Der Experimentator: Immunologie

Der Experimentator: Immunologie

In der Reihe DER EXPERIMENTATOR sind bereits erschienen Hermey et al.: Neurowissenschaften (ISBN 978-3-8274-2369-6) Luttmann et al.: Immunologie (ISBN 978-3-8274-2026-8) Müller/Röder: Microarrays (ISBN 978-3-8274-1438-0) Rehm/Letzel: Proteinbiochemie/Proteomics (ISBN 978-3-8274-2313-9) Schmitz: Zellkultur (ISBN 978-3-8274-2573-7)

Werner Luttmann Kai Bratke Michael Küpper Daniel Myrtek Der Experimentator: Immunologie 4., vollständig überarbeitete und korrigierte Auflage

Werner Luttmann Friesoythe Kai Bratke Rostock Michael Küpper Rostock Daniel Myrtek Freiburg ISBN 978-3-642-41898-3 DOI 10.1007/978-3-642-41899-0 ISBN 978-3-642-41899-0 (ebook) Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar. Springer Spektrum Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichenund Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Planung und Lektorat: Kaja Rosenbaum, Bettina Saglio Einbandentwurf: deblik, Berlin Einbandabbildung:»Innenrin«, Öl auf Leinwand, 80x100 cm, Mai 2011, Prof. Dr. Diethard Gemsa, Im Köhlersgrund 10, 35041 Marburg. E-Mail: gemsa@staff.uni-marburg.de, Website: www.gemsakunst.de. Gedruckt auf säurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier Springer Spektrum ist eine Marke von Springer DE. Springer DE ist Teil der Fachverlagsgruppe Springer Science+Business Media www.springer-spektrum.de

V Vorwort 4. Auflage Nun nach vier Jahren ist es wieder soweit: Die dritte Auflage des Immuno-Experimentators ist fast vergriffen, so dass wir gefordert waren, das Nachfolgewerk zu gebären. Getreu unserem Bestreben nach einem»wirklich«praktikablen Immunologiewerk haben wir die vierte Auflage nicht nur dazu genutzt, den unvermeidbaren Rechtschreibfehler-Teufel auszutreiben, sondern die Qualität als immunologisches Nachschlagewerk weiter zu verbessern. Um der schnelllebigen wissenschaftlichen Welt Rechnung zu tragen, wurden die Methodenkapitel um Antikörper-Arrays und Tissue-Microarrays erweitert. Weiterhin haben wir einen Überblick über den therapeutischen Einsatz von Immunzellen, mit Fokus auf Dendritische Zellen, implementiert. Selbstverständlich wurden auch die CD-Nomenklatur sowie die Cytokin- und Chemokintabelle auf den aktuellen Stand gebracht. Die Autoren

VII Vorwort Nach zwei erfolgreichen Ausgaben vom»experimentator«war es an der Zeit, die Lücke zur»immunologie«zu schließen. Aus dieser Wissenschaft wurde ein schon lange nicht mehr wegzudenkendes»tool«geboren: der Antikörper. Zusammen mit seinem jeweils spezifischen Antigen spielt er im vorliegenden Werk die Hauptrolle. Entstanden ist: Der Experimentator: Immunologie; in neuem Design, weil neue Konzern- Mutter (Elsevier). Der ursprüngliche Auftrag des Experimentators, Methodik untypisch feucht, statt konventionell trocken zu vermitteln ist hingegen der gleiche geblieben. Begonnen mit dem proteinbiochemischen Rehm und fortgeführt mit dem molekularbiologischen Mülhardt deckt der nun vorliegende»immuno-experimentator«einen weiteren großen Bereich der Biologie ab. Dem erprobten und offensichtlich erfolgreichen Experimentator-Konzept folgend, wurden hier möglichst viele bereits etabliertere wie auch neuere Methoden berücksichtigt sowie deren Vorteile, Nachteile und erfahrungsgemäß nützliche Tipps genannt. Die Autoren

