Proteine II Chromatographie und Dialyse Dr. Sandra Scheiblhofer
Isolierung von Proteinen > 30.000 Proteine im menschlichen Organismus, beträchtlicher Teil davon nicht oder nur über die biologische Aktivität definiert Zur vollständigen Charakterisierung einige mg gereinigtes Protein benötigt Eigenschaften wie Größe, Löslichkeit, Ladung und spezifische Bindungsaktivität zur Reinigung eines Proteins in seiner aktiven Form benutzt Dialyse: Trennung der Proteine von kleineren Molekülen Gelchromatographie: Genauere Trennung aufgrund der Größe Löslichkeit verschiedener Proteine unterscheidet sich in ihrer Abhängigkeit von der Salzkonzentration, daher können sie durch Aussalzen fraktioniert werden. Die Ionenaustauschchromatographie trennt Proteine nach ihrer Nettoladung. Die Affinitätschromatographie nutzt die Affinität von Proteinen zu bestimmten chemischen Gruppen.
Löslichkeit Bei den wichtigsten Reinigungstechniken müssen die Analyten in gelöster Form vorliegen. Intrazelluläre, im Cytosol lokalisierte Proteine (zb Enzyme): gut löslich Proteine mit strukturbildender Funktion (zb Membranproteine): meist deutlich schlechter löslich Besonders schlecht löslich sind die sehr hydrophoben integralen Membranproteine, deren natürliche Umgebung Lipidmembranen sind und die ohne Lösungsvermittler (Detergenzien) aggregieren und ausgefällt werden. Verfügbarkeit Einige wenige Kopien pro Zelle: Transkriptionsfaktoren Einige Tausend Kopien pro Zelle: Rezeptoren Einige Prozent des Gesamtproteins einer Zelle: häufige Proteine, Enzyme > 50% des Gesamtproteins einer Zelle: überexprimierte Proteine > 90%: Albumin in Blutplasma
Dialyse Bei der Proteinreinigung entstehen oft Lösungen, die in ihrer Ionenstärke oder Pufferzusammensetzung für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet sind, daher Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen nötig Die am längsten bekannte Entsalzungsmethode ist die Dialyse. Das Prinzip beruht auf einer semipermeablen Membran: lässt kleine Moleküle und Ionen frei diffundieren, hält grössere Moleküle zurück Cellulosemembranen haben unterschiedliche Porengröße (Ausschlussgröße oder Cutoff-Wert). Ausschlusswert = Molekulargewicht der Proteine, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden. Stryer: Biochemie
Dialyse Proteinlösung luftfrei in Schlauch aus Dialysemembran gefüllt, mit Klammern verschlossen, von Puffer umgeben; Schlauch aus regenerierter Cellulose hergestellt, enthält Schwermetalle in destilliertem Wasser auskochen und spülen. Schlauch zu maximal zwei Dritteln befüllt, Volumszunahme durch Wassereinwanderung während der Dialyse Diffusionsrate durch die Membran wird durch den Konzentrationsgradienten der diffundierbaren Teilchen, die Membranoberfläche, und die Temperatur bestimmt. Stryer: Biochemie
Dialyse Puffer wird gerührt und einige Male gewechselt, für möglichst großen Konzentrationsgradienten an der Membranoberfläche Zur Stabilisierung von Proteinen Dialyse bei 4 C Fortschritt der Entsalzung mittels Leitfähigkeitsmessung des Puffers überprüft. Bei weitgehender Entsalzung (Dialyse gegen Wasser): wegen der niederen Ionenstärke können Proteine teilweise ausfallen. Mit Dialyseschlauch auch Konzentration von Proben möglich, nicht von Puffer, sondern von hygroskopischem Material (zb Sephadex G100) umgeben, das durch die Membran Flüssigkeit und kleine Moleküle saugt. H 2 PO 4 - Na +
Ultrafiltration Für schnelle Konzentration von Proteinlösungen asymmetrische Membranen aus Cellulose oder PVDF (Polyvinylidenflourid) mit verschieden grossen Poren an Unter- und Oberseite Ultrafiltration wird nicht durch Konzentrationsgradienten getrieben, sondern durch Flussrate des Lösungsmittels durch die Membran. Dabei werden die Salze (Molekulargewicht <<<< Ausschlussgrenze) gemeinsam mit dem Wasser durch die Membran gepresst. Dazu Überdruck, Vakuum oder Zentrifugation verwendet. Probenvolumen ohne signifikante Änderung der Salzkonzentration verringert.
