Venor GeM Sample Preparation Kit

Venor GeM Sample Preparation Kit Manual Extraction of Mycoplasma DNA from cell culture material and biopharmaceutical materials for use with Venor GeM Mycoplasma Detection Kits Instructions for Use Gebrauchsinformation FOR USE IN RESEARCH AND QUALITY CONTROL ZUR ANWENDUNG IN DER FORSCHUNG UND QUALITÄTSKONTROLLE Order No. Bestell-Nr. 56-1005/-1050/-1100 Product Version Produktversion: 02 Document Version Dokumentversion: 01 Release Date Veröffentlichungsdatum: 01.01.2015

Symbols Symbole Lot No. Chargen-Nr. Order No. Artikel-Nr. Expiry date Verfallsdatum Store at Lagerung bei Contains reagents for 5/50/100 extractions Enthält Reagenzien für 5/50/100 Extraktionen Manufacturer Hersteller

INTENDED USE The Venor GeM Sample Preparation Kit was optimized for the isolation and cleaning of genomic mycoplasma DNA from cell culture materials or biopharmaceutical samples, including but not restricted to raw materials, in process samples and final products, in combination with Minerva Biolabs Venor GeM Mycoplasma PCR Detection Kits. The reagents provided with this kit were the same as in the preliminary product version MB DNA Extraktion Kit. The protocols have been further improved to fit the specific requirements of cell culture screening and regulated testing according to European Pharmacopoeia (EP) 2.6.7. Already established protocols can still be used without any effect on validated procedures. The extraction of viral, eukaryotic or other microbial RNA or DNA from different sample materials can be perfoemd easily and with highest efficiency with the specialized ExtractNow kits. Please check page 20 of this booklet or www.minerva-biolabs.com/extractnow/ for further information. PRINCIPLE OF THE METHODE Cells are lysed by a combination of detergents and chaotropic salt. A previous heat treatment of the sample not critical for the DNA yield. The lysate is directly applied onto the spin columns. The DNA is selectively bound to the highly specified silica membrane. Two subsequent washes remove residual contaminants, like proteins, metabolites, dyes, detergent etc. The purified DNA is eluted in TE buffer. The procedure is completed in 30 min. The DNA is ready-to-use for PCR. Kit component Label information 5 extractions Cat. No. 56-1005 50 extractions Cat. No. 56-1050 100 extractions Cat. No. 56-1100 Required supplements Spin Columns 5 units 50 units 100 units - Collection Tubes 5 units 50 units 100 units - Conditioner 2 ml 20 ml 40 ml - Buffer A1 1.2 ml 11.5 ml 22.9 ml 1.5/15/30.1 ml ethanol Buffer A2 0.8 ml 8.0 ml 15.9 ml 1.9/18.6/37.1 ml ethanol Buffer E 0.6 ml 6 ml 12 ml - REAGENTS Each kit contains reagents for 5, 50 or 100 extractions. The expiry date of the unopened package is marked on the package label. The kit components are stored until use at room temperature (18 to 25 C). The lot specific quality control certificate (Certificate of Analysis) can be downloaded from our website (www.minerva-biolabs.com). E N G L I S H 1

NEEDED, BUT NOT INCLUDED IN THE KIT Ethanol > 96 % abs. 1.5 ml reaction tubes Micro centrifuge or heat block applicable with 1.5 ml reaction tubes Pipettes and filter tips (10, 100 und 1000 µl) Proteinase K for samples with > 10 mg/ml total protein content (Cat. No. 56-0002) Internal Control DNA extra, DNA for proces control as direct spike into the samplesfor use with Venor GeM Classic Kit (Cat. No. 11-1905) or Venor GeM qep kit (Cat. No. 11-9905) SAMPLE MATERIAL In highly confluent cell cultures, cell culture media with serum content of more than 12% or high protein concentrations samples, metabolism and lipids may lead to a inhibitions of the PCR may causing a lack of sensitivity and consequently false negative results. Phenol Red is usually added to cell culture media and can significantly affect the measurement of the fluorescence in the qpcr. In these cases, a sample preparation by DNA extraction is urgently needed. The Venor GeM Sample Preparation Kit can be used directly for the extraction of DNA from samples such as cell culture supernatants, which can contain up to 10 6 cells/ml with high yields. Samples with a protein concentration of more than 10 mg/ml, such as cell pellet, serum, or fermentation products may require a pre-treatment with proteinase K. In combination with the Venor GeM Sample Preparation Kit, add 10 µl of proteinase K solution (Cat. No. 56-0002) to each sample, vortexed briefly and start the extraction without incubation by the addition of conditioner. The kit has not been optimized for the purification of DNA from eukaryotic cells. 2 E N G L I S H

