Modellversuch an Asetzferkeln zur Wirkung von Rohfaser auf zootechnische Leistungen und die Expression des inflammatorischen Markergens TNF im Gastrointestinaltrakt K. Schedle 1, M. Pfaffl 2 und W. Windisch 1 1 Universität für Bodenkultur Wien 2 Technische Universität München Einleitung Futtermittel mit einem hohen Gehalt an Rohfaser verdünnen die Energie- und Proteindichte des Futters und werden im Ferkelfutter deshal kaum eingesetzt. In jüngster Zeit wird jedoch zunehmend diskutiert, dass der Zusatz von Faserquellen zum Ferkelfutter die mikroielle Fermentation im Dickdarm fördern und sich dadurch insgesamt positiv auf die Gesundheit der Tiere auswirken könnte (Bach Knudsen et al. 1991; Potty 1996). Zu den praxisülichen Faserquellen zählen insesondere die Neenprodukte der Verareitung von Getreide, wie z.b. die Kleien. Sie weisen erheliche Anteile an vergleichsweise leicht fermentieraren Nicht-Stärke-Polysaccharieden (NSP) auf und fördern auf diese Weise das mikroielle Wachstum im Dickdarm. Neen löslichen NSPs könnten jedoch auch schwer verdauliche Faserestandteile eine positive Wirkung auf die Darmgesundheit der Tiere ausüen. Als Modellsustanz für eine derartige Faserquelle eignen sich eispielsweise die Pollen der chinesischen Gelkiefer (pinus massoniana), die als klar definierte, handelsüliche Ware im ostasiatischen Raum verfügar sind. Diese Pinienpollen haen einen sehr hohen Fasergehalt (ca. 60 % Ballaststoffe) mit üerwiegendem Anteil an Cellulose (ca. 15 %) und sind insgesamt kaum verdaulich (Zhao et al. 2006). Ihre positive Wirkung auf die Darmgesundheit (v.a. ei Ostipation) ist in der traditionellen chinesischen Medizin ereits seit langem eschrieen. Daei zeigen neuere Modellversuche mit Ratten und Schweinen, dass diese Pinienpollen ein erheliches preiotisches Potential esitzen, owohl sie selst weitgehend unverdaulich sind (Zhao et. al. 1996, 2006). In diesem Zusammenhang sollte in der vorliegenden Modellstudie untersucht werden, inwieweit die Zulage einer Faserquelle zu einem praxisülichen Ferkelfutter die Aufzuchtleistung eeinflusst und am Beispiel der Regulation des Markergens TNF (Tumornekrose-Faktor) die inflammatorische Aktivität des Verdauungstrakts moduliert. Hierei sollten Weizenkleie und Pinienpollen als Repräsentanten für relativ leicht zw. schwer verdauliche Faserquellen dienen. Material und Methoden Die Studie wurde mit 36 Asetztferkel der Kreuzung Edelschwein x Pietrain an der landwirtschaftlichen Fachschule Hatzendorf (Stm) durchgeführt. Die Tiere wurden mit etwa 8 kg Leendmasse nach Wurf, Geschlecht und Körpergewicht in 12 Blocks zu je 3 Tiere eingeteilt und innerhal des Blocks einer von 3 Futtertypen zugeteilt: 1) Kontrolle: keine extra zugesetzte Faserquelle 2) Zusatz von 3,00 % Weizenkleie 3) Zusatz von 2,55 % Pinienpollen
