Inhaltsverzeichnis Was ist Dialyse 3 Vorteile der Dialyse 4 Anwendungen 4 Nachteile der Dialyse 4 Tipps zur Anwendung 4 Erklärung von Begriffen 6 scienova Xpress Micro Dialyzer 7 Anwendungsmöglichkeiten für scienova Xpress Micro Dialyzer 8 Handhabung der scienova Xpress Micro Dialyzer 9 Produkt- und Bestellübersicht 10 Anhang: Chemikalienverträglichkeit 13 2
Was ist Dialyse? Dialyse ist der Transport einer Substanz mithilfe der Diffusion von einer hohen Konzentration zu einer niedrigeren durch eine semipermeable Membran. Aufgrund spezifischer Eigenschaften (Porengröße) der semi-permeablen Membran können beispielsweise nur Substanzen mit bestimmten Eigenschaften (Molekulargewicht, Ladung) diese passieren. Die Diffusion und damit der Stofftransport gehen bis zum Konzentrationsausgleich (Equilibrium) weiter. Dies kann genutzt werden, um große Moleküle wie Proteine oder DNA von störenden kleineren Molekülen zu trennen oder umzupuffern. Ein Beispiel: Ein Protein befindet sich in einer konzentrierten Natriumchloridlösung (ionische Verun-reinigung in Abb. 1). Der NaCl-Gehalt stört bei einer vorgesehenen Analytik oder verhindert die Proteinaktivierung. Die Probe wird in eine Dialysevorrichtung mit einer semipermeablen Membran gebracht und gegen ein größeres Volumen eines Puffers dialysiert. Nur die Ionen können die Poren passieren, die Proteinmoleküle hingegen nicht. Durch die Dialyse wird die Konzentration des NaCl deutlich herabgesetzt. Wird der Dialysepuffer mehrfach gewechselt, kann die NaCl-Konzen-tration theoretisch beliebig weit verringert werden. Abb. 1 Schema der Dialyse eines Proteins. 3
Vorteile der Dialyse: Sehr schonende Methode für empfindliche Verbindungen wie Proteine (Erhalt der katalytischen Aktivität) Einfach in der Anwendung Meist mit der Standardlaborausrüstung durchführbar Viele Membranvarianten verfügbar (Porengröße, Material) Einwegartikel (Disposables) verfügbar Geringe Volumenänderung der Probe Kein Filterkuchen (Proben-Ablagerungen auf der Membran) Anwendungen: Entsalzung von Proteinen oder anderen Makromolekülen Umpufferung von Proteinen oder anderen Makromolekülen Renaturierung / Denaturierung von Proteinen Bindungsstudien zwischen Makromolekülen und kleineren Liganden (z.b. Wirkstoffen) Charakterisierung von Nanopartikeln Fraktionierungen in Lösungen Konzentrierung von Proteinen oder anderen Makromolekülen Elektroelution aus Gelen Entfernung störender Substanzen, z.b. Harnstoff Nachteile der Dialyse: In klassischer Form im Schlauch oder mit älteren Dialysevorrichtungen vergleichsweise hoher Zeitbedarf (scienova Xpress Micro Dialyzer verringern Zeitaufwand deutlich) Der Stofftransport nimmt mit verringerten Konzentrationsunterschieden ab Mitunter Volumeneffekte durch osmotischen Druck Tipps zur Anwendung: Die folgenden Tipps sind zur schnellen Orientierung des Anwenders gedacht. Für den theoretischen Hintergrund gibt es einen separaten Abschnitt. Konzentration der zu entfernenden Substanz Der Stofftransport ist konzentrationsabhängig. Deshalb läuft die Entfernung des störenden Stoffs am Anfang am schnellsten. Zum Erhalt eines hohen Unterschiedes der Konzentration kann: (1.) Das Volumen des Dialysepuffers im Vergleich zur Probe sehr hoch gewählt werden (Dialyse von 5 ml Probe gegen 5 l Dialysepuffer), oder (2.) Der Dialysepuffer regelmäßig gewechselt werden (bei einer Entsalzung, Wechsel des Dialysepuffers alle 30 min). Temperatur Die Dialysegeschwindigkeit steigt mit der Temperatur. Hier sind enge Grenzen gesetzt, da die Probe (Proteine) höhere Temperaturen häufig nicht verträgt (Denaturierung). Im Allgemeinen sollte die Dialyse bei Raumtemperatur stattfinden, falls die Probe dies ermöglicht. Bei empfindlichen Proben sollte die Dialyse im Kühlraum oder Kühlschrank erfolgen. Hierbei daran denken, dass die Dialysezeit länger als bei Raumtemperatur ist (Abbildung 2). Dialysedauer Die Dialysedauer kann nicht generell angegeben werden. Sie hängt von dem zu dialy- 4