PRECAUTIONS This kit is intended for research use and should not be used for quality control and product release testing without sample specific validation. This kit should be used only by trained persons. All samples should be considered potentially infectious and handled according to local or national regulations. This kit substances may be disposed of according to local regulations. Always wear a suitable lab coat, disposable gloves, and protective goggles. The samplepreparation waste contains Conditioner and Buffer A1, which can form highly reactive compounds when combined with bleach. DO NOT add bleach or acidic solutions directly to the samplepreparation waste. If liquid containing these buffers is spilt, clean with suitable laboratory detergent and water. Assessment according to 67/548/EWG or 1999/45/EG applicable for Conditioner and Buffer A1: R 22 Harmful if swallowed. R 36/38 Irritating to eyes and skin. R 52/53 Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. S 13 S 26 S 36 S 46 Keep away from food, drink and animal feed. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. Wear suitable protective clothing. If swallowed, seek medical advice immediately and show container or label. Assessment according to (EG) No. 1272/2008 (GHS) for Conditioner and Buffer A1: Acute Tox. 4, H302; Skin Irrit. 2, H315; Eye Irrit. 2, H319 The kit components can be disposed according to the local regulations. E N G L I S H 3

PROCEDURE Step 1: Preparation of Sample Material Transfer 200 µl of sample material into a fresh 1.5 ml reaction tube. 1. For product release testing up to 50 µl of Internal Control DNA should be added directly to the sample as process control. Testing with Venor GeM Classic we recommend a spike of 30 µl and with Venor GeM qep of 12 µl for each sample. 2. 3. Add 200 µl of Conditioner, vortex for at least 10 sec and incubate at room temperature (18 to 25 C) for at least 5 min. Add 200 µl of absolute ethanol to the mixture. Vortex immediately and very thoroughly in order to prevent any precipitation and loss of nucleic acids. 4. Proceed as described in chapter DNA Isolation. Step 2: DNA Isolation Reconstitute Buffer A1 and Buffer A2 with absolute ethanol as stated on the bottle label. Pre-heat Buffer E to 70 C. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Take one spin column per sample from the kit and stick it into a collection tube. Mark the sample identification on the lid of the spin column. Fill the sample lysate into the spin column without moistening the rim of the spin column. Centrifuge the system for 1 min at 10,600 x g (approx. 10,000 rpm with a desk centrifuge). Discard the flow through from the collection tube and reassemble the spin column and the collection tube. Add 500 µl of Buffer A1. Centrifuge the system for 1 min at 10,600 x g (approx. 10,000 rpm with a desk centrifuge), discard the flow through and re-assemble the spin column. Fill the spin column with 500 µl Buffer A2. Centrifuge the system for 1 min at 10,600 rpm (10,000 x g), take the spin column out of the collection tube, dump the containing Buffer A2, discard the flow through and re-assemble the spin column. Centrifuge for 1 min at full speed (approx. 13,200 rpm) in order to remove the remaining Buffer A2. Discard the collection tube containing the Buffer A2 and place the spin column into a sample 1,5 ml reaction tube. Pipette 60 µl of pre-heated Buffer E (70 C) into the spin column directly onto the center of the silica membrane. The complete membrane should get in touch with the Buffer E. Secure the sample storage tube and incubate for 2 min at room temperature. 8. Following the incubation, centrifuge the system for 2 min at 10,600 rpm (10,000 x g). 9. Remove the spin column and use the eluate directly for the PCR procedure. 4 E N G L I S H