Chromatographie Trennmethode, bei der eine gelöste Substanzmischung mit Hilfe eines Gasoder Flüssigkeitsstromes über eine stationäre Phase geleitet und dabei in die einzelnen Bestandteile der Mischung aufgetrennt wird. Gaschromatographie (GC) oder Flüssigkeitschromatographie (LC) Unter den Methoden der LC hat sich die Säulenchromatographie durchgesetzt. Papier- und Dünnschichtchromatographie waren im 19.Jh. wichtig. Zu trennende Substanzmischung = Analyt, wird in einem Puffer aufgenommen. Das Laufmittel = die mobile Phase, vermittelt die Wechselwirkung des Analyten mit der spezifischen Oberfläche einer stationären Phase (chromatographische Säule). Diese Wechselwirkung bewirkt verzögerten Transport der einzelnen Komponenten. Das Eluat benötigt eine charakteristische Zeit oder ein charakteristisches Volumen, die Retentionszeit oder das Retentionsvolumen, um die Trennsäule zu verlassen. Unveränderte Lösungsmittelzusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung: isokratischer Trennung Änderung des Lösungsmittelgemisches (ph oder Salzgehalt) im Verlauf der Elution: Gradiententrennung
Ausrüstung Trennsäule, Lösungsmittelpumpe(n), Probenaufgabe, evtl. automatischer Probengeber (autosampler), Detektion (UV-Durchflussphotometer), Fraktionssammler (fraction collector) Trennsäule wird von der mobilen Phase bei atmosphärischem Druck (offenes System) durchströmt oder unter erhöhtem Druck (Hochdrucksysteme) Manuelle Steuerung der einzelnen Systemkomponenten oder über einen Computer Chromatogramme mittels Schreiber oder am Computer aufgezeichnet Seit Mitte der 70er Jahre: Hochdruckflüssigkeitschromatographie/ Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high pressure/performance liquid chromatography, HPLC)
Stationäre Phasen Gepackte Trennsäule: Stahl- oder Glasrohr mit Füllmaterial: Partikel von einheitlicher Größe poröse Partikel: ermöglichen Eindringen von Probenmolekülen < Partikelporen in das innere Volumen (Permeation), äußere und innere Oberfläche des Füllmaterials steht für Wechselwirkung mit den Analyten zur Verfügung Je kleiner der Durchmesser der Partikel, desto besser die Auflösung Partikel von 3-100µm, Porenweite von 10-100nm Trägermaterialien sind: Biopolymere (Cellulose, Dextran, Agarose), synthetische Polymere (Polyacrylamid, Methacrylate, Polyvinylbenzol/Polystyrol) oder anorganische Polymere (Kieselsäure, Hydroxyapatit, poröse Glaskügelchen) An das Trägermaterial werden kovalent funktionelle Gruppen gebunden, die für die Trennmethode spezifisch sind Abhängigkeit der Trennschärfe von der Partikelgröße
Chromatographie - Theorie Nach Probenauftrag wandern die unterschiedlichen Komponenten als Banden in Abhängigkeit von der Elutionsmethode mit unterschiedlicher Geschwindigkeit duch die Säule. Detektion beim Austritt Dokumentation im Chromatogramm: die eluierten Komponenten werden als Peak gegen die Zeit oder das Elutionsvolumen aufgezeichnet Zeit bzw. Volumen vom Auftrag bis zum Säulenausgang als Totzeit to bzw. Ausschlussvolumen Vo bezeichnet Sehr kleine Moleküle und Salze eluieren nach Durchlauf von ca. einem Säulenvolumen (Gesamtvolumen Vt) Im Trennbereich der Säule eluieren Moleküle der Größe nach mit einem charakteristischen Elutionsvolumen Ve Optimale Bedingungen erzeugen schlanke, symmetrische Proteinpeaks
Gelchromatographie Auftrennung der Proteine nach Größe Probe auf eine Säule aus porösen Kügelchen aufgetragen Bestehen aus unlöslichem, aber stark hydratisierten Polymer (Dextran, Agarose oder Polyacrylamid; im Handel als Sephadex, Sepharose oder Bio-Gel) Kleine Moleküle können in die Kügelchen eindringen, große nicht. Kleine Moleküle verteilen sich in der wässrigen Lösung innerhalb der Kügelchen und zwischen ihnen, große Moleküle nur dazwischen Große Moleküle passieren die Säule schneller und verlassen sie zuerst, weil ihnen nur ein kleines Volumen zugänglich ist. Stryer: Biochemie
