Phalloidin-Färbung an kultivierten adhärenten Säugerzellen Formaldehyd-Fixierung
2 Materialien Pinzetten Für das Handling der Zellen ist es empfehlenswert Pinzetten mit sehr feiner Spitze zu nutzen. Hier bieten sich Dumont-Pinzette No 5 (gerade) oder Dumont Pinzette No 7 (gebogen) an (Fig. 1). Fig.1 Dumont-Pinzetten Feuchte Kammer Verschiedene Hersteller bieten feuchte Kammern an, welche meist sehr teuer (>50 ) sind. Alternativ empfehlen wir große Glas-Petrischalen zu kaufen und diese mit einer Auflage für die Deckgläschen (z.b. den Pipettenspitzenhalter aus einer Pipettenspitzenbox) zu versehen (Fig. 2). Fig. 2 Feuchte Kammer
3 Formaldehyd-Lösung! GIFTIG! Zur Fixierung sollte frische gepufferte Formaldehyd-Lösung genutzt werden. Diese sollte aus Paraformaldehyd frisch angesetzt werden. Sie sollte nicht länger als 1-2 Wochen (Lagerung 4 C) verwendet werden. Um die Lösungen länger verwenden zu können, kann man sie auch direkt nach dem Ansetzen bei -20 C/ -80 C einfrieren. Die Formaldehyd-Konzentration die man für die Fixierung verwenden sollte, muss experimentell bestimmt werden. Fluoreszentes Phalloidin! GIFTIG! Phalloidin wird typischerweise lyophilisiert (d.h. als Feststoff) verschickt und sollte anschließend in Methanol (abs.) gelöst werden. Je nach Farbstoff beträgt die Löslichkeit ca. 0,1 0,5 mg/ ml (Methanol). Die Gebrauchslösung sollte anschließend nochmals in wässrigem Puffer auf eine Endkonzentration von ~20-50 µg/ ml verdünnt werden. (Je nach Anwendung, Zelllinie etc. sollte Phalloidin in Konzentrationen zwischen 0,1 und 100 µm in wässigem Puffer verdünnt eingesetzt werden.) Phosphat-Gepufferte Salzlösung (PBS, ph 7 7,5) 137 mm NaCl; 2.7 mm KCl; 10 mm Na 2HPO 4; 2 mm KH 2PO 4 Extraktionslösung Als Extraktionslösungen werden typischerweise Lösungen verwendet die unterschiedliche Detergenzien von Tween20 über Saponin bis SDS enthalten. Für die meisten Anwendungen ist folgende Lösung optimal: PBS + 0,1% 0,5% Trition-X-100 Blockierungslösung Zur Blockierung unspezifischer Bindestellen werden typischerweise Lösungen verwendet die unterschiedliche Proteine enthalten, welche nicht mit Phalloidin interferieren (Milchpulver, Rinder Serum Albumin, Gelatine etc.). Für die meisten Anwendungen ist folgende Lösung optimal: PBS + 1% 5% Rinderserum Albumin Einbettmedium Es gibt eine große Zahl unterschiedlicher Einbettmedien, welche auf die unterschiedlichen Mikroskopie Techniken abgestimmt sind. Für die STED Mikroskopie empfehlen wir folgende Einbett-Medien: - Abberior Mount Liquid Antifade für 3D STED - Abberior Mount Solid Antifade für 2D STED - Mowiol/ DABCO für 2D STED - Prolong Antifade für 2D STED
4 Deckgläschen Als Deckgläschen sollten Glas-Deckgläschen No 1,5 oder No 1,5H verwendet werden diese passen mit einer Stärke von 170 µm am besten zu den Spezifizierungen der für Superresolution Mikroskopie zu meist verwendeten Öl-Immersions-Objektive. Von der Verwendung von Kunststoff-Deckgläschen/ -Probenkammern mit Kunststoffboden ist abzuraten, da bei Verwendung dieser Deckgläschen oftmals nicht optimale Ergebnisse erzielt werden. Von der Verwendung von Deckgläschen mit Vertiefungen, Rastern, Grids etc. ist abzuraten, da es bei der Mikroskopie mit diesen Deckgläschen zu Bildverzerrungen kommen kann und somit oft nicht optimale Ergebnisse erzielt werden. Objektträger Die Objektträger sollten zum verwendeten Probenhalter passen. Super Frost Objektträger oder ähnliche Objektträger sind nicht notwendig. Kunststoff- oder Glas-Petrischalen Zum Fixieren, Waschen etc. Pipetten