NOTES ON THE PROCEDURE 1. This leaflet must be widely understood for a successful use of Venor GeM Sample Preparation Kit The reagents supplied should not be mixed with reagents from different lots and used as an integral unit. The reagents of the kit should not be used beyond its shelf life. 2. Any deviation from the extraction method can affect the results. 3. For each setup, the use of control samples is advised to secure the day-to-day validity of results. at The spike with an Internal Amplification Control facilitate the evaluation of the extraction. 4. Do not use other alcohols than ethanol, because other alcohols may cause inconsistent yields. 5. Pre-heating of Buffer E increases the yield drastically. 6. The extract is stable for approximately 1 week at +2 C to +8 C and can be kept at -18 C for long term storage. 7. Untreated cell culture materials should be extracted as soon as possible. Cell culture materials can be stabilized by heat treatment (95 C, 10 min, up to 500 µl) for 1 week at room temperature. APPENDIX Limited Product Warranty This warranty limits our liability for replacement of this product. No warranties of any kind, express or implied, including, without limitation, implied warranties of merchantability or fitness for a particular purpose, are provided. Minerva Biolabs shall have no liability for any direct, indirect, consequential, or incidental damages arising out of the use, the results of use, or the inability to use this product. E N G L I S H 5

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ANWENDUNGSGEBIET Der Venor GeM Sample Preparation Kit wurde für die Extraktion und Reinigung von genomischer Mykoplasmen-DNA aus Zellkulturen oder biopharmazeutischen Materialien für eine nachfolgende PCR-Analyse mit dem Venor GeM Mycoplasma PCR Detection Kits entwickelt. Die enthaltenen Reagenzien wurden gegenüber der Vorgängerversion, dem MB DNA Extraction Kit, nicht verändert. Die hier beschriebenen Protokolle wurden jedoch für die spezifischen Anforderungen des Screenings von Zellkulturen und der European Pharmacopoeia (EP)-konformen Testung auf Mykoplasmen gemäß Kapitel 2.6.7 optimiert. Bereits etablierte und validierte Protokolle können weiterhin genutzt werden. Für die Extraktion von viraler, eukaryotischer oder mikrobieller RNA oder DNA aus verschiedensten Materialien empfehlen wir unsere spezialisierten ExtractNow Kits. Eine Auswahl finden Sie auf Seite 20 und unter www.minerva-biolabs.com/extractnow/. ERKLÄRUNG DES VERFAHRENS Die Zellen werden durch eine Kombination aus Detergenz und chaotropen Salz lysiert. Eine vorangegangene Hitzelyse ist unkritisch für die DNA-Ausbeute. Das Lysat wird direkt auf die Spinsäulen aufgebracht. Die DNA wird selektiv an die hoch spezifische Silikamembran gebunden. Zwei nachfolgende Waschschritte entfernen Reste von Verunreinigungen wie Proteine, Stoffwechselprodukte, Farbstoffe, Detergenz usw. Die gereinigte DNA wird in TE-Puffer eluiert. Der Prozess ist in 30 min abgeschlossen. Die DNA kann direkt in die PCR eingesetzt werden. ENTHALTENE REAGENZIEN Jedes Kit enthält Reagenzien für die Extraktion von 50 bzw. 100 Proben (Probekits 5 Extraktionen). Das Verfallsdatum der ungeöffneten Packung ist auf dem Außenetikett vermerkt. Die Lagerung erfolgt bis zur Verwendung bei Raumtemperatur. Das chargenspezifische Qualitätskontrollzertifikat (Certificate of Analysis) kann auf unserer Webseite heruntergeladen werden (www.minerva-biolabs.com). Reagenz Bezeichnung 5 Extraktionen Art. Nr. 56-1005 50 Extraktionen Art. Nr. 56-1050 100 Extraktionen Art. Nr. 56-1100 Ergänzungen Spin Columns 5 Einheiten 50 Einheiten 100 Einheiten - Collection Tubes 10 Einheiten 100 Einheiten 200 Einheiten - Conditioner 2 ml 20 ml 40 ml - Buffer A1 1,2 ml 11,5 ml 22,9 ml 1,5/15/30,1 ml Buffer A2 0,8 ml 8,0 ml 15,9 ml 1,9/18,6/37,1 ml Buffer E 0,6 ml 6 ml 12 ml - D D E E U U T T S S C C H H 7