IX Inhaltsverzeichnis 1 Antikörper........................................................................... 1 1.1 Des Antikörpers Eigenheiten.......................................................... 2 1.1.1 Molekülstruktur von Antikörpern........................................................ 4 1.1.2 Die Antigen-Antikörper-Bindung........................................................ 7 1.2 Herstellung von Antikörpern.......................................................... 7 1.2.1 Das Antigen............................................................................ 8 1.2.2 Die Wahl der Spezies................................................................... 10 1.2.3 Antigenapplikation..................................................................... 11 1.2.4 Polyklonale Antikörper................................................................. 14 1.2.5 Monoklonale Antikörper................................................................ 17 1.2.6 Rekombinante Antikörper.............................................................. 21 1.3 Reinigung von Antikörpern........................................................... 24 1.3.1»Quick and dirty«präzipitationsmethoden............................................. 25 1.3.2 Affinitätschromatographie.............................................................. 26 1.3.3 Klassische Methoden der Proteinreinigung.............................................. 29 1.3.4 Aufreinigung von IgY aus Eigelb........................................................ 31 1.3.5 Aufreinigung rekombinanter Antikörper................................................. 32 1.3.6 Wichtige analytische Techniken......................................................... 33 1.4 Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern............................... 35 1.4.1 Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen................................... 35 1.4.2 Kopplung von Markerenzymen an Antikörper............................................ 38 1.4.3 Kopplung von Fluorochromen an Antikörper............................................ 39 1.4.4 Kopplung von Biotin................................................................... 42 1.4.5 Markierung mit Gold................................................................... 43 1.4.6 Markierung mit radioaktiven Isotopen................................................... 45 1.5 Antikörper-Mikroarray................................................................ 46 Weiterführende Literatur.............................................................. 49 2 Zellseparation....................................................................... 51 2.1 Trennung nach Zellgröße und Zelldichte Zentrifugationstechniken.................. 52 2.1.1 Differenzialzentrifugation............................................................... 52 2.1.2 Dichtegradienten-Zentrifugation........................................................ 53 2.1.3 Separationsmedien..................................................................... 55 2.1.4 Gegenstromzentrifugation.............................................................. 63 2.2 Trennung nach zellspezifischen Oberflächenmolekülen............................... 64 2.2.1 Adhäsion an Kunststoffoberflächen..................................................... 65 2.2.2 Adhäsion an Nylonwatte................................................................ 66 2.2.3 Erythrocyten-Rosettierung.............................................................. 67 2.2.4 Immunmagnetische Separation......................................................... 68 2.2.5 Lysierende Antikörper.................................................................. 70 Weiterführende Literatur.............................................................. 71 3 Durchflusscytometrie.............................................................. 73 3.1 Wie funktioniert das eigentlich?....................................................... 74 3.2 Fluoreszenzen......................................................................... 78

X Inhaltsverzeichnis 3.3 Probenvorbereitung................................................................. 82 3.3.1 Zellmarkierung........................................................................ 82 3.4 Inbetriebnahme des Durchflusscytometers........................................... 87 3.5 Kompensation und Messung......................................................... 87 3.5.1 Kompensation........................................................................ 89 3.5.2 Messung.............................................................................. 93 3.6 Auswertung.......................................................................... 96 3.6.1 Histogramm-Plot...................................................................... 96 3.6.2 Dot-Plot.............................................................................. 96 3.6.3 Dichteplot............................................................................ 96 3.6.4 Konturplot............................................................................ 97 3.6.5 Isometrische Darstellung.............................................................. 98 3.7 Modelle und Ausstattungen.......................................................... 98 3.7.1 Autosampler.......................................................................... 98 3.7.2 Zellsorter............................................................................. 98 3.8 Vergleichbarkeit durchflusscytometrischer Daten.................................... 100 Weiterführende Literatur............................................................. 100 4 Quantitative Immunoassays...................................................... 103 4.1 Assaykonzepte....................................................................... 104 4.1.1 Der kompetitive Assay................................................................. 105 4.1.2 Der Sandwich-Assay................................................................... 105 4.1.3 Welches Assaykonzept für welche Anwendung?......................................... 107 4.2 Radioimmunoassay (RIA)............................................................. 108 4.2.1 Historisches........................................................................... 108 4.2.2 Praktisches............................................................................ 108 4.3 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)........................................ 111 4.3.1 Coaten, Blocken, Waschen............................................................. 111 4.3.2 Enzyme und Substrate................................................................. 112 4.3.3 ELISA in der Praxis..................................................................... 113 4.4 ELISPOT-Assay........................................................................ 117 4.4.1 Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden...................................... 117 4.4.2 Prinzip und Praxis..................................................................... 118 4.5 Partikel-Immunoassay (PIA).......................................................... 120 4.5.1 Prinzip der Mini-Kugeln................................................................ 120 4.5.2 Trapping-Assay........................................................................ 121 4.5.3 Multiplex-Assay....................................................................... 121 4.5.4 Vergleich mit anderen Immunoassays.................................................. 124 4.6 Verstärkersysteme................................................................... 124 4.6.1 Erhöhung der Markerdichte............................................................ 125 4.6.2 Multi-Enzym-Kaskaden................................................................ 125 4.6.3 Immuno-PCR.......................................................................... 127 Weiterführende Literatur............................................................. 130 5 Western-Blot....................................................................... 133 5.1 Probenvorbereitung................................................................. 134 5.2 Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese..................... 135 5.2.1 Die diskontinuierliche SDS-PAGE....................................................... 135 5.2.2 Native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung.............................. 139