sierenden Substanzen, ihrer Konzentration, der Membran, der Diffusionsstrecke, der Temperatur und der angestrebten Endkonzentration der durch Dialyse zu entfernenden Substanz, kurz den konkreten Bedingungen ab. Manche Hersteller, wie scienova geben Beispielprotokolle an (technisches Datenblatt). Daran kann man sich bei der Dialyse gleicher oder ähnlicher Substanzen orientieren. Sollten diese Hinweise nicht vorliegen, muss durch einen Vortest ermittelt werden, wie viel Zeit unter den Bedingungen bis zum Erreichen der gewünschten Konzentration in der Probe erforderlich ist. Membran und ihre Auswahl Der Fluss durch die Membran hängt von der Größe der aktiven Oberfläche im Verhältnis zum Probenvolumen und der Porengröße und Porosität der Membran ab. Je größer die aktive Oberfläche im Verhältnis zum Probenvolumen ist, desto schneller erfolgt die Dialyse der Substanzen. Die aktive Oberfläche ist vom Hersteller vorgegeben und damit kaum vom Nutzer beeinflussbar. XPRESS Micro Dialyzer (MD) von scienova TM haben eine sehr große aktive Oberfläche im Verhältnis zum Probenvolumen und gewährleisten dadurch eine sehr hohe Dialysegeschwindigkeit. Der cutoff, d.h. der Porendurchmesser in der Membran, sollte möglichst so groß gewählt werden, dass er die zurückzuhaltende Substanz, z.b. ein Protein, gerade nicht passieren lässt. Cutoffs werden in Dalton (Da oder kda) angegeben. Sie entsprechen dem Molekulargewicht der Substanz. Faustregel: das Molekül, das zurückgehalten werden soll, sollte als Molekulargewicht mindestens den zweifachen Cutoff haben. Moleküle, die effektiv entfernt werden sollen, sollte ein Cutoff größer als die Hälfte des Molekulargewichts gewählt werden. Hierbei ist zu beachten, dass sich die angegebene Porengröße auf globuläre Moleküle bezieht und für kettenförmige beträchtlich abweichen kann. Das Membranmaterial sollte die zu dialysierenden Substanzen möglichst nicht binden. Für Proteine haben sich besonders regenerierte Cellulose (RC) und Celluloseester (CE) bewährt. Diffusionsstrecken Die Diffusion ist die Grundlage des Stofftransports der Dialyse. Die Diffusion ist stark abhängig von der Strecke über die sie erfolgt. Der Zeitbedarf der Dialyse steigt mit der Diffusionsstrecke exponentiell an. Deshalb sollte auf kürzeste Diffusionsstrecken, wie sie in den XPRESS Micro Dialyzern von scienova TM realisiert sind, geachtet werden (Abb. 3). Falls die Möglichkeit besteht, sollte der Stofftransport durch Rühren der Probe im Dialysepuffer (gute Durchmischung) verstärkt werden. Üb-lich ist die Verwendung eines Magnetrührers zur Durchmischung. 5
