ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC T-1071-40 40 Für die chromogene in situ Hybridisierung (CISH) unter Verwendung einer beliebigen Biotin-markierten ZytoFast- CISH-Sonde Nur für Forschungszwecke bestimmt.
Stand: 23. Mai 2016 (5.1) Warenzeichen: ZytoVision und ZytoFast sind Warenzeichen der ZytoVision GmbH.
Inhalt 1. Bestimmung der Anwendung... 1 2. Prinzip der Methode... 1 3. Sicherheitshinweise und Entsorgung... 2 4. Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC... 3 4.1 Komponenten... 3 4.2 Lagerung und Haltbarkeit... 3 4.3 Untersuchungsmaterial... 4 4.4 Zusätzlich benötigtes Material... 4 4.5 Wichtige Informationen... 5 5. Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC Protokoll... 5 5.1 Vorbereitende Schritte... 5 5.2 Vorbehandlung (Entparaffinieren/Proteolyse)... 5 5.3 Denaturierung und Hybridisierung... 7 5.4 Post-Hybridisierung und Detektion... 7 6. Interpretation der Ergebnisse... 9 7. Literatur... 10 8. Probleme und mögliche Ursachen... 11
1. Bestimmung der Anwendung Das ZytoFast PLUS CISH Implementation Kit HRP-AEC ist für den Nachweis Biotin-markierter ZytoFast-CISH-Sonden in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebe- oder Zellproben mittels chromogener in situ Hybridisierung (CISH) bestimmt. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke und nicht für den Gebrauch in diagnostischen Anwendungen bestimmt. 2. Prinzip der Methode Das Vorkommen bestimmter Nukleinsäuresequenzen in Zellen oder Geweben kann mit Hilfe markierter DNA-Sonden durch in situ Hybridisierung nachgewiesen werden. Die Hybridisierung führt zur Duplexbildung zwischen im Untersuchungsgegenstand vorliegenden Sequenzen und der entsprechenden Sonde. Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC ist zur Verwendung mit einer beliebigen, separat erhältlichen, Biotin-markierten ZytoFast-CISH-Sonde bestimmt. Die Duplexbildung der Biotin-markierten Sonde wird durch HRP-konjugiertes Streptavidin nachgewiesen. Die enzymatische Umsetzung von AEC (3-Amino-9- ethylcarbazol) führt zur Entstehung starker roter Signale, die lichtmikroskopisch mit einer 10- oder 20x-Trockenlinse dargestellt werden können. - 1 -
3. Sicherheitshinweise und Entsorgung Bedienungsanleitung vor Durchführung der Anwendung lesen! Reagenzien nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht mehr benutzen! Kreuzkontaminationen und mikrobakterielle Kontaminationen der Reagenzien vermeiden! Einige der System-Komponenten enthalten gesundheitsgefährdende Stoffe in geringen Konzentrationen und Volumina. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien muss vermieden werden. Entsprechende Schutzmaßnahmen sind zu treffen (Benutzung von Einmalhandschuhen, Schutzbrille und Laborbekleidung)! Bei Kontakt mit den Reagenzien müssen die betroffenen Stellen sofort mit viel Wasser gespült werden! Niemals Lösungen mit dem Mund pipettieren! Die Entsorgung der Reagenzien unterliegt den örtlichen Regularien! Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage für den berufsmäßigen Verwender erhältlich! - 2 -
4. Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC 4.1 Komponenten Das Kit besteht aus folgenden Komponenten: Code Komponente Menge Gefäß PF5 ZytoFast DNA (+) Control Probe 0,1 ml Reaktionsgefäß, blauer Deckel PF8 ZytoFast DNA (-) Control Probe 0,1 ml Reaktionsgefäß, weißer Deckel PF51 ZytoFast 28S rrna (+) Control Probe 0,1 ml Reaktionsgefäß, blauer Deckel PF7 ZytoFast RNA (-) Control Probe 0,1 ml Reaktionsgefäß, weißer Deckel ES1 Pepsin Solution 4 ml Tropfflasche, weißer Verschluss WB5 20x Wash Buffer TBS 40 2x 50 ml Schraubdeckelflasche AB10 HRP-Streptavidin 4 ml Tropfflasche, grüner Verschluss SB5 AEC Solution 4 ml Tropfflasche, roter Verschluss Gebrauchsanleitung 1 Die Komponenten EbpNF, E^_NMF und Ep_RF sind ausreichend für 40 Anwendungen. Die Komponenten EmcRF, EmcRNF, EmcTF und EmcUF sind ausreichend für 10 Anwendungen. Die Komponente Et_RF ist ausreichend für 28 Küvetten à 70 ml. 4.2 Lagerung und Haltbarkeit Die Bestandteile des Kits müssen bei 2 8 C gelagert werden. Unter den angegebenen Lagerungsbedingungen sind die Komponenten des Kits bis zu den auf den einzelnen Etiketten angegebenen Haltbarkeitsdaten stabil. - 3 -
