Lehrstuhlvorstellung Molekularbiologie und Biochemie Botanisches Institut 1 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Was machen wir? Wir machen keine Pflanzenphysiologie Wir machen (viel) Gentechnologie und Genetik Pflanze als Modell zur Charakterisierung grundsätzlicher genetischer Mechanismen 2 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Fragestellungen: Genome Engineering auf dem Weg zu naturidentischen Pflanzen und synthetischen Biologie Menschliche Erbkrankheiten (z.b. Brustkrebs) /Mechanismen der Vererbung 3 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
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Einsatz in der klassischen Züchtung DSB Induktion durch physikalische, radioaktive Strahlung Seit 70 Jahren Praxis Nur ungerichtete Mutationen Viele zusätzliche Mutationen im gleichen Genom Erfolg langfristig und nur durch Einsatz vieler Pflanzen 6 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Klassische Mutagenese durch radioaktive Strahlung - Beispiele Grapefrucht Ruby Red gesamte europäische Gerste mehr als 3000 Sorten weltweit Buchweizen 7 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Rekombination in der Natur 8 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Der erste Schritt: Der DSB 9 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
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I-SceI eine hochspezifische molekulare Schere Nucleic Acids Res. 21, 5034-5040. (1993) 11 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Gene Targeting durch DSB Induktion Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 5055-5060. 12 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Einführen von Mutationen durch Non Homologous End Joining mutagen hoch mutagen EMBO J. 19, 5562-5566 (2000) 13 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Elimination von Transgensequenzen cleavage site cleavage site I-SceI mediated DSB induction DSB repair via HR Plant Cell (2002) 14, 1121-1131 14 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Induktion von Chromosmenarm- Austauschen Frequency of translocation: 10-2 to 10-3 Genetics (2007) 175, 21-29 15 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
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Das CRISPR-Cas System: 17 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
CRISPR/Cas induzierte vererbbare spezifische Genomveränderung 18 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Übertragung auf die Nachkommenschaft Über 10% vererbbare Mutationen! 19 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Zitationen (1.5. 2017) 141 Allylalkohol ADH1 Acrylaldehyd 20 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Warum CRISPR/Cas veränderte Pflanzen wissenschaftlich nicht als GVO eingeordnet werden können: Pflanzen mit induzierten und spontanen Mutationen sind nicht unterscheidbar und naturidentisch 21 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Das neue Prinzip für die Züchtung DSB Induktion duch biologische, molekulare Scheren Seit 25 Jahren bei Pflanzen eingesetzt gerichtet, keine bis kaum zusätzliche Off-Target-Mutationen im gleichen Genom Methode ist schnell und effizient 22 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Keine GVOs in Argentinien Kanada, USA 23 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Sichtbarkeit unser Gruppe in der Öffentlichkeit 24 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Charkterisierung weiterer molekularer Scheren CRISPR/Cas Orthologe PAM sequence Streptococcus pyogenes NGG NAG Streptococcus thermophilus NNAGAA NNAGGA Staphylococcus aureus NNGRRT NNGRR(N) Size 4.1 kb 3.4 kb 3.2 kb Nickase D10A, H840A D9A, H599A D10A, N580A 25 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
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S. aureus CRISPR/Cas Effiziente Induktion von vererbaren Mutationen 27 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
S. aureus CRISPR/Cas Efficient Induction of Heritable Events in the F2 28 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
S. aureus CRISPR/Cas Mutationen in der F2 Plant Journal (2015) 84, 1295 1305 29 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Zitationen (1.5. 2016) 97 CAS9-D10A mutant 30 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Höhere Sepzifität : Der CRISPR/Cas Gepaarte Nickase-Ansatz zur Mutagenese Ran et al., 2013 Nickase + 2 sgrnas 2 SSB in gegenläufigen Strängen = DSB 5 Überhang, 30 bp Abstand Dramatisch erhöhte Spezifität 31 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Vererbare Mutationen durch den gepaarten Nickase-Ansatz: 32 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Overrepresentation of Tandem Insertions in the Rice Genome Vaughn and Bennetzen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2014) 111, 6685-6689 33 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
CRISPR/Cas paired nickases can be applied genomewide: 34 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
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Was bringt die Zukunft? Multidimesionale Verwendung von Cas9 37 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
dcas9 as DNA Binding Protein CAS9-double mutant 38 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Verschiedene Enzymaktivitäten können durch Cas9-Fusions gesteuert werden 39 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
dcas9 kann jede Enzymaktivität an spezifische Stellen im Genom bringen Sp-dCas9 Activity 1 Sp-sgRNA Fusion von dcas9 mit anderen Enzymaktivitäten hier Rotfluoreszenz Nachweis von Chromosomenenden 40 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Synthetische Biologie durch Anwendung mehrerer Cas9s in einer Einzelzelle Activity 1 Sp-dCas9 Sp-sgRNA Activity 2 Jedes Cas9 Enzym sollte in der Lage sein nur seine spezifische sgrna zu erkennen Sa-dCas9 Sa-sgRNA 41 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
1D A A 2D A A B B C C D D 3D A A E E I I B B F F J J C C G G K K D D H H L L 42 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Komplette Neuausrichtung der Genexpression einer Zelle Gene Genprodukte Starker Aktivator A-Z A-Z ++ A-Z Schwacher Aktivator a-z a-z + a-z Schwacher Repressor a-z a-z _ a-z Starker Repressor a-z a-z a-z 43 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Pflanzenzüchtung Positive Eigenschaften sollen von Wildauf Kulturpflanzen übertragen werden Negative Eigenschaften sollen eliminiert werden Trennung verschiedener Eigenschaften 44 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Meine Vision: Konstruktion der landwirtschaftlich optimalen Pflanze aus dem gesamten Genpool einer Spezies 45 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Riesige Genpools in Samenbanken 46 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Schnelle Genomsequenzierung Beispiel: Mais 47 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Aktuelle Forschung: Restrukturierung von Chromosomen Plant Journal (2014) 78, 727 741 Fixierung optimaler Genkombinationen durch gesteuerte Vererbung 48 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Können wir meiotische Rekombination kontrollieren? Wildtyp Meiose SPO11-1/2: DSB Indukiton Spezifische DSB Induktion Induktion eines zusätzliche DSBs Totale Kontrolle nur spezifische DSBs 49 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Anwendung: Kulturpflanze Tomate 50 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Wichtigster Europäischer Forschungspreis 51 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Vorbereitungsmodul/Bachelorarbeit M-Seminare: Pflanzliche Molekularbiologie Replikation/Reparatur/Rekombination F2/F3: Genome Engineering F2: Proteinbiochemie Masterarbeit Promotion Unser Lehrangebot: Weitere Infos: http://www.botanik.kit.edu/molbio/ 52 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017
Danke!! Advanced Grant COMREC 2011-2016 Advanced Grant CRISBREED 2017-2022 53 Holger Puchta Vorstellung Lehrstuhl Molekuarbiologie und Biochemie der Pflanzen SS 2017