Dialysepuffer Der Dialysepuffer ist die Lösung, in die die zu dialysierende Probe mit der Dialysevorrichtung kommt. Sie enthält häufig puffernde Substanzen, Salze und stabilisierende Verbindungen, um Proben wie Proteine zu stabilisieren und zu hohe osmotische Drücke zu verhindern. viele Salze kürzer wählen, als z.b. für Farbstoffe mit typischen Molekulargewichten von 200-500 Da oder von Peptiden. Für Proteine sind häufig verwendete Dialysepuffer: Wasser, Phosphatpuffer, Tris, Hepes, MOPS oder PBS. Stabilisierende Zusätze können EDTA, Aminosäuren, Kofaktoren oder Inhibitoren sein. Stoffabhängigkeit der Dialyse Die Diffusionsgeschwindigkeit hängt von der Größe des Moleküls, genauer dem hydrodynamischen Durchmesser, ab. Als Faustregel gilt, dass kleine Moleküle deutlich schneller diffundieren im Gegensatz zu großen Molekülen. Deshalb kann man die Dialysezeit für Erklärung von Begriffen Diffusion in Lösungen Diffusion beruht auf der ungerichteten Brown schen Molekularbewegung oder Wärmebewegung. Durch diese Bewegung werden Konzen-trationsgradienten in Lösungen ausgeglichen. Quantitativ wird der Teilchenstrom durch das erste Fick sche Gesetz beschrieben. J = -D c x J: Teilchenstromdichte D: Diffusionskoeffizient (abhängig von der Temperatur, dem hydrodynamischer Radius der Teilchen, der Viskosität des Lösungsmittels und der Boltzmann-konstante) c: Konzentration x: Länge des Diffusionswegs Semipermeable Membran Membran mit selektiven Durchlass für bestimmte Teilchenspezies. In der Dialyse werden Membranen mit Poren verwendet, die eine bestimmte Größenverteilung der Poren aufweisen und damit selektiv Teilchen nach ihrer 6
Größe passieren lassen oder zurückhalten. Die Trennschärfe zwischen Teilchen ist umso höher, je definierter die Porengröße der Membran gestaltet ist. Osmotischer Druck Beim Vorliegen eines Konzentrationsgradienten von Teilchen zwischen zwei durch eine semipermeable Membran getrennten Bereichen kann das Lösungsmittel von der Seite der niedrigen Konzentration auf die Seite der höheren Konzentration diffundieren. Dies vergrößert das Volumen auf der Seite der höheren Konzentration. Anlegen eines Drucks auf der Seite der höheren Konzentration kann den Lösungsmitteltransport verhindern. Der hierfür erforderliche Druck ist der osmotische Druck. Bei der Dialyse von Proben hoher Konzentration gegen niedermolekulare Dialysepuffer können hohe Volumentransporte und osmotische Drücke auftreten. Scienova Xpress Micro Dialyzer Eigenschaften der scienova Xpress Micro Dialyzer Membran aus regenerierter Cellulose geringe Probenverluste (<15 %) Abb. 4 MD100 Microdialyzer Riegel aus 8 Einzelsegmenten Skalierbar für 1-96 Proben Die scienova Xpress Micro Dialyzer zeichnen sich durch ein günstiges Membranflächen/Volumenverhältnis aus. Durch eine kurze Diffu- Micro Dialyzer ist eine einfache Handhabung besonders kleiner Volumina gewährleistet. Die Micro Dialyzer sind in unterschiedlichen Größen mit verschiedenen Ausschlussgrößen MD100 MD300 Probenvolumen 10-100 µl 50-300 µl Kompatibel mit Microplate Standard (SBS) Dialysemembran aus regenerierter Cellulose Geeignet für wässrige Lösungen Verfügbare Ausschlussgrößen (MWCO): 3,5; 6-8; 12-14 kda Temperaturbereich: 1-60 C Ausschlussgrößen 3,5; 6-8; 12-14 kda ph-wert-bereich: 3-10 Riegel / Einzelsegmente erhältlich (Siehe Tabelle). x / x x / x Lagerung bei 4-22 C kompatibel mit einer Vielzahl an chemischen Verbindungen (siehe Anhang) 7
Anwendungsmöglichkeiten für scienova XPRESS Micro Dialyzer 8
Handhabung der scienova Xpress Micro Dialyzer 9