4.3 Untersuchungsmaterial Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC ist auf formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe- und Zellproben optimiert. Die Verwendung des Kits für andere Gewebe- und Zellproben (z. B. Methanol/Eisessig-fixierte Zellen oder Zellausstriche) ist grundsätzlich möglich; abweichend fixiertes oder eingebettetes Untersuchungsmaterial kann allerdings die Anpassung des Protokolls durch den Anwender erfordern. Eine notwendige Anpassung wird von unseren Experten gerne unterstützt. Wir empfehlen folgende Gewebeaufbereitung: Fixierung in 10% neutralgepuffertem Formalin für 24 h bei RT Um eine optimale und gleichmäßige Fixierung und Paraffineinbettung zu erzielen, sollte die Probengröße nicht mehr als 0,5 cm 3 betragen. Standardmäßige Prozessierung und Paraffineinbettung Benutzen Sie qualitativ hochwertiges Paraffin. Die Infiltration und Einbettung sollte bei Temperaturen unter 65 C stattfinden. Mikrotomschnitte von 3-5 µm-schnittdicke anfertigen Ziehen Sie die Schnitte auf Silan-beschichtete Objektträger oder Adhäsions- Objektträger (z. B. HistoBond ) und fixieren Sie für 2-16 h bei 50-60 C. 4.4 Zusätzlich benötigtes Material Folgende Reagenzien, Materialien und Geräte sind nicht im Kit enthalten: Reagenzien und Materialien Geräte - Biotin-markierte ZytoFast-CISH-Sonde - Klebepistole mit Heißkleber oder Rubber Cement (Fixogum) - Ethanol 100%, vergällt - Deionisiertes oder destilliertes Wasser - Xylol - Gegenfärbelösung - Wässriges Eindeckmedium - Wasserbad (55 C) - Wärmeplatte - Hybridisierungsofen (Wärmeschrank) - Waschküvetten, 50-80 ml - Feuchte Kammer - Pipette (10 µl) - Deckgläser (22 mm x 22 mm, 24 mm x 32 mm) - 4 -
- Lichtmikroskop 4.5 Wichtige Informationen Folgende Dinge sind zu beachten: Die Gewebe- und Zellschnitte dürfen während der Hybridisierungs- und Waschschritte nicht austrocknen! Die in der Anleitung beschriebenen Temperaturen für Denaturierungen und Waschungen sollten generell eingehalten werden. Abhängig vom Alter und von der Fixierung des Untersuchungsmaterials kann jedoch eine Erhöhung oder Absenkung der Denaturierungs- bzw. Waschtemperaturen zu einer Verbesserung der Hybridisierungsergebnisse führen! 5. Das ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC Protokoll 5.1 Vorbereitende Schritte Herstellung des 1x Wash Buffer TBS: 1 Teil 20x Wash Buffer TBS Et_RF mit 19 Teilen deionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen. Verdünnter 1x Wash Buffer TBS ist bei 2-8 C eine Woche haltbar. 1x Wash Buffer TBS: Eine Küvette mit 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) vorbereiten und in einem Wasserbad auf 55 C erhitzen. ZytoFast DNA (+) Control Probe EmcRF, ZytoFast DNA (-) Control Probe EmcUF, ZytoFast 28S rrna (+) Control Probe EmcRNF, ZytoFast RNA (-) Control Probe EmcTF: Vor Gebrauch auf Hybridisierungstemperatur bringen.= Pepsin Solution EbpNF, HRP-Streptavidin E^_NMF, AEC Solution Ep_RF: Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. 5.2 Vorbehandlung (Entparaffinieren/Proteolyse) N. Objektträger für 10 min bei 70 C inkubieren (z. B. auf einer Wärmeplatte) OK= PK= Jeweils 2x 5 min in Xylol inkubieren Jeweils 3x 3 min in 100% Ethanol inkubieren Alternativ können auch andere Entparaffinierungsprotokolle aus der Routine- Immunhistochemie verwendet werden, wie z. B. 2x 15 min Xylol, 2x 5 min 100% Ethanol, 2x 5 min 96% Ethanol, 1x 5 min 70% Ethanol. Schnitte an der Luft trocknen lassen - 5 -
