TriFaster Maximo Aufreinigung von DNA, RNA und Protein aus einer Probe Features: - Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus der gleichen Probe - Für kleine und große Mengen von Probe - Gleichzeitiges Vorbereiten mehrerer Proben - Für frische, lyophilisierte und gefrorener Proben - Höchster Ertrag von nicht-degradierter totaler RNA - Kurze Ausfällungszeit Ertrag: 1 15 µg RNA pro mg Gewebe 2 7 µg DNA pro mg Gewebe 0,2 13 µg pro mg Protein Beschreibung: Gebrauchsfertiges Reagenz für die sukzessive Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus ein und derselben Probe. Enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat. TriFaster-Maxima ist ein gebrauchsfertiges Reagenz für die gleichzeitige Extraktion von RNA, DNAund Proteinen aus Materialien humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen und viralen Ursprungs. Die Methode basiert auf einer Einschritt-Flüssigphasen-Separation. Mit ihrer Hilfe erhält man nichtdegradierte RNAs sowohl aus kleinen als auch aus großen Probenmengen. TriFaster ermöglicht auch die gleichzeitige Bearbeitung großer Probenzahlen. TriFaster-Maxima enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat in einphasiger Lösung. Nach der Zugabevon Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die RNA ist in der wässrigen Phase enthalten, die DNA in der organischen und der Interphase. Die Proteine befinden sich in der organischen Phase. Die Extraktion mit TriFaster-Maxima ergibt qualitativ und quantitativ sehr gute Ausbeuten. Extrakte zahlreicher Zell- und Gewebearten enthalten in der endgültigen RNA-Fraktion noch Material unbekannter Zusammensetzung mit einem hohen Anteil an Proteoglycanen und Polysacchariden. Dieses Material ist in wässrigen Guanidinisothiocyanatlösungen und Wasser löslich sowie in Alkohol unlöslich. Es bildet DNA-ähnliche Fäden und hat eine den Nukleinsäuren vergleichbare UV-Absorption. Dadurch führt es zu falschen Berechnungen des RNA-Gehaltes, was bei Hybridisierungen und Enzymreaktionen zu Problemen führen kann. Darüber hinaus verschlechtert es die RNA-Qualität und hat inhibitorische Effekte auf RT-PCRs. Zellen verschiedener Entwicklungsstadien enthalten unterschiedliche Mengen dieses kontaminierenden Materials. Warnung: TriFaster-Maxima enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. DasArbeiten mit TriFaster-Maxima darf nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzugerfolgen. Sollte es dennoch zu einem Kontakt von TriFaster-Maxima mit der Haut oder den Augen kommen, sind die betroffenen Stellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich danach umgehend in ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Eine Verwendung für diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel sowie eine Verabreichung an Menschen oder Tiere ist nicht erlaubt. Lagerung: bei + 4 C Transport: bei Raumtemperatur
Bestell-Information: Kat.-Nr Beschreibung Menge 302010 TriFaster Maximo-Isolation 100 ml 302015 TriFaster Maximo-Isolation 5x100 ml Anleitung für die RNA-Extraktion RNA-Extraktionen können mit TriFaster-Maxima in 1 Stunde ausgeführt werden. RNA, die dabei extrahiert wird, ist nicht-degradiert und frei von DNA und Proteinen. Sie kann für folgende Verfahren weiterverwendet werden: Northern-Analysen, cdna-synthesen, RT-PCR-Reaktionen, Dot-Blot- Hybridisierungen, Poly(A)+ Selektionen, in vitro-translationen, Klonierungen und RNase-Assays. Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: - Chloroform - Isopropanol - Ethanol - Hochwertige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei 12.000 x g!!!) Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten: 1. Homogenisierung 1.0 ml TriFaster-Maxima + 50-100 mg Probe 2. Phasentrennung Homogenat + 0.2 ml Chloroform 3. RNA-Präzipitation wäßrige Phase + 0.5 ml Isopropanol 4. Waschen der RNA 1 ml 75 %iges Ethanol 5. Lösen der RNA Formamid, 0.5 % SDS oder Wasser Wenn nicht anders angegeben, wird die Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Homogenisierung a. Gewebe 50-100 mg Gewebe werden mit je 1 ml TriFaster-Maxima homogenisiert. Um eine gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten TriFaster-Maxima -Volumens betragen. b. Monolayer-Zellen Die Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml