RIDA GENE Parasitic Stool Panel II PG1725

RIDA GENE Parasitic Stool Panel II PG1725 RBiopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, 64297 Darmstadt, Deutschland Tel.: +49 (0) 61 51 81 020 / Fax: +49 (0) 61 51 81 0220

1. Zweckbestimmung Für die invitro Diagnostik. RIDA GENE Parasitic Stool Panel II ist eine multiplex realtime PCR zum direkten qualitativen Nachweis und zur Differenzierung von Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica in humanen Stuhlproben. Die RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR soll die Diagnose einer durch Parasiten verursachten gastrointestinalen Infektion unterstützen. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica gehören zu den wichtigsten Diarrhoe verursachenden Protozoen. Giardia lamblia (auch G. intestinalis oder G. duodenales genannt) ist einer der häufigsten nichtviralen Erreger von Durchfallerkrankungen. Laut CDC (Center for Disease Control) sind ca. 2 % aller Erwachsenen und 6 8 % der Kinder in Industrieländern sowie ca. ein Drittel aller Menschen in Entwicklungsländern mit G. lamblia infiziert. 1 Das CDC schätzt, dass jedes Jahr in den USA ca. 77.000 Fälle von Giardiasis (Lambliasis) auftreten. 2 Die Infektion erfolgt nach Aufnahme von Zysten aus kontaminiertem Trinkwasser, kontaminierten Lebensmitteln oder auf fäkaloralem Weg von Person zu Person. Die Inkubationszeit beträgt 1 bis 3 Wochen. Die Giardiasis (Lambliasis) tritt als akute oder chronische Diarrhoe auf, wobei auch asymptomatische Zystenausscheider vorkommen. Symptome einer akuten Infektion sind plötzliches Auftreten einer wässrigen Diarrhoe, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Unterleibschmerzen und Gewichtsverlust. 1 Cryptosporidium parvum ist eine von mehreren Arten der Gattung Cryptosporidium. Neben C. parvum zählt C. hominis zu den häufigsten Verursachern einer Cryptosporidiose beim Menschen. 6 Aber auch Infektionen durch weitere Cryptosporidium spp. wie z.b. C. felis, C. meleagridis, C. canis, und C. muris können zu klinischen Symptomen führen. 3 In den Industriestaaten wurden Cryptosporidien in bis zu 0,2 % bei gesunden Individuen und in etwa 2 % der Patienten mit Durchfällen nachgewiesen. In Entwicklungsländern liegt die Prävalenz mit bis zu 9 % sehr viel höher. Bei HIV infizierten Personen mit Durchfällen wurden bei 14 24 % der Fälle Cryptosporidien nachgewiesen, bei asymptomatischen HIV infizierten Personen in bis zu 5 %. 4,5 Bei einem Ausbruch in Milwaukee (USA) im Jahr 1993 erkrankten mehr als 400.000 Menschen. 6 Jedes Jahr treten in den USA schätzungsweise 748.000 Fälle von Cryptosporidiose auf. 7 Die Infektion erfolgt überwiegend durch die Aufnahme der Oozysten durch kontaminiertes Wasser und Lebensmittel, aber auch fäkalorale Schmierinfektionen von Mensch zu Mensch sind möglich. Bei immunkompetenten Menschen manifestiert sich die Cryptosporidiose nach 2 10 Tagen als wässriger Durchfall und kann von Übelkeit, Unterleibsschmerzen und Gewichtsverlust begleitet werden. Bei immunsupprimierten Menschen tritt 2 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