QK= Pepsin Solution EbpNF gewebe-/zellbedeckend (tropfenweise) auf die Objektträger aufträufeln und bei 37 C für 20-30 min in einer feuchten Kammer inkubieren Abhängig von mehreren Faktoren, z. B. von der Art und Dauer der Fixierung, der Dicke der Schnitte und der Art des Gewebes/der Zellen können unterschiedliche Inkubationszeiten notwendig sein. Als Richtwert kann bei Gewebeproben eine Inkubation von 10-30 min angegeben werden und 5-10 min bei Zellproben Generell empfehlen wir die optimale Proteolysezeit in Vortests zu bestimmen. RK= Objektträger in deionisiertes oder destilliertes Wasser tauchen und anschließend Wasser abtupfen oder ablaufen lassen Anschließend die Schnitte an der Luft trocknen lassen - 6 -
5.3 Denaturierung und Hybridisierung NK= Die ZytoFast-CISH-Sonde vortexen und je 10 µl auf verschiedene Schnitte des Untersuchungsmaterials pipettieren Sonde tropfenweise auf der gesamten Zielfläche verteilen, um eine lokale Konzentration der Sonde zu vermeiden. Alternativ Sonde in die Mitte des Deckgläschen geben, Deckglas umdrehen und auf Schnitt legen. OK= Die Schnitte mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm) luftblasenfrei abdecken und versiegeln. Deckglasränder z. B. mit einer Schicht Heißkleber mit Hilfe einer Klebepistole oder mit Rubber Cement abdichten PK= Die Objektträger für 5 min bei 75 C (z. B. auf einer Wärmeplatte) denaturieren QK= Die Objektträger in eine feuchte Kammer überführen und zur Hybridisierung (z. B. in einem Wärmeschrank) für 60 min bei folgenden Temperaturen inkubieren: 37 C für DNA-nachweisende Sonden oder 55 C für RNA-nachweisende Sonden Die Gewebe-/Zellschnitte dürfen während der Hybridisierung nicht austrocknen. 5.4 Post-Hybridisierung und Detektion NK= Rubber Cement oder Heißkleber vorsichtig entfernen= OK Deckgläser durch Eintauchen in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) für 5 min bei RT entfernen PK= Lässt sich nur die Versiegelung entfernen und die Deckgläser bleiben auf dem Objektträger zurück, können sie in diesem Waschschritt mit dem Waschpuffer abgespült werden. In diesem Fall sollte der Waschschritt auf 10 min verlängert werden. 5 min in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) bei 55 C waschen 1x Wash Buffer TBS sollte ausreichend vorgewärmt sein. Gegebenenfalls Temperatur mit einem Thermometer überprüfen. Die Temperatur der Lösung wird durch die Anzahl der eingestellten Objektträger beeinflusst. Wir empfehlen stets die gleiche Anzahl von Objektträgern zu verwenden. Dafür bei Bedarf leere Objektträger verwenden. Nicht mehr als 8 Objektträger pro Küvette verwenden. QK 5 min in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) bei RT waschen - 7 -
RK HRP-Streptavidin E^_NMF tropfenweise (1-2 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 30 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren SK Jeweils 2x 2 min in 1x Wash Buffer TBS (hergestellt aus t_r) und 1x 2 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen= TK AEC Solution Ep_RF tropfenweise (1-2 Tropfen/Objektträger) auf die Objektträger aufträufeln und für 10-20 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren Die Beobachtung der Farbentwicklung in Zeitabständen von 5-10 min unter dem Mikroskop wird empfohlen. UK Jeweils 3x 2 min in deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen VK= Eindeckeln der Schnitte Wir empfehlen das Eindeckeln der Schnitte in einem wässrigen Einbettmedium. NMK= Die Auswertung des Untersuchungsmaterials erfolgt an einem Lichtmikroskop - 8 -
