Universität des Saarlandes Medizinische Fakultät Homburg Wer bin ich, und wenn ja, wie viele? Fortschritte in der bakteriologischen Diagnostik M. Herrmann Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Universität des Saarlandes Unter Verwendung von Materialien von L. von Müller
Dr. Mayer s wishlist Zusammenfassung Ich wünsche mir Eine möglichst schnelle Befunderstellung Einen Kommentar zum Ergebnis mit Bezug zum klinischen Zusammenhang Bedeutet eine Mitteilung an den Mikrobiologen über den klinischen Zusammenhang bei der Befundanforderung! Eine Beratung zum Vorgehen (Medikation, Isolation, Epidemiebegrenzung) in schwierigen Situationen Eine möglichst schnellen Transfer von mikrobiologischen Neuerungen in die klinische Routine Mein Wünsch Dir was ist ein Plädoyer für eine klinische Mikrobiologie/Infektiologie 2
Bakteriologische Analytik klassische Verfahren Patient mit Infektionsverdacht Entnahme von Probenmaterial 1 Stunde Befund, Versand 1-18 Stunden Empfindlichkeitsprüfun 18 Stunden g Therapie beendet Patient entlassen Patient verstorben Arztbrief Kalkulierte Therapie (immer Omnispektrum ) Mikrobiologische Diagnose nach 5-6 Tagen Keine Therapieanpassung Ausfüllen Begleitschein 30 Minuten Versand 10 Minuten 18 Stunden Manuelle Probenanlage 1-4 Stunden Erreger-Identifizierung (klassischmikrobiologische und biochemische Verfahren) 10 min- 18 Stunden evtl. Erreger-Isolierung Vermehrung 18 Stunden Übernacht Bebrütung 12-18 Stunden 3
Befundbewertung, Validierung, online Befundübermittlung kumulativer Befund 30 Minuten Empfindlichkeits prüfung (rapid system) 6-9 Stunden Integrierte Mikrobiologische Diagnostik - essentiell zur Bekämpfung von Infektionen und Multiresistenz - Gezielte Therapie (häufig Schmalspektrum) gem. Erreger und Resistenz Erreger-Identifizierung (MALDI-TOF) Patient mit Infektionsverdacht Kalkulierte Therapie (häufig Breitspektrum) sofort! Entnahme relevanten Probenmaterials (Gewebe, Aspirate, hochresorbierende Tupfer) < 1 Stunde Mikrobiologische Diagnose + resistenzadaptierte Therapie = < 24 Stunden! Übernacht Kultur online order entry (OOE) 5 Minuten Schneller Transport (z.b. Rohrpost) 10 Minuten Automatisierte Probenanlage 10 Minuten < 1 Stunde 12-18 Stunden 4
geflockte Tupfer vermitteln deutlich größere Probeaufnahme konventionell eswab 5
eswab Wiederfindungsraten 6
Verbindung mit automatisierter Probenverarbeitung 7
Universitätsklinikum des Saarlandes Universität Institut des für Saarlandes Medizinische Mikrobiologie Medizinische Fakultät Homburg Sensitivität WASP / manueller Ausstrich WASP manuell 30µl Inokulum
MALDI-TOF eine Revolution in der diagnostischen Mikrobiologie 9
MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight Prinzip: Probe (Analyt) wird auf Träger immobilisiert und in organische Matrix eingebettet Durch Laserbeschuss (UV) verdampft Matrix explosionsartig Analytmoleküle werden mitgerissen Ionisierung des Analyten Beschleunigung der Analyten-Moleküle in elektrischem Feld Ionendetektor wandelt Moleküle in elektrisches Signal um Charakteristisches Spektrum abhängig von Analyten-Komposition Bei Bakterien: Hauptsächlich ribosomale Proteine bestimmen TOF Spektrum Typisches Spektrum für unterschiedliche Spezies 10
Klinische Anwendung - PubMed Juli 2011 11
MALDI-TOF Direktnachweis aus Blutkultur 12
Schnelle Empfindlichkeitsprüfung, z.b. Vitek2 13
einschliesslich Multiresistenzen, z.b. ESBL 14