oftmals ein schwerer Krankheitsverlauf auf, der mit einer lebensbedrohlichen chronischen Diarrhoe verbunden ist. 2,6 Entamoeba histolytica ist die einzige humanpathogene Spezies in der Gattung Entamoeba und Erreger der Amöbiasis. Die Infektion erfolgt fäkaloral durch die Aufnahme der Zysten durch kontaminiertes Wasser und Lebensmittel, aber auch von Mensch zu Mensch. Während die meisten E. histolytica Infektionen asymptomatisch verlaufen, kommt es in ca. 10 % der Fälle zu einer Amöbenkolitis und in seltenen Fällen zu einer extraintestinalen Amöbiasis, überwiegend in der Leber (Amöbenleberabszess). Die klinischen Symptome der intestinalen Amöbiasis sind Bauchschmerzen und starke Durchfälle mit blutigen und schleimigen Stühlen. Die WHO schätzt, dass weltweit etwa 50 Millionen Menschen jährlich an invasiver Amöbiose erkranken, wovon ca. 100.000 versterben. 2,8 Klassisch erfolgt die Diagnose von Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba spp. durch mikroskopische Untersuchung von Stuhlproben, wofür erfahrenes Personal zur Verfügung stehen muss. Die RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR ist eine neue und attraktive Alternativmethode zur Untersuchung von Stuhlproben und hat sich als hoch sensitiv und spezifisch für den gleichzeitigen Nachweis der drei wichtigsten Durchfall verursachenden Parasiten (Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica) erwiesen. 3. Testprinzip RIDA GENE Parasitic Stool Panel II ist eine multiplex realtime PCR zum direkten qualitativen Nachweis und zur Differenzierung von Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica in humanen Stuhlproben. Nach der DNAIsolierung werden (falls vorhanden) die spezifischen Genfragmente für Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica (ITS118S) amplifiziert. Die amplifizierten Zielsequenzen von Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica werden mit HydrolyseSonden, die an einem Ende mit dem Quencher und am anderen Ende mit einem ReporterFluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) markiert sind, nachgewiesen. In Gegenwart einer Zielsequenz hybridisieren die Sonden mit den Amplikons. Während der Extension trennt die TaqPolymerase den Reporter vom Quencher. Der Reporter emittiert ein Fluoreszenzsignal, das durch die optische Einheit eines realtime PCRGerätes detektiert wird. Das Fluoreszenzsignal steigt mit der Menge der gebildeten Amplikons an. Der RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test enthält eine Internal Control DNA (ICD), um die Probenpräparation und/oder eine potentielle PCRInhibition kontrollieren zu können. 4. Packungsinhalt Tab. 1: Packungsinhalt (Die Reagenzien einer Packung reichen für 100 Bestimmungen) RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 3

Kit Code Reagenz Menge Deckelfarbe 1 Reaction Mix 2x 1050 µl gelb 2 TaqPolymerase 1x 80 µl rot D Internal Control DNA 2x 1700 µl orange N No Template Control 1x 450 µl weiß P Positive Control 1x 200 µl blau 5. Reagenzien und ihre Lagerung Alle Reagenzien müssen lichtgeschützt bei 20 C gelagert werden und können bis zum aufgedruckten Verfallsdatum verwendet werden. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Vor dem Gebrauch sollten die Reagenzien schonend aufgetaut werden (z.b. im Kühlschrank bei 2 8 C). Ein wiederholtes Einfrieren/Auftauen bis zu 5 Mal beeinträchtigt die Testeigenschaft nicht (ggf. Aliquots nach dem ersten Auftauen herstellen und die Reagenzien sofort wieder einfrieren). Alle Reagenzien während der PCRVorbereitung geeignet kühlen (2 8 C). 4 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör Der RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test ist geeignet für die Verwendung mit folgenden Extraktionsplattformen und realtime PCRGeräten: Tab.2: Benötigtes Zubehör Extraktionsplattformen RBiopharm Promega Realtime PCRGeräte Roche Agilent Technologies RIDA Xtract Maxwell RSC LightCycler 480II, LightCycler 480 z Mx3005P Applied Biosystems ABI 7500 BioRad QIAGEN Hinweis: CFX96 RotorGene Q Bei Verwendung des RotorGene Q (QIAGEN) nur 0,1 ml Reaktionsgefäße verwenden. Sollten Sie weitere Extraktionsverfahren oder realtime PCRGeräte verwenden wollen, kontaktieren Sie bitte RBiopharm zur Überprüfung der Kompatibilität unter mdx@rbiopharm.de. RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) bei Verwendung des LightCycler 480II und des LightCycler 480 z Realtime PCRVerbrauchsmaterialien (Platten, Reaktionsgefäße, Folien) Zentrifuge mit Rotor für Reaktionsgefäße oder Platten Vortexer Pipetten (0,5 20 µl, 20 200 µl, 100 1000 µl) Pipettenspitzen mit Filtern Puderfreie Einmalhandschuhe PCRWasser (BioScienceGrade, Nukleasefreies, DEPCbehandeltes Wasser) 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die invitro Diagnostik. Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Während des Umgangs mit Reagenzien und Proben, persönliche Schutzausrüstung (geeignetes Handschuhmaterial, Kittel, Schutzbrille) tragen und nach Abschluss des RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 5

