GDL-Symposium onig und onigtechnologie Identifizierung von Markersubstanzen zur Charakterisierung von Sortenhonigen Stuttgart, 01.12.2011 Tobias Wiezorek ÓQSI 2011 1
Pollen Pollenanalyse viel Erfahrung, über + unterrepräsent. Pollen Tracht Nektar Biene onig onigv Analytik von Proteinen (Enzymatik) Aminosäuren GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 2
Probenorganisation 35xThymian 21xTanne 5xZuckerfütterung 9xWeißtanne 5xUlmo 27xWald 40xAkazie 1x Amorfa 1x Avocado 9xBuchweizen 4xCalluna 1x Erbeerbaum 8xErica 39xEucalyptus 1xSalbei 20xRosmarin 1xRhododendron 1xRewarewa 41xSonnenblume 10xPinie 1xregano 15xrange 2xMinze GDL-Symposium onig und onigtechnologie 42xRaps me Σ > 500 8xMesquite 7xManuka 52xLinde 19xKastanie 27xKlee 6xLitchie 3xLöwenzahn 1ximbeer 4xKaffee 2xKoriander 3xKornblume 23xLavendel 2xLeatherwood à breite statistische Basis ÓQSI 2011 3
Σ > 500 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 4
Enzymatik I saure Phosphatase N 2 Phosphatase 40 C, p = 4,4 N 2 Sistierlösung p = 9,5 N 2 P - l = 405 nm Methodik orientiert sich an: erkunft und Charakterisierung der onig-phosphatasen, Jürgen Siegler, Dissertation an der Universität Stuttgart, 1985 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 5
Enzymatik I saure Phosphatase 3,5 3 N 2 Extinktionsänderung [405 nm] 2,5 2 1,5 1 P Phosphatase 40 C, p = 4,4 N 2 Sistierlösung p = 9,5 N 2 - l = 405 nm 0,5 Methodik orientiert sich an: 0 erkunft und Charakterisierung der onig-phosphatasen, Jürgen Siegler, Dissertation 0 30an der Universität 60 90 Stuttgart, 120 1985 150 180 210 240 Reaktionszeit [min] Zuckerfütterungshonig Akazienhonig 04/12 Akazienhonig 04/08 Callunahonig 09/04 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 6
Enzymatik II Glucose-xidase vs. Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N 2 C 3 N C 3 2 2 + Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 2 + 2 N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 7
Enzymatik II Analytik von Glucose-xidase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N 2 C 3 N C 3 2 2 + Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 2 + 2 N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 8
Enzymatik II Analytik von Glucose-xidase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N 2 C 3 N C 3 2 2 + Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 2 + 2 N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 9
Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N N 2 C 3 C 3 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 2 + 2 2 2 + à Keine Aktivität der Glucose-xidase N 2 C 3 Peroxidase C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 10
Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase G 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N 2 C 3 N C 3 2 2 + Peroxidase Katalase 40 C, p = 6,1 2 2 + 2 2 C 3 N 2 C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 11
Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N 2 C 3 N C 3 2 2 + Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 2 + 2 N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 12
Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD 2 2 2 2 N N 2 C 3 C 3 2 2 Katalase 40 C, p = 6,1 honigeigene Glucose in Messlösung 2 + 2 2 2 + à Keine Aktivität der Glucose-xidase N 2 C 3 Peroxidase C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 13
Weitere Parameter im Enzymscreening C 2 N 2 N 2 Saccharase 40 C, p = 6,0 Sistierlösung p = 9,5 N 2 - Saccharase (Invertase) l = 405 nm S 3 - C 3 N + 3 C 3 C C 3 C 3 N N S 3 Na Diastase (α-amylase) Proteingehalt nach Bradford GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 14
Methodenentwicklung à Bestimmung aller Parameter erfolgt photometrisch à Messung aus einer verdünnten oniglösung à Messung mit ARAA (Automatic random access analyzer) à erfolgreiche Methodenvalidierung à Messung aller Proben (n > 500) (theoretische Gesamtinkubationszeit von 286 Arbeitstagen) GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 15
Ergebnisse Enzymatik I n = 507 Median Diastase DZ 20 Saccharase U/kg 74 saure Phosphatase U/kg 4,9 Katalase U/kg 1,55 Glucose- xidase U/kg 1 Protein mg/kg 518 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 16
Ergebnisse Enzymatik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 17
Cluster von Buchweizenhonig à Dimensionsreduktion mittels auptkomponentenanalyse Ergebnisse Enzymatik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 18