dennoch: Mikrobiologie wird nie ein Automaten -Fach Komplexe bakterielle Genetik Punktmutationen (SNPs) Gencluster komplexe Expressionsmechanismen irnas Hohe Adaptivität (siehe EHEC) Unerklärte Fitnessfaktoren (siehe weltweite klonale Ausbreitung) Komplexe Resistenzmechanismen 15
z.b. Carbapenem-Resistenz bei Enterobakterien 16
K. pneumoniae VIM-1 + SHV-5 Pip Tic Amx Tz G K Fox Ctx Amc Caz Cs Amk Tb Net Cf Atm Fep Tcc Sul Tmp Fos Ma Mox Imp Cip Ofx Pi MIC : imipenem 32 mg/l ; gentamicin 8 mg/l Courtesy: N. Kassis-Chikhani 17
K.pneumoniae IMP-R in Griechenland! A. Vatopoulos, eurosurveillance, 2008 18
neue superbugs?? 19
MALDI-TOF als epidemiologisches Tool KPC K. pneumoniae Ausbruch UKS 2011 20
kommentierter Einzelbefund 21
online Kumulativbefund 22
online Antibiogrammprofil 23
und Labordokumentation sämtlicher Diagnostik- und Therapieempfehlungen! 24
4 aktuelle Beispiele zur Epidemiologie, Diagnostik, Virulenz.. MRSAar-Netz APS - das Saarländische Prävalenz-Screening Clostridium difficile - 027, der hypervirulente Stamm: Wie ging die Entwicklung weiter? Endokarditis - Spurensicherung einer früheren Infektion aus Herzklappenmaterial EHEC O104, H4 - Was macht ihn so virulent? => einen schnellen Transfer von mikrobiologischen Neuerungen in die Klinik 25
1. MRSAar Aufnahme-Prävalenz- Screening - Resultate 20.027 admission patients 83,6 % participation rate, 2,6% refusal upon informed consent 436 tests positive for MRSA 423 nasal/throat only 13 isolated wound only 13 combined wound and nasal/throat = 2.18 MRSA patients / 100 admissions 26
120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Durch Screenen von knapp 1/3 der Aufnahmepatienten 100,0% 61,0% 65,4% 66,0% 66,1% 66,7% 67,2% 50,8% 31,9% 21,7% 13,5% 14,0% 15,2% 18,5% 2,5% 6,4% 27 Hautulcus Chronische Dialysepflichtigkeit Seniorenheim Liegender Katheter Kontakt MRSA Diabetes Melitus Krankenhausaufenthalt > 6 Antibiotikatherapie Krankenhausaufenthalt > 12 Verlegung Krankenhaus Brandverletzungen Kontakt Nutztiere Kontakt Fleisch Nicht erfassbar MRSA Anamnese
120,00% 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 17,97% erfassen wir fast 70% unserer MRSA-Patienten BEI AUFNAHME! 100,00% 80,21% 86,20% 89,06% 89,32% 89,32% 89,58% 89,58% 55,47% 59,11% 62,24% 69,01% 51,30% 52,34% 30,99% 28 Chronische Dialysepflichtigkeit Seniorenheim Liegender Katheter Kontakt MRSA Diabetes Melitus Krankenhausaufenthalt > 6 Antibiotikatherapie Krankenhausaufenthalt > 12 Verlegung Krankenhaus Brandverletzungen Kontakt Nutztiere Kontakt Fleisch Nicht erfassbar Hautulcus MRSA Anamnese
MRSA Screening Kosteneffizient Verhindert unerkannte Weiterverbreitung Voraussetzung für Sektor-übergreifende Dekolonisationsstrategien Schutz des Patienten vor eigener Infektion (Wahrscheinlich) reduzierte MRSA-Morbidität und Mortalität MRSAar Netz Prävalenz-Screening: Kosten ~90.000 Seither: Deutliche Steigerung der Sensibilität von Krankenhaus-Administratoren, Ärztlichen Direktoren, Dachgesellschaften, Politikern, Öffentlichkeit 29
2. Clostridium difficile Diagnostik 30
slpa-sequence typing (slpast) RT1 (27%) RT027 (52%) Surface-layer protein A von C. difficile RT78 (4%) smz (3%) RT66 (5%) Sleytr and Beveridge Trends Microbiol 1999 31
Untersuchung GLDH+ / Toxin- Proben PCR (Stuhl) Toxin Gene Kultur Toxin Kultur 6 (9.8%) neg. 3 (50%) neg. 3 (50%) pos. negativ 55 (90.2%) pos. 8 (14.5%) neg. 47 (85.5%) pos. 3 (37.5%) neg. 5 (62.5%) pos. 16 (34%) neg. 31 (66%) pos. 4 (80%) neg. 1 (20%) pos. 6 (19.4%) neg. 25 (80.6%) pos. => Toxintest allein ist wenig sensitiv! 32