Der Zusatz an Weizenkleie und Pinienpollen wurde so gewählt, dass die Zulage an Ballaststoffen (TDF, total dietary fier) jeweils gleich hoch war (ca. 145 g/kg Futter (Starterfutter), ca. 135 g/kg Futter (Aufzuchtfutter)). Für den Fütterungsversuch wurden zwei Basis-Futtermischungen mit praxisülicher Zusammensetzung verwendet, ein Starterfutter für die ersten 9 Tage nach dem Asetzen und ein Aufzuchtfutter für die weitere Versuchsdauer. Die Basismischung des Starter- und Aufzuchtfutters estand hauptsächlich aus Mais, Weizen und Sojaextraktionsschrot mit Energie und Proteingehalten von 13,7 MJ ME/kg und 25% XP zw. 13,3 MJ ME/kg und 20% XP, sowie edarfsdeckender Ergänzung an essentiellen Aminosäuren, Mineralstoffen und Vitaminen, jedoch ohne Zusatz an potentiell leistungsfördernden Sustanzen (z.b. organische Säuren, hohe Kupfer- oder Zinkgehalte, Proiotika, Preiotika). Die Zulage der Faserquellen erfolgte durch Einmischung in die fertigen Basis-Rationen. Die 3 Futtermischungen des Starter- zw. Aufzuchtfutters mit den unterschiedlichen Faserzusätzen wurden ad liitum verareicht. Die Tiere wurden in 8 Boxen eines vollklimatisierten, strohlosen Ferkelaufzuchtstalls mit Teilspaltenoden und eheizter Liegefläche gehalten. Die Futteraufnahme und die Gewichtsentwicklung der Tiere wurde wöchentlich ermittelt. Am Tag 36 und 37 des Fütterungsversuchs wurden die Tiere in der etrieseigenen Schlachtstätte geschlachtet, Geweeproen von Magen, Jejeunum, Ileum, Colon und Lymphknoten entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und ei -80 C gelagert. Zur Analyse der Genexpression wurde total-rna mittels TriFast (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) extrahiert. Anschließend wurde die RNA-Auseute mittels Biophotometer ermittelt. Die cdna Synthese erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mit 1500 ng total RNA durch das Enzym Reverse Transcriptase (M-MLV RT Rnase H(-) Point Mutantm incl. Puffer, Promega, Mannheim, Deutschland), random hexamer primers (Invitrogen, Carlsad, USA) und dntp s (10mM) (MBI Fermentas, St. Leon- Rot Deutschland). Die relative Quantifizierung der cdna wurde mit dem ep Cycler (Eppendorf, Hamurg, Deutschland) durchgeführt. 20 ng cdna in einem Volumen von 2 µl wurden als PCR Vorlage verwendet. Zusätzliche wurden 0,76 µl forward- reverse Primer (10 pmol) (Invitrogen, Carlsad, USA), 6,75 µl Real Master Mix (Eppendorf, Hamurg, Deutschland) und Wasser auf ein endgültiges Volumen von 15 µl geracht. Die quantitative PCR wurde mit 45 Zyklen und einer Produkt-spezifischen annealing Temperatur durchgeführt. Die crossing pionts wurden mit der CT-Methode (Eppendorf Software, Hamurg, Deutschland) ermittelt. Die relative Quantifikation wurde durch die Referenzgene Histon H3 und Beta actin sowie dem physiologischen Marker Gen TNF α nach der ΔΔCP Methode errechnet (Schmittigen 2001, Livak und Schmittgen 2001). Die Daten wurden einer Varianzanalyse (GLM-procedure of SAS, SAS Inst., Inc., Cary, NC) unterzogen. Signifikante unterschiede zwischen den Mittelwerten (p 0,05; Student-Newman-Keuls- Test) werden mit Hochuchstaen gekennzeichnet.