TriFaster-Maxima je 3.5- cm-schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die Menge an benötigtem TriFaster-Maxima ist nicht von der Zellzahl, sondern von der Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm2) abhängig. Eine unzureichende Menge an TriFaster-Maxima kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA führen. c. Zellsuspensionen Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml TriFaster-Maxima je 5-10 x 106 Zellen (Tier-, Pflanzen, Hefe- oder Bakterienzellen) resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte vermieden werden. Bei der Extraktion von RNA aus Hefen und Bakterien ist in einigen Fällen eine zusätzliche Homogenisierung notwendig. 2. Phasentrennung Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter TriFaster-Maxima 0.2 ml Chloroform zugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3-10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend die Probe für 5 Minuten bei 12.000 x g zentrifugieren um eine Phasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere rote Phenol-Chloroform- Phase, eine obere farblose wäßrige Phase und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wäßrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine der in
Interphase und der Phenolphase befinden. Die wäßrige Phase nimmt dabei ca. 60 % des Probenvolumens ein. Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.b. Isoamylalkohol frei sein. 3. RNA-Präzipitation Die wäßrige Phase in ein frisches Röhrchen überführen und die Inter- und Phenolphase für eine mögliche Extraktion von DNA und Proteinen bei 4 C lagern. Die Präzipitation der RNA erfolgt mit 0.5 ml Isopropanol pro eingesetzten Milliliter TriFaster-Maxima. Die Probe mischen und für 5-15 Minuten auf Eis bzw. 4 C inkubieren. Im Anschluss für 10 Minuten bei 12.000 x g und 4 C zentrifugieren. Das RNA-Präzipitat sollte von gelartiger Konsistenz sein und an der unteren Seite des Röhrchens liegen. 4. Waschen der RNA Den Isopropanolüberstand vorsichtig abnehmen und das Pellet zweimal mit 1 ml 75 % Ethanol durch Vortexen und anschließende Zentrifugation (10 Minuten, 12.000 x g, 4 C) waschen. 5. Lösen der RNA Das RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Ein vollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermieden werden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen lassen!!! Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNasefreiem Wasser oder in 0.5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf 55-60 C verbessert die Lösbarkeit. Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösen der RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden. TriFaster-Maxima extrahiert Gesamt-RNA einschließlich mrna und rrna. Die erhaltene Lösung ist frei von DNA und Proteinen und hat einen A260/280-Quotienten von 1.6-2.0. Anmerkungen 1. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden, sollten während der gesamten Extraktion Handschuhe getragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden. 2. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg) sollten 70 µg Glykogen pro 1 ml TriFaster als Carrier für die Präzipitation zugesetzt werden. 3. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben für einige Monate bei 70 C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann nach dem Waschen für 1-3 Wochen bei 4 C in 75 %igem Ethanol oder für ca. 1 Jahr bei 20 C gelagert werden. 4. Für die RNA-Extraktion mit TriFaster-Maxima können auch Table-Top-Zentrifugen verwendet werden, wenn sie ein Maximum von 2.600 x g erreichen. In diesem Fall müssen lediglich die Zentrifugationszeiten in den Schritten 2 und 3 auf 30-60 Minuten verlängert werden. 5. Bei Verwendung von Proben mit hohem Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderen Bestandteilen ist ein Extra-Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform können unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 x g und 4 C entfernt werden. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulären Membranbestandteile und hochmolekularen DNAs lokalisiert sind. Bei Proben aus fettreichem Gewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare, RNA-haltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Chloroform-Extraktion durchgeführt wie beschrieben.