5 Durchführung 1. Kultivierung der Zellen Die Zellen werden typischerweise 12 36 h vor der Färbung auf Deckgläschen ausgesät. (Bemerkung 1) 2. Fixierung, Extraktion, Blockierung Deckgläschen werden mit der Zellseite nach oben 5-10 min in Formaldehyd-Lösung fixiert (Bemerkung 2; 3; 4; 5). Danach werden die Deckgläschen mit PBS gewaschen, für 5 min mit PBS/ Triton-X-100 extrahiert (Bemerkung 6; 7; 8) und dann nochmal mit PBS gewaschen. Schließlich erfolgt die Blockierung von unspezifischen Bindestellen mit 2% BSA/ PBS für > 5 min bei RT (Bemerkung 9) in einer Petrischale (2x). 3. Inkubation mit fluoreszenztem Phalloidin Deckgläschen werden aus der Petrischale genommen; überschüssiges BSA/ PBS wird ablaufen gelassen. Deckgläschen wird anschließend in eine feuchte Kammer gelegt. Dann wird das Deckgläschen mit 25 µl verdünnter Phalloidin-Lösung (in PBS/ BSA) überschichtet (Bemerkung 10) und 1 h bei RT in der feuchten Kammer inkubiert. 4. Waschen Die Deckgläschen werden aus der feuchten Kammer genommen. Die Phalloidin-Lösung wird seitlich auf ein Filterpaperier ablaufen gelassen. Anschließend werden die Deckgläschen in eine frische Petrischale mit PBS gelegt (Bemerkung 8; 11; 12). Inkubation für 3x > 5 min bei RT. 5. Einbettung, Lagerung, Stabilität Schließlich wird das Deckgläschen aus der Petrischale genommen. Überschüssiges PBS wird ablaufen gelassen. Die Deckgläschen werden in Einbettmedium ein gedeckelt. Außerdem werden sie an zwei Stellen am Rand mit Nagellack befestigt. (Bemerkung 13) Die Lagerung der fertigen Proben sollte bei 4 C erfolgen. Viele Proben sind nicht dauerstabil. Daher sollten sie nicht länger als eine Woche verwendet werden.
6 Bemerkungen Die wichtigste Regel bei Phalloidin- und Antikörperfärbungen ist, dass die Zellen zu keinem Zeitpunkt austrocknen dürfen. 1. Die Aussat der Zellen kann auch früher erfolgen, falls es nicht anders möglich ist. Je nach Wachstumsgeschwindigkeit, Dauer der Kultivierung und Zelldichte können die Zellen in Mikrokolonien wachsen. Sobald die Zellen konfluent sind, ist oftmals ein hoher Hintergrund in den Zellen sichtbar. 2. Im angegebenen Protokoll werden die Deckgläschen im Gegensatz zu einer Vielzahl von anderen Protokollen NICHT mit PBS gewaschen. 3. Es erfolgt KEINE Präextraktion o.ä.. 4. Die Fixierung erfolgt am besten mit frischem oder eingefroren gelagertem Fixativ. Fertiges 37% Formaldehyd/ Methanol sollte am besten nicht verwendet werden. Methanol, Ethanol oder Aceton sind als Fixative bei Phalloidin-Färbungen nicht möglich. 5. Die Fixierung erfolgt in einem Überschuss an Fixativ (> 1-2 ml/ Deckgläschen). 6. Zur Fixierung können die Deckgläschen in eine frische Petrischale mit Formadehyd-Lösung gelegt werden. Alternativ kann die Fixierung auch in der Petrischale erfolgen in der die Zellen gewachsen sind. Hierzu wird das Medium vollständig verworfen und die Zellen werden mit Formaldehyd-Lösung überschichtet. 7. Deckgläschen mit fixierten Zellen können auch eine gewisse Zeit ~1-2 Tage bei 4 C in PBS gelagert werden. Die Qualität der Färbung könnte aber durch die Lagerung negativ beeinflusst werden. 8. Die PBS-Waschschritte sollten mit einem Überschuss an PBS erfolgen (> 1-2 ml/ Deckgläschen). 9. Die Blockierung sollte mit einem Überschuss an BSA/ PBS erfolgen (> 1-2 ml/ Deckgläschen). 10. Bei der Phalloidin-Inkubation sollten die Deckgläschen nicht mit der Zellseite nach unten auf Parafilm o.ä. gelegt werden. Dies reduziert zwar die notwendigen Phalloidin-Mengen jedoch können die Zellen beim Abziehen vom Parafilm beschädigt werden. 11. Nach den Phalloidin-Inkubationen sollte die Deckgläschen in unterschiedlichen Petrischalen gewaschen werden, da sonst Kreuzkontaminationen erfolgen könnten. 12. Falls der Hintergrund einer Färbung zu hoch ist kann dieser am Ende der Färbung noch durch Inkubation mit PBS/Triton-X-100 oder PBS/BSA reduziert werden. 13. Falls ein Einbett-Medium verwendet werden soll, dass nicht aushärtet, muss das Deckgläschen vollständig mit Nagellack oder Twinsil umrandet werden. Die Verwendung von TDE als Einbett-Medium ist für Phalloidin-Färbungen nicht möglich.
7 Referenzen Wurm, C. A., D. Neumann, R. Schmidt, A. Egner, S. Jakobs: "Sample Preparation for STED Microscopy" Methods Mol. Biol. 591, 185 199