Tests die Hände waschen. In Bereichen, in denen mit Proben gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Eine räumliche Trennung von Extraktion, PCRAnsatz und PCR ist zu beachten, um Querkontaminationen zu vermeiden. Klinische Proben müssen als potentiell infektiös angesehen werden und müssen wie sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen, entsprechend entsorgt werden. Testkit nach Erreichen des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Alle Reagenzien und Materialien müssen nach Gebrauch sachgerecht und eigenverantwortlich entsorgt werden. Bitte beachten sie bei der Entsorgung die jeweils national geltenden Vorschriften. Weitere Details siehe Safety Data Sheets (SDS) unter www.rbiopharm.com. 8. Sammlung und Lagerung der Proben 8.1 DNAPräparation aus Stuhlproben Für die DNAPräparation aus Stuhlproben wird ein kommerziell erhältliches DNA Extraktionskit (z.b. RIDA Xtract (RBiopharm)) oder DNAExtraktionssystem (z.b. Maxwell RSC (Promega)) empfohlen. Die Angaben des Herstellers sind zu beachten. Es wird empfohlen die Stuhlproben vor der Extraktion 1:3 mit Wasser zu verdünnen, stark zu vortexen und 30 sec bei 1000 x g zu zentrifugieren. Aus dem Überstand das entsprechende Volumen nach Angaben des Herstellers verwenden. Der RIDA GENE Parasitic Stool Panel II Test enthält eine Internal Control DNA, die eine mögliche PCRInhibition anzeigt, die Integrität der Reagenzien überprüft und eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion bestätigt. Die Internal Control DNA kann entweder nur als Inhibitionskontrolle oder als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle verwendet werden. Wird die Internal Control DNA nur als Inhibitionskontrolle verwendet, muss 1 µl der ICD dem MasterMix hinzugefügt werden (s. Tab. 4). Wird die Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle verwendet, müssen 20 µl der Internal Control DNA während der Extraktion eingesetzt werden. Die Internal Control DNA soll dem Proben Lysispuffer Mix und nicht direkt dem Probenmaterial zugefügt werden. Wir empfehlen je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Negativkontrolle und der Positivkontrolle zu pipettieren. 6 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

9. Testdurchführung 9.1 Herstellung des MasterMix Die Gesamtzahl der für die PCR benötigten Reaktionen (Proben und Kontrollreaktionen) ist zu berechnen. Bei jedem Testlauf muss eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Es wird empfohlen den MasterMix mit 10 % zusätzlichem Volumen anzusetzen, um einen Pipettierverlust auszugleichen (s. Tab. 3, Tab. 4). Vor der Benutzung den Reaction Mix, die TaqPolymerase, die Positive Control, die No Template Control und die Internal Control DNA auftauen, durchmischen und kurz zentrifugieren. Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen (2 8 C). Tab. 3: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD als Extraktions und Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 1 Reaction Mix 19,3 µl 212,3 µl 2 TaqPolymerase 0,7 µl 7,7 µl Gesamt 20 µl 220 µl MasterMix mischen und anschließend kurz zentrifugieren. 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) Tab. 4: Beispiel für die Berechnung und Herstellung des MasterMix für 10 Reaktionen (ICD nur als Inhibitionskontrolle) Kit Code Komponenten des MasterMix Menge pro Reaktion 1 Reaction Mix 19,3 µl 212,3 µl 2 TaqPolymerase 0,7 µl 7,7 µl D Internal Control DNA 1,0 µl 11 µl Gesamt 21,0 µl 231,0 µl MasterMix mischen und anschließend kurz zentrifugieren. 10 Reaktionen (zusätzlich 10 %) RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 7

9.2 Herstellung des PCRMix Je 20 µl des MasterMix in die jeweiligen Reaktionsgefäße (Gefäße/Platten) pipettieren. Negativkontrolle: Je 5 µl No Template Control zum vorgelegten MasterMix pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Negativkontrolle zu pipettieren. Proben: Positivkontrolle: Je 5 µl DNAExtrakt zum vorgelegten MasterMix pipettieren. Je 5 µl Positive Control zum vorgelegten MasterMix pipettieren. Hinweis: Wir empfehlen bei Verwendung der Internal Control DNA als Extraktionskontrolle für die Probenpräparation und als Inhibitionskontrolle je 1 µl der Internal Control DNA zum PCRMix der Positivkontrolle zu pipettieren. Reaktionsgefäße bzw. Platte verschließen, mit wenigen Umdrehungen pro Minute kurz zentrifugieren und in das realtime PCRGerät überführen. Die PCR entsprechend der Geräteeinstellung starten (s. Tab. 5, Tab. 6, Tab. 7, Tab. 8). 8 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