Troubleshooting Guide RNA Isolation Erwartete RNA-Mengen pro mg Gewebe oder 10 6 Zellen: - Leber und Milz 6-10 µg - Niere 3-4 µg - Skelettmuskulatur und Gehirn 1-1.5 µg - Plazenta 1-4 µg - Epithelzellen 8-15 µg - Fibroblasten 5-7 µg RNA Menge zu gering: Ausgangsmaterial mit geringem RNA-Gehalt Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse RNA-Pellet nicht vollständig gelöst A260/280-Quotient < 1.65: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Probe wurde nach der Homogenisierung nicht bei Raumtemperatur inkubiert Die wäßrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert RNA-Pellet nicht vollständig gelöst RNA-Abbau: Gewebe wurde nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht direkt eingefroren Zellen wurden durch Trypsinieren zerstört Kontamination mit RNase während der Präparation Die verwendeten Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Bei der Elektrophorese lag der ph-wert der Formaldehydlösung unter 3.5 DNA-Kontamination: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Die zur Extraktion verwendeten Proben enthielten organische Lösungen z.b. Ethanol, DMSO, konzentrierte Puffer oder hatten einen alkalischen ph-wert B. Anleitung für die DNA-Extraktion Während der obenbeschriebenen Phasentrennung wird die DNA aus der wäßrigen Phase entfernt. Nach ihrer Präzipitation aus der organischen Phase und einigen Waschschritten wird sie in 8 mm NaOH gelöst und anschließend neutralisiert. Die mit TriFaster-Maxima gereinigte DNA ist für die PCR, Southern Blotting, Restriktionsverdaus und Klonierungen geeignet. Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: - Ethanol - Natriumcitrat - Natriumhydroxid Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten und wird, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. DNA-Präzipitation Phenolphase und Interphase + 0.3 ml Ethanol pro 1 ml TriFaster-Maxima 2. Waschen der DNA 1 ml 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol 3. Lösen der DNA 8 mm NaOH 1. DNA-Präzipitation Nach dem vollständigen Entfernen der wäßrigen Phase wird die DNA durch die Zugabe von 0.3 ml 100 % Ethanol pro eingesetzten ml TrifastTM präzipitiert. Durch mehrmaliges Invertieren des Tubes den Ansatz gut mischen und für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die DNA
durch einen Zentrifugationsschritt (2.000 x g, 15 min, 4 C) pelletieren. (Das sorgfältige Entfernen der wäßrigen Phase beeinflußt die Qualität der DNA in hohem Maße.) 2. Waschen der DNA Überstand (Ethanol/Phenolphase) entfernen und für die spätere Proteinextraktion bei 4 C lagern. Das DNA-Pellet zweimal mit 1 ml 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol waschen. Bei jedem Waschschritt die DNA für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 0.1 M Natriumcitrat / 10 % Ethanol inkubieren und anschließend für 5 Minuten bei 2.000 x g und 4 C zentrifugieren. Danach die DNA in 2 ml 75 % Ethanol aufnehmen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung wiederholt schütteln und anschließend für 5 Minuten bei 2.000 x g und 4 C zentrifugieren. 3. Lösen der DNA Das DNA-Pellet durch Anlegen eines Vakuums für ca. 5-10 Minuten trocknen und durch wiederholtes Aufziehen mit einer Pipette in 8 mm NaOH lösen. Die endgültige DNA-Konzentration sollte mit 8 mm NaOH auf 0.2-0.3 µg/µl eingestellt werden. Für 50-100 mg Gewebe werden ungefähr 0.3-0.6 ml 8 mm NaOH benötigt. Detailliertere Angaben zur Neutralisation der DNA sind in Tab. 1 auf zu finden. Die beschriebene Methode löst DNA sehr sorgfältig. Trotzdem enthält die Lösung oft gelartige Bestandteile, die jedoch durch eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 x g entfernt werden können. Die DNA-Lösung wird anschließend in ein neues Röhrchen überführt. Hohe Viskosität der DNA-Lösung deutet auf hochmolekulare DNA hin. Bestimmung der DNA-Menge Um die optische Dichte bei 260 nm optimal messen zu können, wird ein Aliquot aus der DNA-Lösung entnommen und mit Wasser verdünnt. Folgende Annahme wird getroffen: - 1 A260 Unit entspricht 50 µg doppelsträngiger DNA Typischerweise sollten 75 % der DNA eine Größe von etwa 50-100 kbp und 25 % eine Größe von 20 kbp aufweisen. Die DNA sollte von RNA und Proteinen frei sein und einen A260/280-Quotienten > 1.7 haben. Anwendungen 1. Amplifikation der DNA mittels PCR Nach dem Lösen der DNA in 8 mm NaOH wird der ph-wert mit 0.1 M HEPES auf 8.4 eingestellt (vgl. Tabelle 1). Je PCR-Reaktion sollten zwischen 0.1 und 1.0 µg DNA verwendet werden. 2. Restriktionsverdau ph-wert mit HEPES auf einen geeigneten Wert einstellen (vgl. Tabelle 1). Puffer nach Anleitung des Enzym-Anbieters zugeben und wie gewohnt weiterverfahren. Tabelle 1: HEPES-Menge je 1 ml 8 mm NaOH Endgültiger ph 100 mm HEPES (µl) Wert 8,4 66 8,2 90 8,0 115 7,8 135 7,5 180 Endgültiger ph 1 M HEPES (µl) Wert 7,2 30 7,0 10
Anmerkungen 1. Die Phenolphase und die Interphase können über Nacht bei 4 C gelagert werden. 2. Proben können in 75 % Ethanol für 4 Monate bei 4 C gelagert werden. 3. DNA kann in 8 mm NaOH über Nacht bei 4 C gelagert werden. Für längere Lagerung sollte der ph-wert auf 8.0 eingestellt und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mm zugefügt werden. Die DNA darf nicht eingefroren werden. Troubleshooting Guide - DNA-Extraktion Erwartete DNA-Mengen pro mg Gewebe oder 10 6 Zellen: - Leber und Milz 3-4 µg - Skelettmuskulatur, Gehirn und Plazenta 2-3 µg - Kultivierte humane, Ratten- und Mauszellen 5-7 µg - Fibroblasten 5-7 µg DNA-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse DNA-Pellet nicht vollständig gelöst A260/280-Quotient < 1.65: Phenol wurde nicht vollständig entfernt, DNA-Pellet mit 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol waschen DNA-Abbau: Gewebe wurde nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht eingefroren Die verwendeten Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Proben wurden mit zu starker Scherung homogenisiert und die DNA wurde zerstört RNA-Kontamination: Wäßrige Phase wurde unvollständig entfernt DNA-Pellet wurde nicht sorgfältig genug gewaschen C. Anleitung für die Protein-Extraktion Proteine können nach der DNA-Präzipitation aus der Phenol/Ethanol-Phase extrahiert werden. Die erhaltene Proteinlösung kann direkt für die Untersuchung von speziellen Proteinen, z.b. mittels Western oder Southwestern Blotting, weiterverwendet werden. Für Radioimmunassays kann eine zusätzliche Aufbereitung mittels SDS-PAGE erforderlich sein. Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: - SDS - Guanidinhydrochlorid - Ethanol - Isopropanol Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten und wird, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt: 1. Protein-Präzipitation Phenol/Ethanol-Überstand + 1.5 ml Isopropanol 2. Waschen der Proteine 3 x 2 ml 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol 1 x 2 ml Ethanol (100 %) 3. Lösen der Proteine 1 % SDS oder 10 M Harnstoff/50 mm DTT
