Kursteil 4: Proteine II

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1 Kursteil 4: Proteine II Lerninhalt: Allgemeine Parameter der Größenausschlusschromatographie, Methoden der Entsalzung (Dialyse, Gelchromatographie) Hintergrund: Dialyse: Die am längsten bekannte Entsalzungsmethode ist die Dialyse. Dialysemembranen lassen kleine Moleküle frei diffundieren, während größere Moleküle zurückgehalten werden. Sie unterscheiden sich in ihrer Porengröße (Cutoff-Wert). Zur Dialyse größerer Probenvolumina füllt man die Proteinlösung in einen Schlauch aus Dialysemembran, der an beiden Enden durch Klammern verschlossen und in ein Becherglas mit Puffer gehängt wird. Der Schlauch sollte nur zu 2/3 gefüllt werden, da während der Dialyse Wasser einwandert und sich dadurch das Volumen im Schlauch erhöht. Die Diffusionsrate wird durch den Konzentrationsgradienten der diffundierbaren Teilchen, die Membranoberfläche und die Temperatur bestimmt. Für eine effektive Entsalzung muß der Puffer gerührt und einige Male gewechselt werden, um einen möglichst hohen Konzentrationsgradienten an der Membran aufrecht zu erhalten. Zur Stabilisierung der Proteine sollte die Dialyse bei 4 C durchgeführt werden. Mittels Leitfähigkeitsmessung des Puffers läßt sich der Fortschritt der Dialyse kontrollieren. Normalerweise genügt ein 2-3 maliger Pufferwechsel mit jeweils 4-6 h Äquilibrierungszeit. Bei einer weitgehenden Entsalzung (Dialyse gegen Wasser) können Proteine wegen der niedrigen Ionenstärke ausfallen. Die Niederschläge können abzentrifugiert und in einem kleinen Volumen einer Lösung mit etwas höherer Ionenstärke wieder gelöst werden. Für kleine Probenvolumina verwendet man keine Dialyseschläuche, sondern Dialysekapseln, die auf einer Seite mit einer Dialysemembran gegen den Puffer abgedichtet sind. Gelchromatographie: Bei dieser Methode werden die in der Probe enthaltenen Substanzen nach ihrer Größe getrennt (Größenauschlusschromatographie, Molekularsiebchromatographie). Man läßt Gele aus Polymeren wie Dextran oder Polyacrylamid in wässrigen Lösungen quellen und befüllt damit eine Trennsäule. Die Partikel dieser Gele weisen eine definierte Porengröße auf. Nach Auftrag eines Substanzgemisches diffundieren die kleinen Moleküle in die Hohlräume der Gelpartikel, während sich die großen Moleküle

2 nur im Lösungsmittel zwischen den Gelpartikeln aufhalten. Daher eluieren Salze und kleine Moleküle langsam, während große Moleküle die Säule schneller passieren. Aufgabenstellung der Versuche: A. Entsalzen einer Proteinlösung (gelöstes Pellet nach Ammoniumsulfatfällung) mittels Dialyse B. Entsalzen derselben Proteinlösung mittels Gelchromatographie C. Bestimmung der Proteinkonzentration der Fraktionen der Gelchromatographie sowie des Dialysats D. Messung der Leitfähigkeit (Salzkonzentration) der verschiedenen Proben Durchführung: Beim Praktikumsbeispiel von voriger Woche haben Sie mittels Ammoniumsulfatfällung Proteine aus Kälberserum ausgefällt und das Proteinpellet in 500µL H 2 O gelöst. Da dieses gelöste Pellet noch große Mengen an Ammoniumsulfat enthält, welches bei der nachfolgenden Analyse (SDS-PAGE) störend wirkt, soll das Salz mit zwei unterschiedlichen Methoden, der Dialyse und der Gelchromatographie, entfernt werden. Anschließend bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen Ihrer Ausgangsprobe sowie der entsalzten Proben mittels Bradford-Färbereaktion. Weiters werden die Salzkonzentrationen vor und nach der Entsalzung bestimmt. Dazu wird die Leitfähigkeit der Lösung als Maß für die Ionenkonzentration gemessen und mittels einer Eichgerade in die Ammoniumsulfatkonzentration rückgerechnet.