BENÖTIGTES, ABER NICHT IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Der Venor GeM Sample Preparation Kit enthält die Reagenzien für die Extraktion von Gesamt- DNA aus diversen Materialien. Allgemein übliche Verbrauchsmaterialien und Reagenzien eines molekularbiologischen Labors sind nicht enthalten. Dazu zählen: Ethanol > 96 % abs. 1,5 ml Reaktionsgefäße Mikrozentrifuge und Heizblock für 1,5 ml Reaktionsgefäße Pipette mit Filterspitzen (10, 100 und 1000 µl) Proteinase K für Proben mit > 10 mg/ml Gesamtproteingehalt (Art. Nr. 56-0002) Internal Control DNA extra, DNA für die Prozesskontrolle als Probenspike für die Anwendung der Venor GeM Classic Kit (Art. Nr. 11-1905) oder dem Venor GeM qep Kit (Art. Nr. 11-9905) 8 D E U T S C H

PROBENMATERIAL Bei hoch konfluenten Zellkulturen, Zellkulturmedien mit einem Serumgehalt von mehr als 12 % oder proteinogenen Proben kann es zu einer Inhibitionen bei der PCR durch Stoffwechselprodukte bzw. Lipide kommen. Phenolrot wird üblicherweise Zellkulturmedien hinzugefügt und beeinflusst deutlich die Messung der Fluoreszenz in der qpcr. In diesen Fällen ist eine Probenvorbereitung durch DNA-Extraktion dringend notwendig. Der Venor GeM Sample Preparation Kit kann direkt für die Extraktion von DNA aus Proben wie Zellkulturüberständen, die bis zu 10 6 Zellen/ml enthalten können, mit hohen DNA-Ausbeuten genutzt werden. Proben mit einer Proteinkonzentration von über 10 mg/ml, wie Zellpellets, Serum oder Fermentationsprodukte, können eine Vorbehandlung mit Proteinase K erfordern. In Kombination mit mit dem Venor GeM Sample Preparation Kit werden 10 µl der Proteinase K-Lösung (Art. Nr. 56-0002) jeder Probe hinzugegeben, kurz gevortext und die Extraktion ohne Inkubationsphase durch Zugabe des Conditioners gestartet. Der Kit wurde nicht für die Aufreinigung von eukaryotischer DNA aus Zellen optimiert. VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Kit ist ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt und darf ohne probenspezifische Validierung nicht für die Freigabetestung eingesetzt werden. Dieser Kit sollte nur von geschulten Personen verwendet werden. Das Probenmaterial muss als potentiell infektiös betrachtet und nach den lokalen oder nationalen Vorschriften behandelt werden. Immer Einmalhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Bestandteile des Conditioners und des Buffer A1 können mit Bleichmitteln oder säurehaltigen Lösungen hochreaktive Verbindungen bilden. Mischen Sie keine säurehaltigen oder bleichenden Mittel mit dem Flüssigabfall. Ausgelaufene oder verschüttete Reste können mit Wasser und Spülmittel entfernt werden. Einstufung gemäß Richtlinie 67/548/EWG oder Richtlinie 1999/45/EG für Conditioner und Buffer A1: R 22 R 36/38 R 52/53 S 13 S 26 S 36 S 46 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Reizt die Augen und die Haut. Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. Von Nahrungsmitteln, Getränken und Futtermitteln fernhalten. Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. Einstufung gemäß Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (GHS) für Conditioner und Buffer A1: Acute Tox. 4, H302; Skin Irrit. 2, H315; Eye Irrit. 2, H319 Dieser Kit kann gemäß den örtlichen Bestimmungen entsorgt werden. D E U T S C H 9

