Biochemische Labormethoden

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1 Biochemische Labormethoden, Seite 1 Biochemische Labormethoden Einführung Mit den Versuchen an diesem ersten Praktikumstag sollen Sie wichtige Methoden wiederholen bzw. ergänzen, die Sie bereits im Chemischen Praktikum kennengelernt haben. Diese Fertigkeiten werden Sie in den folgenden Praktikumsversuchen immer wieder benötigen. Methoden zum Abmessen von Feststoffen: Wägung Methoden zum Abmessen von Flüssigkeiten: Pipettieren mit Mikroliterpipetten Herstellung von Lösungen definierter Zusammensetzung: Ansetzen von Lösungen und Puffern, Herstellen von Verdünnungsreihen, Konzentrationsberechnungen Analyse charakteristischer Eigenschaften von Lösungen: Messung des ph-wertes, Bestimmung der Lichtabsorption Methoden zur Abschätzung von Fehlern: Streuung von Messwerten, statistische Auswertung von Messergebnissen Stichworte zur Vorbereitung Stoffmenge und Konzentration: mol, Molmasse, molare Konzentration, Molarität, Verdünnen und Mischen von Lösungen, Rechnen mit Konzentrationen.Photometrie: Absorption (Absorption), Lambert-Beersches Gesetz, Absorptionskoeffizient. Säuren und Basen: Dissoziation, ph-wert, pk- Wert, Puffer, Pufferkapazität, Natronlauge, Phosphorsäure, Salzsäure, Histidin, Glutaminsäure, Natriumcarbonat, NAD+, NADH. Grundlagen der Statistik: Normalverteilung, Mittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient. Bei der Vorbereitung beachten Sie bitte die Einleitung zum Praktikumsbuch und den Anhang zu diesem Versuch. Versuch 1: Messgenauigkeit beim Pipettieren und Wiegen In diesem Experiment sollen Sie das Pipettieren kleiner Volumina mit den im Praktikum verwendeten Kolbenpipetten üben und dabei die Genauigkeit solcher Pipettierungen ermitteln. Aufgabe: Pipettieren und Wiegen. Lassen Sie sich als erstes in die Bedienung der Waage einweisen. Üben Sie unter Anleitung das Pipettieren. Bestimmen Sie dann die Genauigkeit der Pipette, indem Sie 40mal je 100 µl bzw µl Wasser (Dichte bei 25 C etwa g * cm -3 ) pipettieren und das Gewicht jeder einzelnen Pipettierung mit der Waage bestimmen. Am besten pipettieren Sie in ein Gefäss, das auf der Waage steht. Am Anfang und nach jedem Pipettierschritt wird das Gewicht notiert. Die jeweils pipettierte Wassermenge ermittel der Rechner aus den Gewichtsdifferenzen. Auswerten: Erstellen Sie mit Hilfe des Computers aus den 40 Pipettierungen ein Diagramm. Dazu müssen Sie sich in die Benutzung des der Software einweisen lassen. Das Protokoll sollte die erstellte Grafik enthalten und die folgenden Fragen beantworten: 1. Wie gross sind der Mittelwert und die Standardabweichung der Pipettierungen? Angabe in mg. 2. Zeigt die Pipette einen signifikanten systematischen Fehler (d.h. eine echte Abweichung zwischen Mittelwert und Sollwert)? Angabe der Abweichung in % des Sollwerts. 3. Mit welchem Variationskoeffizienten (VK) haben Sie pipettiert? Angabe in %.

2 Biochemische Labormethoden, Seite 2 Versuch 2: Titration biologisch wichtiger Puffersubstanzen und Puffergruppen Dabei sollen Sie die Lösung einer Säure gegen eine Lauge titrieren (bzw. umgekehrt) und durch Messung des ph-wertes die pk-werte der puffernden Substanz und die Pufferkapazität ermitteln. Zur Auswahl stehen die folgenden fertigen Lösungskombinationen: in der Vorlage (20 ml) 1 24 mm Natriumcarbonat mit 140 mm Natriumchlorid Titration mit (in Schritten von 100 µl) 240 mm Salzsäure mm Phosphorsäure 1 M Natronlauge 3 50 mm Glutaminsäure mit 80 mm Salzsäure 4 25 mm Histidin mit 50 mm Salzsäure 1 M Natronlauge 250 mm Natronlauge Aufgabe: Titrieren und ph-messen. Pipettieren Sie 20 ml einer der Lösungen (1, 2, 3 oder 4) in ein kleines Becherglas (30-50 ml) und bestimmen Sie den ph-wert der Lösung. Geben Sie in 100 µl-schritten mit einer Pipette die rechts davon angegebene Lösung hinzu und notieren Sie jeweils den ph-wert, nachdem die Lösungen durch Rühren mit dem Magnetrührer gut durchmischt sind. Insgesamt sind Pipettierschritte erforderlich. Zeichnen und Auswerten: Zeichnen Sie die Titrationskurve wieder mit Hilfe des Computers. In dem Ausdruck sollen Sie die folgenden Auswertungen mit Farbstift vornehmen: 1. Kennzeichnen Sie auf dem Diagramm die ph-bereiche, in dem die titrierte Substanz puffert. 2. Ermitteln Sie grafisch die pk-werte der puffernden Substanz und ordnen sie sie den einzelnen funktionellen Gruppen des titrierten Moleküls zu. 3. Berechnen Sie die Pufferkapazität. Dazu ermitteln Sie grafisch in einem der Pufferbereiche den Konzentrationszuwachs von Lauge bzw. Säure, der zu einer ph-wert-änderung um eine Einheit führt (Angabe in mol l -1 /ph, siehe Anhang).