Gelchromatographie Nachteile bei großen Mengen und Volumina am Anfang eines Reinigungsganges: Probenvolumen darf 5% des Säulenvolumens nicht übersteigen Gelchromatographiesäulen können mit Proteinen schnell überladen werden Vermischung von Protein- und Salzbereichen Trennung bei geringer Flussrate besser lange Analysezeit Volumen der Ausgangsprobe wird mindestens verdreifacht anschließende Konzentrierung oder konzentrierendes Trennverfahren nötig
Affinitätschromatographie Nutzt die hohe Affinität vieler Proteine zu bestimmten chemischen Gruppen. Man kann zb das pflanzliche Protein Concanavalin A über eine Säule reinigen, die kovalent gebundene Glucosereste enthält. Con A besitzt im Gegensatz zu den meisten Proteinen eine Affinität zu Glucose. Durch Zugabe einer konzentrierten Glucoselösung kann das gebundene Con A von der Säule eluiert werden. Die Glucosemoleküle in der Lösung verdrängen die säulenfixierten Glucosereste von den Bindungsstellen auf dem Con A. Diese Technik besitzt eine geringe Trennkapazität (1), aber eine extrem hohe Selektivität, da in einem Schritt aus einer komplexen Mischung ein einzelnes Protein isoliert werden kann. Stryer: Biochemie
Ionenaustauschchromatographie Trennung der Proteine aufgrund ihrer Nettoladung Oft erster Schritt einer Proteinreinigung Grundlage ist kompetitive Wechselwirkung geladener Ionen: Probenmolekül konkurriert mit Salz-Ionen um geladene Positionen auf einer Ionenaustauscher-Matrix Zuerst bindet das Molekül an die fixierten Ladungen der stationären Phase, dann folgt Verdrängung und Elution des Proteins durch steigende Salzkonzentration des Eluenten Anionenaustauscher: Negativ geladene (anionische) Proteine werden in Säulen mit positiv geladenen funktionellen Gruppen, zb Diethylaminoethyl (DEAE), getrennt. Kationenaustauscher: Positiv geladene (kationische) Proteine werden mit Hilfe von negativ geladenen Gruppen, zb Carboxymethyl (CM), abgetrennt. Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie
Ionenaustauschchromatographie Proteine tragen aufgrund saurer oder basischer Seitenketten einzelner AA negative oder positive Ladungen. Im sauren ph-bereich sind die Aminogruppen (von Lys, Arg, His) protoniert und das Protein verhält sich kationisch. Im basischen Bereich überwiegen die negativen Ladungen an den Seitenketten von Asp und Glu, das Protein tritt als Anion auf. Die Gesamtladung ist also abhängig vom ph der Umgebungslösung amphoteres Verhalten. AA-Komposition bestimmt den isoelektrischen Punkt pi eines Proteins; dieser charakterisiert den Neutralpunkt, an dem sich positive und negative Ladungen kompensieren Überwiegen negativ geladene AA-Seitengruppen niedriger pi < 6 saures Protein Proteine mit pi > 8 als basisch bezeichnet
Beispiel - Kationenaustauscher ph-bereich nahe pi: schwache Wechselwirkung des Proteins mit Ionenaustauscher, wird stärker, je mehr sich ph und pi unterscheiden Je stärker das Protein geladen, desto stärker die Bindung an den Ionenaustauscher Starke Ionenaustauscher: funktionelle Gruppen, die über weiten ph-bereich den Ladungszustand beibehalten Elution durch Salzgradienten (NaCl, KCl) stärker geladene Proteine werden fester zurückgehalten und eluieren erst bei hoher Ionenstärke