Produkt- und Bestellübersicht scienova Micro Dialyzer Bestellnummer Größe Cutoff Probenzahl Preis (netto) 40072 MD100 3,5 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 330,94 40071 10-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 29,36 40782 12 (12 Einzelsegmente) 38,76 40071-X56 56 (56 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 40071-X280 280 (280 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 164,93 551,57 40076 MD100 6-8 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 330,94 40075 10-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 29,36 40783 12 (12 Einzelsegmente) 38,76 40075-X56 56 (56 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 40075-X280 280 (280 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 164,93 551,57 40078 MD100 12-14 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 330,94 40077 10-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 29,36 40784 12 (12 Einzelsegmente) 38,76 40077-X56 56 (56 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 40077-X280 280 (280 Einzelsegmente), inkl. 96er- Univeralrack und Pinzette 164,93 551,57 40787 MD300 3,5 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 364,03 40786 50-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 32,30 40786-X12 12 (12 Einzelsegmente) 43,50 40789 MD300 6-8 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 364,03 40788 50-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 32,30 10
Bestellnummer Größe Cutoff Probenzahl Preis (netto) 40788-X12 12 (12 Einzelsegmente) 43,50 40791 MD300 12-14 kda 96 (12 x 8 Riegel), in Deep-well Platte 364,03 40788 50-100 µl Probevolumen 8 (1 Riegel) 32,30 40788-X12 12 (12 Einzelsegmente) 43,50 scienova Micro Dialyzer - Musterboxen Kostengünstig, zum Ausprobieren unserer Micro Dialyzer Bestellnummer Wählbarer Inhalt Preis (netto) SBMD1 SBMD2 SBMD3 SBMD4 1 Riegel (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 1 Riegel und ein Einzelsegment (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 3 Einzelsegmente mit 3 verschiedenen Cutoffs (Größe nach Wahl) 3,5; 6-8; 12-14 kda 2 Riegel und 2 Einzelsegmente (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 24,66 29,04 13,14 58,09 Zubehör Bestellnummer Wählbarer Inhalt Preis (netto) SBMD1 SBMD2 SBMD3 1 Riegel (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 1 Riegel und ein Einzelsegment (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 3 Einzelsegmente mit 3 verschiedenen Cutoffs (Größe nach Wahl) 3,5; 6-8; 12-14 kda 24,66 29,04 13,14 11
Bestellnummer Wählbarer Inhalt Preis (netto) SBMD4 2 Riegel und 2 Einzelsegmente (Größe und Cutoff nach Wahl) 3,5; 6-8 oder 12-14 kda 58,09 12
Anhang Auflistung von Chemikalien, die auf Verträglichkeit mit den Dialysemembranen der scienova Xpress Micro Dialyzer getestet wurden. Das Testverfahren ist unter der Tabelle 1 aufgeführt. Tab. 1 Chemische Verträglichkeit Aceton Ethylenglykol Phosphorsäure 85 % Acetonitril Flussäure 50 % 1-Propanol Ameisensäure 25 % Glycerol iso-propanol Ameisensäure 100 % Kaliumhydroxid 32 % Salpetersäure > 25 % Ammoniumhydroxid 1 N Kaliumhydroxid 1 N Salzsäure > 25 % Ammoniumhydroxid 25 % Methanol 98 % Salzsäure 10 % Chloroform Methylenchlorid Schwefelsäure 98 % Dimethylsulfoxid n-hexan Tetrahydrofuran Essigsäure 96 % Natriumhydroxid 1 N Toluen Ethanol 98 % Natriumhydroxid 32 % Wasserstoffperoxid 30 % Ethylacetat Phosphorsäure 25 % gut eingeschränkt keine Gute chemische Resistenz Limitierte chemische Resistenz (z.b. Porengröße kann garantiert werden) Keine chemische Resistenz, Anwendung wird nicht empfohlen Testbedingungen: MWCO 3,5; 6-8; 12-14 kda; Probe: 100 µl Kongorot, wässrige Lösung A. dest., Dialyselösung: 1,4 ml getestete Chemikalie (siehe Tabelle), Dialysedauer: 18 h, Bestimmung der optischen Integrität und Dichtigkeit mittels Druckmessung (+0,2 bar). 13
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