3 A. Dialyse einer Proteinlösung mit kleinem Volumen: Füllen Sie 200µL von dem gelösten Pellet in den weissen Teil einer Dialysekapsel. Bedecken Sie diesen mit einem Stück der in Wasser gequollenen Dialysemembran. Verschließen Sie die Kapsel mit dem roten Teil. Notieren Sie die Nummer Ihrer Kapsel. Geben Sie die Kapsel in ein großes Becherglas mit destilliertem Wasser. Die Seite mit der Dialysemembran muss Kontakt zum Wasser haben. Es dürfen sich keine Luftblasen zwischen der Probe und der Membran befinden! Gegen Ende des Kurses wird die Proteinkonzentration der Lösung in der Dialysekapsel bestimmt (Punkt C) und die Leitfähigkeit der Proteinlösung gemessen (Punkt D). Abschließend wird die Probe in ein frisches Eppendorfgefäß umgefüllt, beschriftet, und für das nächste Experiment (SDS-PAGE) weggefroren. Bitte bewahren Sie die Teile der Dialysekapsel für die nachfolgenden Kurse auf! B. Gelchromatographie: Für die Gelchromatographie verwenden wir bereits fertig gepackte NAP-5 Säulchen. Diese Säulchen sind mit Sephadex G-25 gepackt. Sephadex G-25 ist ein Polydextran-Säulenmaterial mit einer Ausschlussgröße von 10kD, was in etwa der Ausschlussgröße unserer Dialysemembran entspricht. Öffnen Sie unten den Auslauf der Säule und nehmen Sie oben die Kappe ab beides bitte aufbewahren! Lassen Sie das Laufmittel (Wasser) aus der Säule in das Waschbecken tropfen. Sobald der Flüssigkeitstand die Fritte erreicht hat, hört die Säule von selbst zum Tropfen auf. Tragen Sie vorsichtig (!) 100µL des gelösten Proteinpellets auf die Fritte auf. Das Eluat wird in ca. 100µL Portionen (2 Tropfen) in den wells der oberen beiden Reihen einer 96-well Miktrotiterplatte aufgefangen. Wenn die aufgetragene Probe in das Gelbett eingewandert ist, füllen Sie vorsichtig (!) wenige (!) Tropfen Wasser nach, um den Rest der Probe in das Gelbett einzuwaschen. Dann gibt man tropfenweise reichlich Wasser als Elutionsmittel auf die Säule. Fahren Sie damit fort, bis Sie etwa 24 Fraktionen aufgefangen haben. Um festzustellen, welche Fraktionen die Proteine und welche das Salz enthalten, wird mittels Bradford-Assay die Proteinkonzentration (Punkt C) bzw. die Leifähigkeit als Maß für die Salzkonzentration (Punkt D) bestimmt. Die drei Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration werden gepoolt und für das nächste Übungsbeispiel (SDS-PAGE) weggefroren. Nach der Elution wird die Säule gründlich mit Wasser gespült (ins Waschbecken tropfen lassen), oben und unten verschlossen, und für die nachfolgenden Kurse aufbewahrt.

4 C. Bradford-Proteinbestimmung im Mikrotiterplattenphotometer: Die Proteinkonzentrationen jener Fraktionen, die wahrscheinlich die eluierten Proteine enthalten (Orientierungshilfe: die entsprechenden Fraktionen erscheinen etwas trüb), werden mittels Bradford-Assay bestimmt. Zusätzlich wird auch die Proteinkonzentration der Ausgangsprobe (gelöstes Pellet) und des Dialysats (aus der Dialysekapsel) festgestellt; diese beiden Proben müssen vor der Messung 1:5 verdünnt werden! Die OD Werte werden anhand einer BSA-Eichgeraden in mg/ml umgerechnet. Stellen Sie ausgehend von einer 4 mg/ml BSA-Lösung eine Verdünnungsreihe laut untenstehender Tabelle her. Sie benötigen von jeder Verdünnung zwar nur 3µL, genauer wird die Verdünnungsreihe aber mit größeren Volumina. Vergessen Sie nicht, jede Verdünnung vor dem Weiterführen zu Vortexen! Da für die Proteinbestimmung alle Proben gleichzeitig gemessen werden müssen und die Dialyse möglichst lange laufen sollte, empfiehlt es sich, vor der Proteinbestimmung nun zunächst die Ammoniumsulfat-Eichgerade für die Leitfähigkeitsmessungen herzustellen (Punkt D1). BSA-Eichgerade: mg/ml Background (Mittelwert der 3 Wells) OD(595) OD Probe - OD back entfällt Legen Sie für jede Probe (laut untenstehender Tabelle) und für jeden Punkt der BSA- Verdünnungsreihe (Eichgerade) 200µL Bradford-Färbereagenz (ist bereits gebrauchsfertig mit Wasser verdünnt) in einer Mikrotiterplatte vor. Drei Wells nur mit Färbereagenz benötigen Sie zur Bestimmung des Backgroundwertes. Pipettieren Sie zügig je 3µL Probe zum Färbereagenz die Ausgangsprobe und das Dialysat werden 1:5 vorverdünnt! Inkubieren Sie die Platte auf einem Schüttler und kontrollieren Sie optisch die Farbreaktion. Die anschließende OD-Messung erfolgt im Plattenphotometer bei 595nm. Der Mittelwert der 3 Backgroundmessungen muss von jedem Messwert subtrahiert werden. Erstellen Sie die Eichgerade und ermitteln Sie anhand dieser unter Berücksichtigung der Vorverdünnungen die Proteinkonzentrationen Ihrer Proben. Poolen Sie die 3 Fraktionen aus der Gelchromatographie, die am meisten Protein enthalten in ein frisches Eppendorfgefäß. Sie benötigen diese für das nächste Praktikumsbeispiel! Wir fahren nun fort mit der Bestimmung der Salzkonzentration in den einzelnen Proben (Punkt D2).