9.3 Geräteeinstellungen 9.3.1 DNA realtime PCRProfil Tab. 5: DNA realtime PCRProfil für LightCycler Serie und RotorGene Q Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Tab. 6: DNA realtime PCRProfil für Mx3005P, ABI7500 und CFX96 Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 9

9.3.2 Universal realtime PCRProfil Hinweis: Das Universal realtime PCRProfil für DNA Tests sollte nur verwendet werden, wenn RIDA GENE DNA und RIDA GENE RNA realtime PCR Tests in einem Lauf kombiniert werden. Tab. 7: Universal realtime PCRProfil für LightCycler Serie Reverse Transkription 10 min, 58 C Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 10 sec, 95 C 15 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. Tab. 8: Universal realtime PCRProfil für Mx3005P, ABI7500, RotorGene Q und CFX96 Reverse Transkription 10 min, 58 C Initiale Denaturierung 1 min, 95 C Zyklen PCR Denaturierung Annealing/Extension Temperature Transition Rate / Ramp Rate 45 Zyklen 15 sec, 95 C 30 sec, 60 C Maximum Hinweis: Das Annealing und die Extension finden im selben Schritt statt. 10 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

9.4 Detektionskanaleinstellung Tab. 9: Auswahl der geeigneten Detektionskanäle Realtime PCRGerät Roche LightCycler 480II Nachweis Detektionskanal Giardia lamblia 465/510 ICD 533/580 Entamoeba histolytica 533/610 Cryptosporidium spp. 618/660 Bemerkung RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) wird benötigt Roche LightCycler 480 z Giardia lamblia 465/510 ICD 540/580 Entamoeba histolytica 540/610 Cryptosporidium spp. 610/670 RIDA GENE Color Compensation Kit IV (PG0004) wird benötigt ABI 7500 Giardia lamblia ICD Entamoeba histolytica Cryptosporidium spp. FAM VIC ROX Cy5 Stellen Sie den passiven Referenzfarbstoff ROX auf none Agilent Techn. Mx3005P Giardia lamblia ICD Entamoeba histolytica FAM HEX ROX Stellen Sie den Referenzfarbstoff auf none Cryptosporidium spp. Cy5 Qiagen Rotor Gene Q Giardia lamblia Green Die Gain ICD Yellow Einstellungen müssen für alle Entamoeba histolytica Orange Kanäle auf 5 (Werkseinstellung) Cryptosporidium spp. Red eingestellt sein Giardia lamblia FAM BioRad CFX96 ICD Entamoeba histolytica VIC ROX Cryptosporidium spp. Cy5 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 11

10. Qualitätskontrolle Die Auswertung der Proben erfolgt über die AnalyseSoftware des jeweiligen realtime PCRGerätes nach den Angaben des Herstellers. Negativkontrolle und Positivkontrolle müssen die korrekten Ergebnisse zeigen (s. Tab. 10, Abb. 1, Abb. 2, Abb. 3). Die Positive Control liegt für Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica in einer Konzentration von 10 3 Kopien/µl vor. Sie wird in einer Gesamtmenge von 5 x 10 3 Kopien in jedem PCRLauf eingesetzt. Tab. 10: Ein valider PCRLauf muss die folgenden Bedingungen erfüllen Probe Ergebnis ICD Ct Zielgen Ct Positivkontrolle Positiv NA * 1 Siehe Quality Assurance Certificate Negativkontrolle Negativ Ct > 20 0 * 1 Ein CtWert für die ICD ist nicht erforderlich um ein positives Ergebnis der Positivkontrolle zu erhalten Wenn die Positivkontrolle in dem angegebenen CtBereich nicht positiv ist, die Negativkontrolle jedoch valide ist, müssen alle Reaktionen inklusive der Kontrollen neu angesetzt werden. Wenn die Negativkontrolle nicht negativ ist, die Positivkontrolle jedoch valide ist, müssen alle Reaktionen inklusive der Kontrollen neu angesetzt werden. Sollten die vorgegebenen Werte nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung Folgendes zu überprüfen: Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte Korrekte Testdurchführung 12 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