6. Interpretation der Ergebnisse Die ZytoFast CISH Implementation Kit HRP-AEC-Prozedur führt zu deutlich von der Hintergrundfärbung zu unterscheidenden roten Farbpräzipitaten in den von der ZytoFast-CISH-Sonde adressierten Zellen. Abhängig davon, ob die verwendeten Sonden RNA oder DNA nachweisen, wird ein positiver Nachweis in der Zielzelle durch eine rote Färbung des Zytoplasmas oder des Nukleus angezeigt. Für weiterführende Informationen zu den zu erwartenden Signal-Mustern beachten Sie bitte auch die Packungsbeilage der verwendeten Sonde. Die Visualisierung der Signale sollte mit einem 10x- oder 20x-Objektiv erfolgen. Für die Beurteilung der Signale sollten nekrotische, degenerierte oder überverdaute Zellen vermieden werden, da diese häufig unspezifisch gefärbt werden. Um die Spezifität der Hybridisierungssignale sowie den korrekten Verlauf der Methode zu beurteilen, sollten bei jeder Hybridisierung Kontrollen mitgeführt werden. Wir empfehlen mindestens einen Kontrollschnitt mit erwiesenermaßen korrekt positiv und negativ färbenden Zellen mitzuführen. Ein negatives oder unspezifisches Ergebnis kann verschiedene Ursachen haben. Für die Fehlerbehebung siehe Kapitel 8. Die Kontrollsonde ZytoFast 28S rrna (+) Control Probe EmcRNF besteht aus Biotin-markierten Oligonukleotiden, die gegen Sequenzen einer großen Untereinheit ribosomaler RNA (28S rrna) gerichtet sind. Starke Hybridisierungssignale im Zytoplasma der Zellen bestätigen die Integrität zellulärer mrna des Untersuchungsmaterials. Die Kontrollsonde ZytoFast DNA (+) Control Probe EmcRF besteht aus Biotinmarkierten Oligonukleotiden, die gegen humane repetitive Alu-Sequenzen gerichtet sind. Starke Hybridisierungssignale in den Nuklei der Zellen bestätigen die Integrität zellulärer DNA des Untersuchungsmaterials. Die Kontrollsonden ZytoFast RNA (-) Control Probe EmcTF und ZytoFast DNA (-) Control Probe EmcUF bestehen aus verschiedenen Biotin-markierten Oligonukleotiden mit einem GC-Gehalt von 40-70% ohne bekannte Homologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen. Diese Sonden sollten nicht zu positiven Farbpräzipitaten führen und werden zur Abschätzung der unspezifischen Hintergrundfärbung verwendet. - 9 -
7. Literatur Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN 0 19 963327 4-10 -
8. Probleme und mögliche Ursachen Jede Abweichung von den Vorgaben der Bedienungsanleitung kann zu einem fehlenden oder zu schwachen Färbeergebnis führen. Problem Mögliche Ursache Maßnahme Schlieren auf dem OT nach Abstoppen der Pepsinbehandlung Schwaches oder kein Signal Ungleichmäßige, z. T. schwache Färbung Kreuzhybridisierungssignale; hohe Hintergrundfärbung Schnitt löst sich vom Objektträger Präzipitatbildung Keine Zielsequenzen vorhanden oder Zielsequenzen unterhalb der Nachweisgrenze Geringe Menge Zielsequenzen vorhanden Fixierung der Gewebe-/Zellprobe nicht optimal Proteolytische Vorbehandlung nicht optimal Denaturierungstemperatur nicht korrekt Hybridisierungstemperatur nicht korrekt Hybridisierungszeit zu kurz Inkubationszeit mit chromogenem Substrat zu kurz Sofortiges Waschen der OT in deionisiertem oder destilliertem Wasser Verwendung geeigneter Kontrollen Verlängerung der Hybridisierungszeit und der Antikörper-Inkubationszeit Optimierung der Fixierungszeit Optimierung der Inkubationszeit Temperatur überprüfen und ggf. erhöhen od. absenken Temperatur überprüfen Hybridisierungszeit verlängern Verlängerung der Inkubationszeit Unvollständige Entparaffinierung Frische Lösungen verwenden, Entparaffinierungszeiten überprüfen Unvollständige Entparaffinierung Frische Lösungen verwenden, Entparaffinierungszeiten überprüfen Aufgetragenes Sondenvolumen pro Areal zu groß Proteolytische Vorbehandlung zu stark Dehydrierung der Schnitte zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Waschtemperatur nach der Hybridisierung zu niedrig Proteolytische Vorbehandlung zu stark Ungeeignete Objektträgerbeschichtung Reduktion des Sondenvolumens pro Schnitt/Areal, Auftragung der Sonde tropfenweise um lokale Konzentrationen zu vermeiden Optimierung der Inkubationszeit Dehydrierung vermeiden Temperatur überprüfen Inkubationszeit verkürzen Geeignete Objektträger verwenden - 11 -