1. Protein-Präzipitation Die Proteine durch Zugabe von 1.5 ml Isopropanol zum Phenol/Ethanol-Überstand präzipitieren. Die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 10 Minuten bei 12.000 x g und 4 C zentrifugieren. 2. Waschen der Proteine Überstand entfernen und das Proteinpellet dreimal mit 2 ml 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol waschen. Hierfür die Proben jeweils für 20 Minuten in 0.3 M Guanidinhydrochlorid / 95 % Ethanol bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 5 Minuten bei 7.500 x g und 4 C zentrifugieren. Danach Protein-Pellet in 2 ml 100 % Ethanol vortexen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und erneut zentrifugieren (5 Minuten, 7.500 x g, 4 C). 3. Lösen der Proteine Der kritische Schritt bei der Isolierung von Proteinen mit TriFaster-Maxima ist die Resolubilisierung aus dem Pellet. Hierfür stehen drei alternative Methoden zur Verfügung, die, abhängig vom Ausgangsmaterial, ein effizientes Lösen der Proteine ermöglichen: Option 1: Ethanol vollständig entfernen und Protein-Pellet durch Anlegen eines leichten Vakuums für 5-10 Minuten trocknen. 1 % SDS zugeben und durch Auf- und Abziehen mit der Pipette lösen. Um das Pellet vollständig zu lösen, kann eine Inkubation bei 50-100 C notwendig sein. Das Pellet besteht aus löslichen Proteinen und unlöslichen Bestandteilen, wie Membranresten und extrazellulärem Material, die durch eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 10.000 x g und 4 C entfernt werden können. Den Proteinüberstand in ein neues Röhrchen überführen. Die Proteinlösung kann sofort verwendet oder bei 20 C gelagert werden. Option 2: Schwer zu lösende Pellets können alternativ auch durch Beschallen in 10 M Harnstoff/50 mm DTT gelöst werden. Dazu Ethanol vollständig entfernen und Protein-Pellet durch Anlegen eines leichten Vakuums für 5-10 Minuten trocknen. Zunächst 50 µl frisch angesetzten 10 M Harnstoff/50 mm DTT zugeben und Pellet mit einer Nadel aufbrechen. Das Gesamtvolumen der zugegebenen Lösung sollte variiert werden, um die gewünschte Konzentration an gelösten Proteinen bestimmen zu können. Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 3 Minuten auf 100 C erhitzen. Danach mit 10 Impulsen auf Eis beschallen. Falls bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht alle Proteine in Lösung sind, sollte der Koch/Beschall-Schritt noch ein- bis zweimal wiederholt werden. Die Proteinlösung kann sofort verwendet oder bei 20 C gelagert werden. Option 3: Den Phenol/Ethanol-Überstand aus Schritt B.2. bei 4 C über Nacht gegen dreifach gewechseltes 0.1 % SDS dialysieren. Das Dialysat für 10 Minuten bei 10.000 x g und 4 C zentrifugieren und den klaren Überstand für Western weiterverwenden oder bei 20 C einfrieren. Anmerkungen 1. In einigen Fällen werden bei Fällungen mit Aceton bessere Proteinerträge erzielt als bei der Verwendung von Isopropanol. Optimale Ergebnisse sind dabei mit Aceton:Phenol/Ethanol- Verhältnissen von 3:1 bis 6:1 zu erzielen. Generell liegt die Protein-Ausbeute nach TriFaster-Extraktion bei rund 40 bis 60 % einer Extraktion mit der SDS-Methode. 2. Die Proteine sind in 0.3 M Guanidinhydrochlorid/95 % Ethanol oder in absolutem Ethanol bei 4 C für einen Monat und bei 20 C für mindestens ein Jahr stabil. 3. Proteine können in Anlehnung an die Bradfort-Methode quantifiziert werden, wenn der SDS-Gehalt unter 0.1 % liegt.
Troubleshooting Guide - Protein-Extraktion Protein-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse Protein-Pellet nicht vollständig gelöst Protein-Abbau Protein-Degradation: Gewebe wurde nicht direkt verarbeitet oder eingefroren Banden-Deformation bei der PAGE: Protein-Pellet nicht sorgfältig genug gewaschen Erwartete Protein-Mengen pro mg Gewebe oder 106 Zellen: - Leber und Milz 9-11 µg - Niere 10-12 µg - Lunge 10-13 µg - Skelettmuskulatur ca. 5 µg - Gehirn 8-10 µg - Thymus 9-11 µg - Epithelzellen 0.2-0.3 µg - Fibroblasten 0.2-0.3 µg