Ergenisse Der Fütterungsversuch verlief üer den ganzen Versuchszeitraum ohne nennenswerte Komplikationen. Es fielen insgesamt 3 Tiere ohne Bezug zur unterschiedlichen Fütterung aus (1 x Kontrolle, 2 x Pinienpollen). Wie Aildung 1 zeigt, führte der Zusatz von Weizenkleie wie auch von Pinienpollen gegenüer der Kontrollgruppe zu signifikant höheren Tageszunahmen um 22 zw. 17 %. Der Futterverzehr stieg noch stärker an als der Gewichtszuwachs (42 zw. 27 %). Dadurch kam es ei den Tieren mit Weizenkleie und Pinienpollen zu einer Verschlechterung der Futterverwertung (Futter/Zuwachs) um 10 % für eide Zulagengruppen. 800 g 1750 750 g 700 g c 1700 650 g 600 g 550 g 500 g 450 g 400 g 350 g a a 1650 1600 1550 1500 g/kg Zuwachs 300 g Kontrolle Weizenkleie Pollen 1450 TZ in g/tag Futterverr./Tier/Tag in g FVW in g/kg Zuwachs Aildung 1: Zootechnische Parameter nach 35 Tagen Aufzucht Die mrna für TNF war in allen untersuchten Geween reichlich vorhanden. Aildung 2 zeigt die Veränderungen der Expression von TNF durch die Zulage an Weizenkleie zw. Pinienpollen in Relation zur Kontrollgruppe. In den untersuchten Segmenten des Verdauungstrakts zeigte die Zulage an Weizenkleie keine systematische Verschieungen der Expression von TNF gegenüer dem Kontrollniveau, während sie durch Pinienpollen durchgehend leicht vermindert zu sein schien. Diese Differenzen waren statistisch jedoch nicht azusichern. Demgegenüer kam es in den mesenterialen Lymphknoten sowohl durch Weizenkleie wie auch an Pinienpollen zu einem eträchtlichen Anstieg der Expression des Markergens für TNF. (Faktor 2,5 zw. zw. 3,5). Die Differenz zum Kontrollniveau war ei den Pinienpollen statistisch in der Tendenz asicherar (p < 0,10)
x-fache Auf- oder Aregulation 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 (a) Magen Jejunum Ileum Colon Lymphknoten Weizenkleie Pollen Aildung 2: Änderung der Genexpression von TNF in Vielfachen des Kontrollniveaus (Kontrolle = 1) [(a): Differenz zum Kontrollniveau p< 0,1] Diskussion In der vorliegenden Studie führte der Zusatz der eiden Faserquellen zum Ferkelfutter zu einem signifikanten Anstieg der Tageszunahmen und des Futterverrauchs. Da die Tiere vor der Wiegung nicht genüchtert wurden, könnten die höheren Tageszunahmen zumindest teilweise durch die erhöhte Futteraufnahme sowie das höhere Quell- und Wasserhaltevermögen im Verdauungstrakt erklärt werden. Der Anstieg der Futteraufnahme selst war jedoch sehr stark ausgeprägt und scheint nur edingt als Kompensationsreaktion der Tiere auf die durch den Faserzusatz verminderte Energiedichte des Futters erklärar zu sein. Dieser Befund steht im Kontrast zu einer Ferkelstudie von Hansen et. al. (2006), die ei Zusatz verschiedener Faserquellen zum Futter keinen Einfluss auf die zootechnischen Parameter eoachten konnten. Möglicherweise spielt ei derartigen Vergleichen auch die Nährstoffkonzentration des unehandelten Kontrollfutters eine Rolle. Die Regulation der Expression inflammatorischer Markergene stellt eine Möglichkeit dar, potentielle Effekte von Faserestandteilen der Nahrung auf das Immunsystem zu studieren. TNF ist ein derartiges, gut untersuchtes proinflamatorisches Zytokin mit vielen iologischen Funktionen (Vasalli 1992). Es aktiviert z.b. indirekt Leukozyten und stimuliert andere Mediatoren. Weiters fungiert es als zentrales Element im Awehrmechanismus von Säugetieren gegenüer inflammatorischen Faktoren mikroieller Herkunft (z.b. Lipopolysaccharide) und ei Verletzungen (Goetz et al 2004, Laskin and Pendino 1995). In der vorliegenden Studie ewirkte der Faserzusatz eine Steigerung der Genexpression von TNF in den mesenterialen Lymphknoten um das 2,4 fache (Weizenkleie) zw. 3,4 fache (Pinienpollen), während die ürigen Darmaschnitte kaum reagierten. Offenar wurde speziell das Immunsystem durch die Faserzusätze insgesamt stimuliert. Dies scheint auf eine erhöhte Alarmereitschaft des Immunsystems hinzuweisen, und könnte möglicherweise durch ein verstärktes intestinales Mikroenwachstums infolge der Faserzusätze ausgelöst worden sein. Hierei ist noch unklar, inwieweit