HPLC Zur Hochreinigung von Proteinen Oft nach dem Prinzip der Umkehrphasen (reversed phase, RP)-HPLC Meist C 8 (Octyl-) oder C 18 (Octadecyl-) Gruppen kovalent an Kieselgelpartikel gebunden Bindung über hydrophobe WW Elution z.b mittels n-propanolgradienten Proteine mit der größten Affinität zu den hydrophoben Gruppen eluieren als Letzte Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie
Reversed Phase Chromatographie Normalphasen: Trägermaterialien mit polaren Hydroxygruppen diese können den chromatographischen Prozess stören Umkehrphasen: OH-Gruppen mit langen Kohlenwasserstoffketten (C 2 - C 18 ) verethert, dadurch entstehen unpolare Trägermaterialien Hydrophobe Wechselwirkungen des Analyten mit der unpolaren stationären Phase in polarem, wässrigen Lösungsmittel Elution mittels unpolarem organischen Lösungsmittel, das mit dem adsorbierten Molekül um die Bindungsstelle konkurriert Elutionskraft Wasser > Methanol > Acetonitril > n-propanol > Tetrahydrofuran Polarität
Trennkapazität Lottspeich/Zorbas: Bioanalytik
Praktischer Teil Kälberserum: Ausfällen der Proteine mittels Ammoniumsulfat Große Mengen an Ammoniumsulfat würden bei SDS-PAGE stören A. Entsalzen einer Proteinlösung (Pellet aus AS-Fällung) mittels Dialyse B. Entsalzen derselben Proteinlösung mittels Gelchromatographie C. Bestimmung der Proteinkonzentration der Fraktionen der Gelchromatographie sowie des Dialysats mittels Bradford- Färbereaktion D. Messung der Leitfähigkeit (Salzkonzentration) vor und nach Entsalzung
A. Dialyse 200µl der Probe (Pellet aus AS-Fällung) in Dialysekapsel pipettiert Dialysemembran zwischen Deckel und Kapsel geklemmt Kapsel in Becherglas mit destilliertem Wasser Dialyse erfolgt auf Magnetrührer Bestimmen der Proteinkonzentration und der Leitfähigkeit der Probe nach der Dialyse Die entsalzte Probe wird für das nächste Übungsbeispiel gefroren aufbewahrt
B. Säulenchromatographie Fertig gepackte NAP-5 Säulchen Gefüllt mit Sephadex G-25 (Polydextran) Ausschlussgröße von 10kD, entspricht der Dialysemembran
B. Säulenchromatographie 100µl der Proteinlösung auf die Säule Eluat in Mikrotiterplatte aufgefangen (2 Tropfen pro Well, ca. 100µl) Protein- und Salzkonzentration der einzelnen Fraktionen bestimmt 3 Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration für das nächste Übungsbeispiel gefroren aufbewahrt
Absorption C. Proteinbestimmung Proteinkonzentration der Fraktionen aus der Säulenchromatographie, der Ausgangsprobe, und des Dialysats mittels Bradford-Assay bestimmt BSA Eichgerade zum Umrechnen der OD Werte in mg/ml Eichgerade 0,7 0,6 y = 0,2775x + 0,0443 R 2 = 0,9931 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Konz. [mg/ml]
Absorption C. Proteinbestimmung Absoptionsdiagramm des Proteins 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 Reihe1 0,2 0,1 0-0,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Fraktionen
Konz. [mmol/l] D. Salzkonzentration Wir schließen von der elektrischen Leitfähigkeit (µs) auf die Ionenkonzentration (mmol/l): Messen der Leitfähigkeit der Ausgangsprobe, der 3 gepoolten Fraktionen, des Dialysats, und des Aussenmediums der Dialyse Ammoniumsulfat Eichgerade Eichgerade y = 0,0038x - 0,046 1,8 R 2 = 0,9995 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 100 200 300 400 500 Leitfähigkeit [µs]
D. Salzkonzentration Wir kennen jetzt von unseren Proben die Proteinkonzentration in mg/ml und die Salzkonzentration in mm (=µmol/ml) Das Molekulargewicht von Ammoniumsulfat beträgt 132.14 g/mol, dh. eine Ammoniumsulfatkonzentration von 1 µmol/ml entspricht 132.14 µg/ml Daraus berechnen wir den Salzgehalt der Proben in µg(salz) pro mg(protein)
D. Salzkonzentration Beispiel: Proteinkonz. (mg/ml) Salzkonz. (mm) Salzkonz. (µg/ml) Salzgehalt (µg/mg) 2 140 18500 9250 1µmol/ml = 132,14µg/ml 140µmol/ml = x