Abb. 1: Korrekter Verlauf der Positivkontrolle und Negativkontrolle (Giardia lamblia) auf dem LightCycler 480II Abb. 2: Korrekter Verlauf der Positivkontrolle und Negativkontrolle (Cryptosporidum spp.) auf dem LightCycler 480II RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 13

Abb. 3: Korrekter Verlauf der Positivkontrolle und Negativkontrolle (Entamoeba histolytica) auf dem LightCycler 480II 14 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

11. Interpretation der Ergebnisse Die Probenauswertung der Ergebnisse erfolgt nach Tabelle 11. Tab. 11: Interpretation der Ergebnisse G. lamblia Zielgene E. histolytica Crypto. spp. ICD Ergebnis positiv negativ negativ positiv/negativ G. lamblia nachweisbar negativ positiv negativ positiv/negativ negativ negativ positiv positiv/negativ positiv positiv negativ positiv/negativ positiv negativ positiv positiv/negativ negativ positiv positiv positiv/negativ positiv positiv positiv positiv/negativ negativ negativ negativ positiv E. histolytica nachweisbar Crypto. spp. nachweisbar G. lamblia und E. histolytica nachweisbar G. lamblia und Crypto. spp. nachweisbar E. histolytica und Crypto. spp. nachweisbar G. lamblia, E. histolytica und Crypto. spp. nachweisbar Zielgene nicht nachweisbar negativ negativ negativ negativ Ungültig Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica sind nachweisbar, wenn die ProbenDNA eine Amplifikation zeigt und eine Amplifikation für die Internal Control DNA im Nachweissystem zu sehen ist. Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica sind ebenfalls nachweisbar, wenn die ProbenDNA eine Amplifikation, jedoch keine Amplifikation für die Internal Control DNA im Nachweissystem zeigt. Der Nachweis der Internal Control DNA ist in diesem Fall nicht notwendig, da hohe Konzentrationen des Amplikons zu einem schwachen oder fehlenden Signal der Internal Control DNA führen können. Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica sind nicht nachweisbar, wenn die ProbenDNA keine Amplifikation, aber die RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 15

Internal Control DNA eine Amplifikation im Nachweissystem zeigt. Eine Inhibierung der PCRReaktion kann durch die Detektion der Internal Control DNA ausgeschlossen werden. Eine Probe ist ungültig, wenn die ProbenDNA für Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica und die Internal Control DNA keine Amplifikation im Nachweissystem zeigt. In der Probe sind PCRInhibitoren vorhanden bzw. es trat ein Fehler im Extraktionsverfahren auf. Die extrahierte Probe sollte 1:10 mit PCRWasser verdünnt und erneut amplifiziert werden oder es sollte die Isolierung und Reinigung der Probe verbessert werden. 12. Grenzen der Methode 1. Das Ergebnis der molekularbiologischen Untersuchung sollte nicht allein zur Diagnose führen, sondern immer im Zusammenhang mit der Anamnese und Symptomatik des Patienten betrachtet werden. 2. Dieser Test ist nur für Stuhlproben validiert. 3. Unsachgemäße Probenentnahme, transport, lagerung und handhabung oder eine Erregerlast unterhalb der analytischen Sensitivität des Tests können zu falsch negativen Ergebnissen führen. 4. Die Anwesenheit von PCRInhibitoren kann zu nicht auswertbaren Ergebnissen führen. 5. Mutationen oder Polymorphismen in den Primer oder Sondenbindungsregionen können den Nachweis neuer oder unbekannter Varianten beeinträchtigen und mit RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test zu falsch negativen Ergebnissen führen. 6. Wie bei allen auf PCR basierenden invitro diagnostischen Tests können äußerst niedrige Konzentrationen der Zielsequenzen, die unter dem Detektionslimit (LoD) liegen, nachgewiesen werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind nicht immer reproduzierbar. 7. Ein positives Testergebnis zeigt nicht notwendigerweise die Anwesenheit lebensfähiger Organismen an. Ein positives Ergebnis deutet darauf hin, dass die Zielgene (ITS118S) vorhanden sind. 16 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

13. Leistungsmerkmale 13.1 Analytische Sensitivität Der RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test hat eine Nachweisgrenze von 10 DNAKopien/Reaktion für Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica. Die folgenden Abbildungen 4, 5 und 6 zeigen Verdünnungsreihen von Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica (jeweils 10 5 10 1 DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II. Abb. 4: Verdünnungsreihe Giardia lamblia (10 5 10 1 DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 17