sich ein derartiger Effekt als Ausdruck eines erhöhten Infektionsdrucks interpretieren lässt. Die derzeit noch nicht ageschlossenen Analysen zur Genexpression von TGF, einem Markergen für eine antiinflammatorische Reaktion, ergaen zumindest ei den mit Pollen gefütterten Tieren eenfalls einen deutlichen Anstieg in den mesenterialen Lymphknoten. Dies würde die Vermutung ekräftigen, dass sich das Immunsystem ei diesen Tieren nicht in einer akuten Awehrsituation efand, sondern durch die Faserzulage in eine generell erhöhte Awehrereitschaft versetzt wurde. Dies könnte durchaus das Risiko des Ausruchs einer Infektionserkrankung senken und sich wiederum ähnlich wie ei klassischen Leistungsförderern positiv auf die Leistungsereitschaft der Tiere auswirken. Möglicherweise haen derartige Effekt in der vorliegenden Untersuchung zur signifikanten Steigerung von Futterverzehr und Zuwachs mit eigetragen, wenngleich an den Tieren selst keine Unterschiede im äußeren Gesundheitsstatus zu eoachten waren. Insgesamt wiesen eide Faserzusätze eine eträchtliche Wirkung auf die Leistung und das Immunsystem der ehandelten Tiere auf, die mit der rechnerischen Verdünnung der Dichte an Hauptnährstoffen im Futter alleine nicht zu erklären sind. Insesondere ei den praktisch unverdaulichen Pinienpollen kommen möglicherweise noch weitere nicht-nutritive Effekte hinzu. Literatur Bach Knudsen K.E., Jensen B.B., Andersen J.L., and Hansen I. (1991): Gastrointestinal implications in pigs of wheat and oat fractions. 2. Microial activity in the gastrointestinal tract. Br. J. Nutr. 65, 233-248. Goetz F.W., Planas J.V. and MacKenzie S. (2004): Tumor necrosis factor. Dev. and Comp. Immunology 28, 487-497. Hansen M.J., Chwaliog A., Tauson A.H., and Sawosz E. (2006): Influence of different fire sources on digestiility and nitrogen and energy alances in growing pigs. Arch. Anim. Nutr. 60, 390-401. Laskin D.L. and Pendino K.J. (1995): Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. An. Rev. of Pharm. and Toxicol. 35, 655-677. Livak K.J., Schmittgen T.D. (2001): Analysis of relativ gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods 25, 402-408. Potty V.H. (1996): Physico-chemical aspects, physiological functions, nutritional importance and technological significance of dietary fires critical appraisal. J. Food Sci. Technol 33, 1-18. Schmittgen T.D. (2001): Real time quantitative PCR, methods. 2001, 383-385. Vasalli P. (1992): The pathophysiology of tumor necrosis factor. Annu. Rev. Immunol. 10, 411-452. Zhao, L., Windisch, W. and Kirchgessner, M. (1996) A study on the nutritive value of pollen from the Chinese Masson Pine (Pinus massoniana) and its effect on fecal characteristics in rats. Z. Ernährungswiss. 35, 341-347. Zhao, L., Windisch, W., Roth, F,X, Eder, K., and Ettle, T. (2006) Nutritive value of Masson Pine pollen in comparison to wheat ran and effects on stool characteristics. Austrian J. Agric. Res., sumitted Autorenanschrift: DI Karl Schedle Ateilung: Tierische Leensmittel, Tierernährung und Ernährungsphysiologie Department für Leensmittelwissenschaften und technologie Universität für Bodenkultur Wien Gregor Mendel-Strasse 33, A-1180 Wien e-mail: karl.schedle@oku.ac.at