung Ziele - Kommentare Kompatibilität mit Referenzmethoden (histologischen Untersuchungen) Unterbindung von post-mortem Enzymaktivität Entfernung von Interferenten Erhöhung der Selektivität MALDI Matrix Applikation Einlagerung des Analyten in den Kristall / Konzentrationsverhältnis Analyt/Matrix Datenaufnahme Von Daten zur Information Diffusion des Analyten laterale Auflösung Rasch, jedoch oft Minuten bis Stunden GB bis TB Datenmenge muss reduziert werden, multivariate Methoden Abgleich mit Referenzinformation

14 Techniken zur Aufgabe der Matrix Makrodroplets (Pipette) Sprayen, manuell oder automatisch Sublimation Mikro/nanospotting (ChIP 1000)

15 Techniken zur Aufgabe der Matrix Makrodroplets (Pipette) Sprayen, manuell oder automatisch Sublimation Mikro/nanospotting (ChIP 1000)

16 Techniken zur Aufgabe der Matrix Makrodroplets (Pipette) Sprayen, manuell oder automatisch Sublimation Mikro/nanospotting (ChIP 1000) matrix droplet: 87pl defined volume & pitch size Spray Nano spotting Dried droplet Courtesy of M. Marchetti-Deschmann, S. Fröhlich

17 Messabläufe Proteine, Peptide Extraktion des Gewebes Kl. Moleküle Endogene Moleküle ( zb Lipide) Exogene Lipide (zb Medikamente) Schneiden des Gewebes Extraktion des Gewebes Waschen mit org. LM Schneiden des Gewebes Trocknen im Vakuum Applikation der Matrix Applikation von Trypsin Applikation der Matrix Messung Messung

18 Messung von Amyloid beta Peptiden in Mäsuehirnschnitten Matrix: SA in 70:30 ACN/0.1% TFA und 500 fmol/µl insulin (interner Standard) Parietallappen Hinterhauptslappen Mech. Aging and Develop 126 (2005) 177

19 Proteine nach enzymatischen Verdau Molecular Scanner Approach Kombination von Elektroblotting mit Enzymverdau an trypsinhältiger Membran Applikation von Trypsinlösung vor Aufgabe der Matrix

20 Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI TOF FFPE

21 Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie

22 Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie IMS erlaubt das Auftrennen von Isobaren nach Substanzklassen sowie Konformeren Funktionsweise

23 Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie IMS erlaubt das Auftrennen von Isobaren nach Substanzklassen sowie Konformeren

24 Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS Driftscope

25 Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS m/z m/z Drift time

26 Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS Rattenhirn (FFPE) Gefriergetrocknetes menschliches Kleinhirn

27 Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS

28 Verteilung von Phosphatidylcholinen in Mäusehirn Kein Waschschritt => Bildung von Na +, K + Addukten Matrix: DHB, 20 mm Kaliumazetat 70% MeOH J. Lipid Research 50 (2009) 1776

29 Verteilung von Phosphatidylcholinen (PCs) in Mäusehirn Lokalisierung der unterschiedlichen PCs korreliert mit definierten Bereichen unterschiedlicher Funktion J. Lipid Research 50 (2009) 1776

30 Imaging mit TOF-SIMS Ursprüngliche Hauptanwendungsgebiete: Halbleiterindustrie, Mikrolelektronik,.. Energetische Primärionen schlagen über Stosskaskade Material (Neutrale Moleküle, Cluster als auch Molekülionen) aus < 1 nm Probentiefe J. Phys. Chem. B, Vol. 104, No. 29, 2000

31 Imaging mit TOF-SIMS Emission von größeren, intakten Molekülen benötigt kollektive Bewegung der Probe (in MALDI der Matrix, in DESI der Flüssigkeit) Durch den Einschlag eines Primärions wird dieser Bereich geschädigt damage cross-section, bei Ionen/cm 2 ist ~ 1% der Oberfläche betroffen => stationäre SIMS (bei Verwendung von einatomigen Primärionen) Neuerdings: Clusterionenquellen (Au n, Bi n ) oder polyatomige Primärionen (SF 5/6 ), kürzlich auch C 60 Geringere Beeinflussung unterer Schichten

32 Beispiel: Beobachtung der Verschmelzung von Membranen von Tetrahymena (Protozoon) Durch die hohe räumliche Auflösung (hier 200 nm) erlaubte SIMS imaging erstmals diesen Prozess beobachten zu können SEM Lichtmikroskop Linescan 50 µm 50 µm m/z 69 (C 5 H 9+ ) m/z µm Science 305(2004)71

33 Beispiel: Beobachtung der Verschmelzung von Membranen von Tetrahymena (Protozoon) Repr. Spektrum aus Verbindungsbereich Repr. Spektrum aus Körper

34 3-dimesionales Imaging mittels TOF-SIMS einer unreifen Eizelle (Xenopus laevis Oozyte) Die Verwendung von C 60 + Primärionen erlaubt schonendes Erodieren Xenopus laevis als Modellsystem (d.: mm), hier Untersuchung der ersten 75 µm Trend zur kombinierten Verwednung von C 60 + (nur zum Erodieren), und LMIG (liquid metal ion guns, zb Bi 3+ ) zum imagen Current Opinion in Chemcial Biology 15 (2011) 733

35 Prinzip von Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry kann bei Normaldruck betrieben werden Je nach Analyt Wahl des LM Systems (MeOH:H 2 O, ACN:H 2 O) Einsatz: Lipidanalyse, Screening

36 Beispiel: Aufnahme von latenten Fingerabdrücken A Fingerabdruck von Kokain C normaler Fingerabdruck Die Autoren behaupten so auch überlagernde Fingerabdrücke noch lesen zu könnnen da man sich auf unterschiedliche m/z Werte konzentrieren kann. Science 2008 (321) 805

37 Zusammenfassung MALDI SIMS DESI Druck Vakuum Vakuum Atmospährendruck Massenbereich < 40 kda < 1 kda < 5 kda Probenvorbereitung hoch mittel gering Ortsauflösung ~10-20 µm Sub-µm bis 50 nm ~200 µm Aufwendige, teure Gerätetechnik welche ortsaufgelöst die chemische Zusammensetzung einer biologischen Probe ermitteln kann Es können je nach gerätetechnischem Aufwand fast beliebig viele Moleküle identifiziert werden -> Qualitative Information Derzeit ist es jedoch noch schwer verläßliche quantitative Information zu erhalten Aus Daten muss Information und dann noch Wissen gewonnen werden Wichtige zukunftsweisende Techniken in der modernen (bio)chemischen und medizinischen Forschung Sehr dynamische Entwicklungen neuer Messgeräte