Abb. 5: Verdünnungsreihe Cryptosporidium spp.(10 5 10 1 DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II Abb. 6: Verdünnungsreihe Entamoeba histolytica (10 5 10 1 DNA Kopien/µl) auf dem LightCycler 480II Die Nachweisgrenze des Gesamtverfahrens ist abhängig von der Probenmatrix, der DNAExtraktion und dem DNAGehalt. 18 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

13.2 Analytische Spezifität Der RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test ist spezifisch für Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica. Es wurden keine Kreuzreaktivitäten zu den folgenden Spezies festgestellt (s. Tab. 12): Tab. 12: Kreuzreaktivitätstestung Adenovirus 40, human, strain Dugan Adenovirus 41, human, strain Tak Astrovirus Citrobacter freundii Clostridium bifermentans Clostridium difficile Bacillus cereus Clostridium novyi Bacteroides fragilis Campylobacter coli Campylobacter fetus subsp. fetus Campylobacter jejuni Campylobacter lari subsp. lari Campylobacter upsaliensis Clostridium perfringens Clostridium septicum Clostridium sporogenes Clostridium sordellii Coxsackievirus B4 Cryptosporidium parvum E. coli (O26:H) Pseudomonas aeruginosa E. coli (O6) Rotavirus Echovirus Type 11 Entamoeba dispar Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterovirus Type 71 Klebsiella oxytoca Norovirus GGI Norovirus GGII Candida albicans E. coli (O157:H7) Proteus vulgaris Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium Serratia liquefaciens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Trichomonas vaginalis Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 19

13.3 Analytische Reaktivität Die Reaktivität des RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Tests wurde mit Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica untersucht (s. Tab. 13). Die getesteten Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. und Entamoeba histolytica Stämme wurden mit dem RIDA GENE Parasitic Stool Panel II multiplex realtime PCR Test und mittels Sequenzabgleich nachgewiesen. Tab. 13 Analytische Reaktivitätstestung Giardia lamblia + E. histolytica + Giardia lamblia G. intestinales Portland 1 + Entamoeba histolytica Cryptosporidium spp. G. intestinales WB Clone 6 C. baileyi + C. hominis + C. sp skunk + C. bovis + C. muris + C. ubiquitum + C. canis + C. parvum + C. viatorum + C. cuniculus + C. sp horse + C. xiaoi + C. felis + + 20 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

14. Versionsübersicht Versionsnummer Kapitel und Bezeichnung 20140811 Freigabeversion 20180409 Generelle Überarbeitung 20180409 4. Packungsinhalt 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 9. Testdurchführung 13. Leistungsmerkmale 14. Versionsübersicht 15. Symbolerklärung 15. Symbolerklärung Allgemeine Symbole InvitroDiagnostikum Gebrauchsanweisung beachten Chargennummer verwendbar bis Lagertemperatur Artikelnummer Anzahl Tests Herstelldatum Hersteller Testspezifische Symbole Nicht zutreffend RIDA GENE Parasitic Stool Panel II 20180409 21

16. Literatur 1. Centers for Disease Control and Prevention 2011. Giardia Epidemiology & Risk Factors, http://www.cdc.gov/parasites/giardia/epi.html. Aufgerufen am 10.07.2012. 2. Food and Drug Administration (FDA) 2011. Bad Bug Book 2nd Edition. http://www.fda.gov/food/foodsafety/foodborneillness/foodborneillnessfoodbornepa thogensnaturaltoxins/badbugbook/default.htm. Aufgerufen am 10.07.2012. 3. Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/parasites/crypto/biology.html. Aufgerufen am 07.03.2014. 4. Robert Koch Institut 2010. Kryptosporidiose (Cryptosporidium parvum). RKI Ratgeber für Ärzte 2004. Aufgerufen am 24.07.2012. 5. LEE JK, SONG HJ und JaeRan YU JR. Prevalence of diarrhea caused by Cryptosporidium parvum in nonhiv patients in Jeollanamdo, Korea. Korean J Parasitol. 2005, 43(3):111114. 6. Leitch GJ und Qing He. Cryptosporidosis an overview. J Biomed Res. 2012, 25(1): 116. 7. Scallan E et al. Foodborne Illness Acquired in the United States Major Pathogens. Emerg Infect Dis. 2011, 17(1): 715. 8. Fotedar R et al. Laboratory diagnostic techniques for Entamoeba species. Clin Microbiol Rev. 2007, 20(3):511532. 22 20180409 RIDA GENE Parasitic Stool Panel II

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