DURCHFÜHRUNG Schritt 1: Aufarbeitung des Probenmaterials 200 µl des Probenmaterials werden in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. 1. 2. 3. Für die Freigabetestung wird die Zugabe von bis 50 µl Internal Control DNA als Prozesskontrolle empfohlen. Für die Testung mit dem Venor GeM Classic sollten 30 µl je Probe und für den Venor GeM qep Kit 12 µl je Probe von der Internal Control DNA des PCR Kits hinzugegeben werden. Nach Zugabe von 200 µl Conditioner wird ausgiebig (10 sec.) gevortext und der Ansatz über 5 min bei Raumtemperatur (18 bis 25 C) inkubiert. Der Ansatz wird mit 200 µl absolutem Ethanol versetzt und sofort gut gemischt, um eine Fällung der DNA zu vermeiden. Die Verwendung anderer Alkohole führt zu einer deutlichen Verringerung der Ausbeute an DNA. 4. Der Ansatz wird wie in Kapitel DNA-Isolierung beschrieben weiter bearbeitet. 10 D E U T S C H

Schritt 2: DNA-Isolierung Buffer A1 und Buffer A2 müssen mit Ethanol abs. (> 96 %) ergänzt werden. Buffer E auf 70 C erwärmen. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Für jede Probe wird ein Spin Column aus der Verpackung genommen und in das Collection Tube gesteckt. Die Probenkennung wird auf dem Deckel notiert und mit dem gesamten Lysat befüllt, ohne dabei den oberen Rand des Gefäßes zu benetzen. Das Spin Column wird mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, der Durchfluss verworfen und das Spin Column wieder in das Collection Tube gesteckt. In das Spin Column werden 500 µl Buffer A1 hineingegeben und das Spin Column mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, um den Buffer A1 abzutrennen. Der Durchfluss wird verworfen und die Säule wieder in das Collection Tube gesteckt. In das Spin Column werden 500 µl Buffer A2 hineingegeben und das Spin Column mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, um den Buffer A2 abzutrennen. Das Spin Column wird aus dem Collection Tube genommen und der Durchfluss (Buffer A2) verworfen. Das Spin Column wird mit dem gleichem Collection Tube noch einmal 1 min bei maximaler Umdrehungsleistung der Zentrifuge zur vollständigen Trocknung zentrifugiert. Das Spin Column wird in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß gesteckt und das Collection Tube samt Durchfluss verworfen. Es werden 60 µl vorgewärmter Buffer E in das Spin Column pipettiert und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird das System für 2 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert. Das Spin Column wird entfernt und das Probengefäß verschlossen. Der Extrakt kann direkt für die PCR eingesetzt werden. D E U T S C H 11

ANMERKUNGEN ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Diese Gebrauchsinformation muss für eine erfolgreiche Benutzung des Venor GeM Sample Preparation Kits weitgehend verstanden worden sein. Die gelieferten Reagenzien einer Charge sind als integrale Einheit zu verstehen. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht vermischt werden. Die Reagenzien des Kits dürfen nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwendet werden. 2. Jegliche Abweichung vom Extraktionsverfahren kann die Resultate beeinträchtigen. 3. Je Ansatz sollte mindestens eine Extraktionskontrolle mitgeführt werden. Vorzugsweise wird diese mit der Internen Amplifikationskontrolle des PCR-Tests versetzt. 4. Der Extrakt ist bei +2 C bis +8 C für ca. 1 Woche stabil und kann bei mindestens -18 C gelagert werden. 5. Die Verwendung anderer Alkohole als Ethanol abs. führt zu einer deutlichen Verringerung der Ausbeute an DNA. 6. Unbehandelte Zellkulturmaterialien sollten schnellstmöglich extrahiert werden. Zellkulturmaterialien können durch eine Hitzebehandlung (95 C, 10 min, bis zu 500 µl) für 1 Woche bei Raumtemperatur stabilisiert werden.

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