3 Biochemische Labormethoden, Seite 3 Versuch 3: Photometrie, Absorptionsspektrum, Absorptionskoeffizient In diesem Versuch sollen Sie bereitstehende Lösung von NAD + bzw. NADH verdünnen und das Absorptionsspektrum der Lösungen (d.h. die Absorption als Funktion der Wellenlänge) messen. Ausserdem ermitteln Sie die Wellenlänge am Absorptionsmaximum und den molaren Absorptionskoeffizienten von NADH. Schliesslich nehmen Sie eine Eichkurve für NADH auf und ermitteln daraus die Konzentration einer unbekannten NADH-Lösung. Aufgabe1: Absorption bei verschiedenen Wellenlängen messen. Pipettieren Sie 300 µl von einer der beiden bereitstehenden Lösungen (entweder 1 mm NAD + oder 1 mm NADH) in ein Reagenzglas und verdünnen Sie durch Zugabe von destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 100 µm. Geben Sie diese Lösung in eine Küvette und messen Sie die Absorption im Bereich von 320 bis 400 nm in 5 nm-schritten gegen einen Leerwert (Wasser). Bei jeder neuen Wellenlänge muss der Leerwert auf A= 0 abgeglichen werden. Zeichnen und Auswerten. Zeichnen Sie mit Hilfe des Computers das Absorptionsspektrum (y-achse: gemessene Absorption E; x-achse: eingestellte Wellenlänge). Lesen Sie die Wellenlänge λ des Absorptionsmaximums ab und bestimmen Sie den molaren Absorptionskoeffizienten ε bei dieser Wellenlänge (das geht nur, wenn ein Maximum erkennbar ist!) Aufgabe 2: Verdünnen und Absorption messen. Verdünnen Sie die bereitstehende 1 mm NADH-Lösung in den Volumenverhältnissen 1:10, 1:20, 1:40 und 1:80 mit Wasser und bestimmen Sie die Absorption dieser Lösungen bei 340 nm. Die Nucleotid-Lösung ist nicht billig. Setzen Sie deshalb von jeder Verdünnung nur maximal 5 ml an! Zeichnen und Auswerten. Zeichnen Sie (von Hand, siehe Anhang) den Zusammenhang zwischen Konzentration und gemessener Absorption (y-achse: gemessene Absorption A; x-achse: berechnete Konzentration). Bestimmen Sie auch aus diesen Werten den Absorptionskoeffizienten. Aufgabe 3: Absorption einer unbekannten Lösung messen. Füllen Sie etwa 3 ml der ausstehenden unbekannten NADH-Lösung in eine Küvette und messen Sie die Absorption bei 340 nm gegen einen Leerwert. Auswerten. Berechnen Sie die unbekannte Konzentration mit Hilfe der ε-werte aus Aufgabe 1 und 2 (Angabe in mol l -1 ). Welcher Wert von ist der zuverlässigere?

4 Biochemische Labormethoden, Seite 4 Fragen 1. Wie berechnet man den Mittelwert einer Messreihe? Was versteht man unter Streuung der Messwerte und wie gibt man sie quantitativ an? 2. Wieviel NaCl (Molmasse 58,5) benötigen Sie zum Ansetzen von 2 Litern einer M Lösung? Wie stellen Sie diese Lösung her? 3. Wieviel mg NADH-Na 2 (rel. Molmasse 709,4) müssen Sie abwiegen, um 5 ml einer 1 mm Lösung herzustellen? 4. Welche Konzentration erhält man beim Verdünnen von 2 ml einer M Lösung auf 10 ml? 5. Wie gross ist die Konzentration von Wasser (Angabe in mol * l -1 ) in reinem Wasser? 6. Wie ist der ph-wert einer Lösung definiert? Von welchen Grössen hängt er ab? 7. Wie hoch sind die H + -Konzentration und der ph-wert von reinem Wasser bei 25 o C? 8. Warum kann Wasser sowohl eine Säure als auch eine Base sein? 9. Aufgrund welcher chemischen Eigenschaft ist Essigsäure sauer? 10. Wie gibt man die Stärke einer Säure oder Base an? 11. Welche ph-werte haben eine 1 M, eine 0,1 M und eine 10 mm wässrige Salzsäure-Lösung? 12. In welchen Formen kann Phosphorsäure in wässriger Lösung auftreten? Welche davon sind im Blut die häufigsten? 13. Wieviele Ladungen trägt Glutaminsäure a) bei ph 1, b) bei ph 6? 14. Wie lautet das Lambert-Beer sche Gesetz? Unter welchen Bedingungen ist es gültig? 15. Von welchen Parametern ist die Absorption (Absorption) einer Lösung abhängig? 16. Warum wird in der Photometrie monochromatisches Licht verwendet? 17. Welche Reaktionen finden bei der Titration von salzsaurer Histidin-Lösung mit Natronlauge nacheinander statt?