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Analytik von Aminosäuren vielfältige Methoden publiziert Aminosäureanalysator PLC / LC-MS (diverse Derivatisierungsmittel) GC-MS (diverse Derivatisierungsmittel) Literatur zu Sortendifferenzierung 7 eng begrenzter Sortenumfang 7 geringer Probenumfang 7 wenig vergleichbar, da verschiedene Parameter GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 20
Aminosäure-Derivatisierung 2 N R 1 + 2 Cl RT, 3-Picolin - 2 Cl, -C 2 N R 1 - Cl - C 2 R 1 R 1 N - Cl N Reaktion mit n-propylchloroformiat* * Nozal, Ma.J., Bernal, J.L., Toribio, M.L., Diego, J.C., Ruiz, A., Journal of Chrom. A, 1047 (2004), S.137 146 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 21
Aminosäure-Derivatisierung 50 µl Probe +interner Std. 100 µl Reagenz Schütteln 100 µl Reagenz + Schütteln +2 min bei 10.000 U/min zentrifugieren 1 min Derivatisierungszeit Phasentrennung GC-MS in 100 µl Lsg.-mittel aufnehmen obere Phase abnehmen und bis zur Trockne abblasen GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 22
Analyten nach Derivatisierung (GC-MS) Aminosäuren Metaboliten Alanin β-alanin Asparagin Anthranilsäure Asparaginsäure Benzoesäure Glutamin α-aminobuttersäure Glutaminsäure β-aminobuttersäure Glycin γ-aminobuttersäure istidin para-coumarsäure Leucin Ferulasäure Iso-Leucin 3,4-Dihydroxybenzoesäure Lysin 3-ydroxybenzoesäure rnithin 4-ydroxybenzoesäure Phenylalanin Kaffeesäure Prolin Mandelsäure Benzoesäure Phenylessigsäure Phenylpropionsäure Alanin Sarcosin Glycin Aminobuttersäure-alpha Sarcosin Phenylessigsäure Tryptophan Phenylmilchsäure Tyrosin Phenylpropionsäure Aminobuttersäure-gamma Methionin Valin Aminobuttersäure-beta Leucin trans-zimtsäure Leucin-Iso Anthranilsäure Asparaginsäure Asparagin 1-ydroxy-keto-2-ionon Mandelsäure 3-ydroxybenzoesäure 4-ydroxybenzoesäure Phenylmilchsäure Prolin Glutaminsäure Phenylalanin 1400000 1200000 1000000 800000 Vanillinsäure Glutamin 4-Quinolinol para-coumarsäure Abscisinsäure rnithin 3,4-Dihydroxybenzoesäure Ferulasäure Lysin 4--Kynurensäure istidin Tyrosin Kaffeesäure Tryptophan Abundance 600000 400000 200000 0 Valin Vanillinsäure trans-zimtsäure 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Retentionszeit [min] Akazienhonig Standard GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 23
Gesamtvarianz Ergebnisse Aminosäureanalytik I - auptkomponentenanalytik 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 2 3 4 8 9 10 7 6 5 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 à mind. 6 auptkomponenten à breite Differenzierung möglich 10% 0% 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Anzahl der auptkomponenten GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 24
Ergebnisse Aminosäureanalytik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 25
Ergebnisse Aminosäureanalytik III Phenylpropanoid-Stoffwechsel 4-ydroxyphenylpyruvat 2 N Tyrosin Prephenylsäure 2 N Phenylpyruvat Phenylalanin trans-zimtsäure Phenylacetaldeyhd para-coumarsäure Phenylmilchsäure Phenylpropionsäure Phenylessigsäure Phenylethanol Ferulasäure Kaffeesäure GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 26
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900 800 700 Phenylalanin-Gehalt [mg/kg] 600 500 400 300 200 100 0 Median aller anderen e onige 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Lavendelhonige GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 28
Charakterisierung von Sortenhonigen mittels Markern onigenzyme Analytik einfach und schnell durchführbar Aminosäuren Analytik in Kombination mit Metaboliten durchführbar Kombination mit weiteren Analysen (Flavonoide ) Problem Bezugspunkt: reiner Sortenhonig à Festlegung von Grenzkriterien GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 29
Danksagung Dr. Cord Lüllmann, Gudrun Beckh Dr. Klaus Beckmann a Nguyen, Vu Raudonis, Steffen Riethmüller Mitarbeiter von QSI Prof. Karl Speer Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.v. GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 30
Danke für Ihre Aufmerksamkeit! Tobias Wiezorek Quality Services International Gmb Am Flughafendamm 9a D-28199 Bremen Fon: +49 421 594770 Mail: info@qsi-q3.de Das Forschungsvorhaben (AiF 16011 BG) wurde im Programm zur Förderung der Industriellen Gemeinschaft (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.v. (FEI) gefördert. GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI 2011 31