Epidemiologie von C. difficile (UKS) 30 Culture positive patients (n) 25 20 15 10 5 0 001 027 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2008 2009 2010 Time (Month/Year) 027 001 002 010 017 078 smz 012/046/092 014/066 031/094 others 33
Zusammenfassung Clostridium difficile Was wünsche ich mir: Eine schnelle Befunderstellung sensitiver (2 Stunden) und spezifischer Nachweis (1-3 Tage) mit einer 2-Stufen Diagnostik möglich Toxin Antigen Test wenig sensitiv Die PCR als eine schnelle (<24 h), sensitive Methode zur Klärung diskrepanter Fälle Die CDI ist primär eine klinische Diagnose, die frühzeitig therapiert werden muss Eine Therapieverzögerung bei verzögerter Labordiagnostik ist nicht gerechtfertigt Möglichkeit der Beratung durch das KL 34
3. Was bringt uns eigentlich die PCR? Erregernachweis in Herzklappen Goldstandard Kultur Nachweis typischer Endokarditis Erreger ABER: Kultur Bias für - Anspruchsvolle Erreger (z.b. HACEK) - Nicht anzüchtbare Erreger (z.b. T. whipplei) - Antibiotisch vorbehandelte Patienten - Kontaminationsgefahr (z.b. Hautkeime) => zusätzlicher Kultur unabhängiger Erregernachweis 16S rdna PCR und Sequenzierung 35
Bakterien Nachweis in Herzklappen Kultur vs. 16S rdna PCR 30 25 20 15 10 5 0 36 Culture and 16S rdna PCR positive samples (no.) Kultur+ PCR+ 30 25 20 15 10 5 0 CoNS Corynebacteria Micrococcus Neisseria Others Tropheryma whipplei Haemophilus Enterococci S. aureus Streptococci 16S rdna PCR positive samples (no.) Kultur- PCR+ weniger typische Erreger sehr typische Erreger
Bakterien Nachweis in Herzklappen PCR negativ und Kultur positiv 80 75 70 30 25 20 15 10 5 0 37 CoNS Corynebacteria Micrococcus Neisseria Others Tropheryma whipplei Haemophilus Enterococci S. aureus Streptococci Culture positive samples (no.) weniger typische Erreger Kontaminanten? sehr typische Erreger
4. EHEC O104,H4 ( essen Frauen >30 Jahre lieber Sprossen?? ) Alters- und geschlechtsspezifische Inzidenz 1,0 0,9 Fälle pro 100.000 Einwohner 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 männlich weiblich 0,0 0-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70 + Altersgruppe 38
Wie waren wir auf die Diagnostik dieses Stamms (HUSEC041, O104H4) vorbereitet? O104H4 Patient E.coli wt Wasser flich4 O104 terd stx2 stx2 terd O104 flich4 Lancet 2011 UKS 2011 39
Was macht den Erreger pathogen? STEC Toxin plus EAEC Adhäsine = EHEC (HUSEC041) EHEC Merkmale: Shiga-Toxin 1 (stx1): neg Shiga-Toxin 2 (stx2a): pos Intimin (eae): negativ Enterohämolysin: negativ EAEC/HUSEC041 Kontrollstamm EAggEC Merkmale (EAggEC Virulenzplasmid): aata-pcr: positiv (ABC-transporter protein gene) aggr-pcr: positiv (master regulator gene of virulenceplasmid genes) aap-pc: positiv (secreted protein dispersin gene) agga-pcr: positiv (AAF/I-fimbral subunit-gene) aggc-pcr: positiv (AAF/I-fimbral operon-gene) asta-pcr: negativ (enteroaggr. E. coli heat-stable enterotoxin (EAST-1) gene ) 40
Zusammenfassung HUSEC041 Nach Erkennung der Ausbruchssituation Diagnostik von EHEC durch PCR Schnelle Resistenzbestimmung Schnelle und sichere Diagnostik von HUSEC041 durch Spezies-spezifische PCR Whole-genome-Sequenzierung ermöglicht Identifizierung von neuen Pathogenitätsinseln bzw. Virulenzfaktor-Kombinationen Transmissionsmechanismen (Ausbruchsquelle, Wirt) Bisher ungelöst EHEC-Nachweis ausserhalb des Warmblüters Therapieoptionen 41