5 Biochemische Labormethoden, Seite 5 Anhang 1: Konzentrationsberechnungen Einheit der Stoffmenge Einheit der Stoffkonzentration : mol : mol l -1, abgekürzt: M ( molar ) 1 M (molar) : die Lösung enthält pro Liter 1 mol des Stoffes 1 mm (millimolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-3 mol des Stoffes 1 M (mikromolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-6 mol des Stoffes 1 nm (nanomolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-9 mol des Stoffes Rechnen mit kleinen Zahlen Beim Umgang mit kleinen Konzentrationen bedient man sich am besten der Potenzdarstellung, d.h. 1 = 10 0 = = 10-1 = = 10-2 = = 10-3 = usw. Man schreibt kleine Zahlen als Produkt einer Zahl zwischen 1 und 10 und der zugehörigen Zehnerpotenz, also z.b als Multiplikation: (x 10 a ) (y 10 b ) = x y 10 (a+b) Beispiel: = (2-4) = Division: (x 10 a ) / y 10 b = (x / y) 10 (a-b) Beispiel: / = (1/4) 10-4 (-6) = = 25 Verdünnen und Mischen Beim Verdünnen und Mischen geht kein gelöster Stoff verloren, d.h. die Stoffmenge (= Konzentration Volumen) bleibt gleich. Verdünnt man V 1 ml einer Lösung der Konzentration c 1 mit reinem Lösungsmittel auf ein Endvolumen von V 2 ml, gilt c 1 V 1 = c 2 V 2, d.h. c 2 = c 1 (V 1 /V 2 ) Beispiel: 5 ml einer Lösung der Konzentration M werden auf 250 ml verdünnt. Die entstehende Lösung hat in diesem Fall die Konzentration c 2 = (5/250) M = M. b) Beim Mischen von Lösungen der Konzentrationen c 1 und c 2 gilt für Konzentration c 3 c 3 = (c 1 V 1 + c 2 V 2 ) / (V 1 + V 2 ) Beispiel: 4 ml einer Lösung der Konzentration M werden mit 6 ml einer M Lösung gemischt. Die neue Konzentration ist dann c 3 = ( ) / 10 = M

6 Biochemische Labormethoden, Seite 6 Anhang 2: Grundlagen der Statistik Bei rein zufälligen Fehlern gilt die Gauss sche Normalverteilung. Sie ist charakterisiert durch den Mittelwert m und die Standardabweichung s. Als Faustregel kann man sich merken, dass ein systematischer Fehler wahrscheinlich dann vorliegt, wenn sich Mittelwert und Sollwert um mindestens 2 s unterscheiden. Gauss'sche Normalverteilung m-s s m s m + s hier: s = 16.0 m = Häufigkeit m = Σ x i / n s = Σ (x i - m) 2 / (n-1) Varianz = s 2 VK = 100. s / m (%) Meßwert Anhang 3: Titrationskurven und Pufferkapazität Im Beispiel handelt es sich um eine zweiprotonige Säure mit pk-werten von 3 und 10. Zur Bestimmung der Pufferkapazität wurde im Pufferbereich 2 durch ein Steigungsdreieck graphisch ermittelt, dass zur Erhöhung des ph-werts um 2 Einheiten (von 8-10) 1 ml NaOH nötig war. Wenn wir annehmen, dass die zur Titration verwendet NaOH die Konzentration 1 M hatte und das Ausgangsvolumen der zu titrierenden Lösung 20 ml betrug, ergibt sich aus der Abbildung eine maximale Pufferkapazität der Lösung von ungefähr mol l -1 (Näherungsrechnung: 1ml 1 M NaOH wurde auf etwa 21.5 ml verdünnt. Wie kann man ein genaues Ergebnis erhalten?). 12 ph pk 2 V ph 4 2 pk 1 Pufferbereich ml NaOH Pufferkapazität = c / ph ( in m ol / l)

7 Biochemische Labormethoden, Seite 7 Eichkurve NADH+H Absorption NADH-Konzentration (mol l -1 ) Verdünnung 1 : 10 1 : 20 1 : 40 1 : 80 unbekannte Lsg. Konzentration (mol l 1 ) ε = l mol -1 cm -1 Absorption (gemessen) Name: Gruppe:...

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