5 Probe OD OD Probe -OD back Gesamtprotein [mg/ml] Gelöstes Proteinpellet (Ausgangsprobe) Dialysat (entsalztes Pellet) D. Bestimmung der Ionenkonzentration (Leitfähigkeitsmessung): Jede wässrige Lösung von Salzen gleicher Konzentration hat eine spezifische Leitfähigkeit. Zu den Stoffen, die eine hohe spezifische Leitfähigkeit besitzen, gehören gut lösliche Salze und starke Basen (Laugen) und Säuren, wie z.b. Natronlauge und Schwefelsäure. Schwache Säuren und Basen (Essigsäure, Ammoniak) weisen eine geringere Leitfähigkeit auf. Bei steigender Konzentration nimmt die Leitfähigkeit linear zu. Ab einer gewissen Konzentration, die bei jedem Stoff unterschiedlich ist, beginnt die Leitfähigkeit bei steigender Konzentration langsamer anzusteigen, stagniert dann, um bei weiterer Erhöhung sogar abzunehmen. Zu erklären ist das bei starken Säuren und Laugen dadurch, dass bei zunehmender Konzentration die Säure bzw. Lauge aus Wassermangel nicht mehr so stark zerfällt - die Aktivität erniedrigt sich. Zusätzlich beeinflussen sich die Ionen gegenseitig stark und verhindern eine freie Beweglichkeit, sodass trotz vollständiger Dissoziierung bei Salzen die Leitfähigkeit sinkt. Im linearen Bereich ist es möglich, von der elektrischen Leitfähigkeit auf die Konzentration rückzuschließen. Genau diese Möglichkeit nutzen wir, um die Salzkonzentration in unseren Proben zu bestimmen. D1. Erstellung einer Ammoniumsulfat-Eichgeraden: Weil wir von der gemessenen Leitfähigkeit auf die Konzentration an Ammoniumsulfat in unseren Proben schließen wollen, müssen wir zuerst eine Eichgerade mit Ammoniumsulfat erstellen. Dazu stellen Sie ausgehend von einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (4.1M) eine Verdünnungsreihe in destilliertem Wasser her. Geben Sie für die erste Verdünnung (1:2500) am besten 10µL der Ammoniumsulfat Lösung (4.1M) in 25mL destilliertes Wasser. Von den weiteren Verdünnungen genügt es, jeweils 3ml herzustellen. Bedenken Sie dabei, dass von der jeweils vorhergehenden Verdünnung in die nächste weitergeführt werden muss! Die Leitfähigkeit wird in µsiemens gemessen und in die Tabelle eingetragen. Dann tragen Sie in einem Diagramm die Leitfähigkeit (Y-Achse) gegen die Konzentration an Ammoniumsulfat (X-Achse) auf. Anhand dieses Diagramms lassen sich anschließend die Salzkonzentrationen unserer Proben ermitteln.

6 Verdünnung Konzentration Leitfähigkeit [µs] 1:2500 1,640mM 1:5000 0,820mM 1: ,410mM 1: ,205mM 1: ,137mM Reines H 2 O 0mM Vor der Bestimmung der Salzkonzentration der verschiedenen Proben wird jetzt die Proteinbestimmung durchgeführt (Punkt C). D2. Bestimmung der Salzkonzentration in den verschiedenen Proben: Alle zu messenden Proben (siehe Tabelle) werden für die Messung 1:100 in destilliertem Wasser verdünnt. Dazu werden 30µL Probe mit 3mL H 2 O vermischt. Anschließend wird die Leitfähigkeit gemessen und die abgelesenen Werte werden anhand der erstellten Eichgerade (und unter Berücksichtigung der jeweiligen Verdünnung!) in die Salzkonzentration umgerechnet. Probe Leitfähigkeit [µs] Ammoniumsulfat- Konzentration [mm] Gelöstes Proteinpellet (Ausgangsprobe) Pool aus 3 Proteinfraktionen (nach Gelchromatographie) Dialysat (entsalztes Pellet)

7 Da Sie jetzt die Proteinkonzentration (mg/ml) Ihrer Proben sowie die Salzkonzentration (mm = µmol/ml) Ihrer Proben kennen, können Sie den Salzgehalt der Proteinproben berechnen. Das Molekulargewicht von Ammoniumsulfat beträgt g/mol. d.h., eine Ammoniumsulfatkonzentration von 1 µmol/ml entspricht µg/ml. Durch Division der Salzkonzentration durch die Proteinkonzentration ergibt sich der Salzgehalt der Probe in µg(salz)/mg(protein). Probe Gelöstes Proteinpellet (Ausgangsprobe) Pool aus 3 Proteinfraktionen (nach Gelchromatographie) Dialysat (entsalztes Pellet) Proteinkonzentration [mg/ml] Salzkonzentration [mm] Salzkonzentration [µg/ml] Salzgehalt der Probe [µg/mg] Wenn alles geklappt hat, sollte in Ihren entsalzten Proben der Salzgehalt (deutlich) geringer sein als in der ursprünglichen Probe!