Inhaltsverzeichnis XI 5.3 Transfer der Proteine auf eine Membran (Blot)....................................... 141 5.3.1 Wet-Blot.............................................................................. 142 5.3.2 Semi-Dry-Blot......................................................................... 143 5.3.3 Fehlerquellen......................................................................... 143 5.4 Proteindetektion..................................................................... 144 5.4.1 Blocking.............................................................................. 144 5.4.2 Antikörpermarkierung................................................................. 145 5.4.3 Visualisierung......................................................................... 147 5.4.4»Stripping«und»Re-probing«von Western-Blot-Membranen............................ 147 5.4.5 Fehlerquellen und Kontrollen.......................................................... 148 5.5 Dot- und Slot-Blot.................................................................... 149 Weiterführende Literatur............................................................. 149 6 in situ-immunlokalisation........................................................ 151 6.1 Untersuchung von Zellsuspensionen................................................. 152 6.1.1 Zellsuspensionen...................................................................... 152 6.1.2 Cytospins............................................................................. 152 6.1.3 Zellausstriche......................................................................... 153 6.1.4 Einbettung von Zellen................................................................. 153 6.1.5 Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen.......................... 153 6.2 Untersuchung von Geweben......................................................... 155 6.2.1 Vorbereitung.......................................................................... 155 6.2.2 Fixierung............................................................................. 156 6.2.3 Paraffin-Einbettung.................................................................... 160 6.2.4 Schneiden............................................................................ 161 6.2.5 Nachbehandlung...................................................................... 161 6.2.6 Immundetektion...................................................................... 163 6.2.7 Eindeckung........................................................................... 174 6.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben...................... 176 6.3.1 Fixierung............................................................................. 176 6.3.2 Einbettung............................................................................ 177 6.3.3 Mikrotomie........................................................................... 177 6.3.4 Immundetektion...................................................................... 178 6.4 Tissue Microarrays................................................................... 178 Weiterführende Literatur............................................................. 179 7 Immunpräzipitation............................................................... 181 7.1 Die Klassiker......................................................................... 183 7.1.1 Eindimensionale Immundiffusion...................................................... 183 7.1.2 Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony................................... 185 7.1.3 Radiale Immundiffusion nach Mancini.................................................. 186 7.1.4 Immunelektrophoresen................................................................ 187 7.1.5 Limitierung und aktuelle Bedeutung................................................... 190 7.2 Immunpräzipitation»heute«......................................................... 192 7.2.1 Die Präzipitationsmatrix............................................................... 192 7.2.2 Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine....................................... 192 7.2.3 Analyse der Immunpräzipitate......................................................... 193 Weiterführende Literatur............................................................. 194

XII Inhaltsverzeichnis 8 Die Zelle: leben, fressen, sterben................................................. 197 8.1 Zellviabilitätsbestimmung........................................................... 198 8.1.1 Farbstoff-Exklusion.................................................................... 198 8.1.2 Tetrazoliumsalz-Reduktion............................................................. 199 8.1.3 ATP-Assay............................................................................. 199 8.2 Zellproliferation...................................................................... 201 8.2.1 DNA-Markierung mit [ 3 H]Thymidin..................................................... 201 8.2.2 DNA-Markierung mit 5-Brom-2 -desoxyuridin (BrdU).................................... 202 8.2.3 Durchflusscytometrische Bestimmung der Zellproliferation.............................. 203 8.3 Phagocytose-Assays.................................................................. 203 8.3.1 Die Testpartikel Futter für die Phagocyten............................................. 205 8.3.2 Methoden der Partikelvisualisierung................................................... 206 8.4 Zellvermittelte Cytotoxizität......................................................... 209 8.4.1 Chrom[ 51 Cr]-release-Assay............................................................. 210 8.4.2 Lactat-Dehydrogenase(LDH)-release-Assay............................................. 211 8.4.3 Durchflusscytometrischer Cytotoxizitätsnachweis....................................... 212 8.5 Apoptose-Assays..................................................................... 213 8.5.1 Färbungen des Zellkerns............................................................... 215 8.5.2 DNA-Leiter............................................................................ 215 8.5.3 Nucleosomen-Quantifizierungs-ELISA.................................................. 216 8.5.4 TUNEL-Technik........................................................................ 216 8.5.5 Annexin V............................................................................. 217 8.5.6 Messung von Caspase-Aktivität........................................................ 217 8.5.7 Sonstiges............................................................................. 219 Weiterführende Literatur............................................................. 219 9 Immunologie in der klinischen Anwendung.................................... 223 9.1 Blutgruppenbestimmung............................................................ 224 9.2 HLA-Typisierung..................................................................... 227 9.2.1 Lymphocytotoxizitätstest.............................................................. 228 9.3 Lymphoblastentransformation....................................................... 230 9.4 Immunzellen in der Therapie......................................................... 231 9.4.1 Dendritische Zellen.................................................................... 232 Weiterführende Literatur............................................................. 236 10 Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik......................... 237 10.1 Deskriptive Statistik.................................................................. 240 10.1.1 Lokationsmaße........................................................................ 240 10.1.2 Streuungsmaße....................................................................... 242 10.1.3 Korrelationsmaße..................................................................... 244 10.2 Prüfstatistik.......................................................................... 245 10.2.1 Skalen und ihre Daten................................................................. 246 10.2.2 Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung.............................. 246 10.2.3 Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests............................................. 249 Weiterführende Literatur............................................................. 254

Inhaltsverzeichnis XIII 11 Naturwissenschaft vs. Übernatürliches.......................................... 255 CD-Antigene, Cytokine, Chemokine.............................................. 257 Glossar.............................................................................. 281 Index................................................................................ 293

XV Exkurse Exkurs 1 Handhabung und Lagerung von Antikörpern............................ 5 Exkurs 2 Wie gewährleiste ich ein langes Leben meiner wertvollen Chromatographiesäulen?.............................................. 30 Exkurs 3 U/min oder g wie hätten Sie s denn gern?.............................. 55 Exkurs 4 Antikoagulanzien.................................................... 58 Exkurs 5 Zellzahl-Bestimmung................................................ 59 Exkurs 6 Thrombocyten-Isolation.............................................. 60 Exkurs 7 Vorbehandlung von Gewebe zur Zellseparation.......................... 63 Exkurs 8 Zellsiebe............................................................ 65 Exkurs 9 Zelllinien........................................................... 70 Exkurs 10 Saponine.......................................................... 86 Exkurs 11 Bestimmung der Nachweisgrenze...................................... 107 Exkurs 12 Homogene Enzymimmunoassays..................................... 117 Exkurs 13 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese............................. 137 Exkurs 14 Nephelometrie..................................................... 182

XVII Abkürzungen ABC Avidin-Biotin-Komplex AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol AET 2-Aminoethylisothiouroniumbromid AMCA Aminomethylcumarinacetat AP Alkalische Phosphatase APAAP Alkalische Phosphatase anti-alkalische Phosphatase APC Antigen-präsentierende Zelle BAL Bronchoalveoläre Lavage BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat BrdU Brom-2 -desoxyuridin-5 -monophosphat BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) CBMC cord blood mononuclear cells (Nabelschnur-Blut) CN 4-Chlor-1-Naphtol DAB 3,3-Diaminobenzidin DAPI 4 6-Diamidino-2-phenylindol DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FACS Fluorescence activated cell sorter FCS fetal calf serum FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC forward scatter HLA human leucocyte antigen HRP horseradish peroxidase i.d. intradermal IEM Immunelektronenmikroskopie ILM Immunlichtmikroskopie i.p. intraperitoneal i.v. intravenös LSAB Labelled Streptavidin-Biotin mak monoklonaler Antikörper ME Mercaptoethanol MNC mononuclear cells NBT Nitro(blau)tetrazoliumchlorid PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese pak polyklonaler Antikörper PAP Peroxidase anti-peroxidase PBL uneinheitliche Nutzung: peripheral blood lymphocytes peripheral blood leucocytes PBMC peripheral blood mononuclear cells PBS phosphate buffered saline PEG Polyethylenglycol PHA Phytohämagglutinin PLP Periodat-Lysin-Paraformaldehyd PMNC polymorphkernige und polynukleäre Granulocyten