Ein integriertes Konzept für die katalytisch vollständige Hydrolyse von Cellulose zu vergärbaren Zuckern Antje C. Spiess Fachtagung Nachhaltige Biokraftstoffe, 28. kt. 21
Biokraftstoffkreislauf im Exzellenzcluster Sonnenenergie & Kohlendioxid Kohlendioxid in die Atmosphäre Biomasse Energieumwandlung Maßgeschneiderte C2-Neutrality Kraftstoffe aus Biomasse Katalytische Umwandlung Verfahrenstechnik C2H Levulinic Acid etc. MTF H H H H H H R H H etc. 2-Hydroxymethylfurfural (HMF) H2C C2H Itaconic Acid etc. A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 http://www.fuelcenter.rwth-aachen.de 2
(Ligno-)Cellulosen als Rohstoffe Lignocellulose Reichhaltigstes Biopolymer der Erde Widerstandsfähigkeit Vorbehandlung erforderlich Cellulose Unlöslich in wässrigen Medien α-cellulose Avicel http://genomics.doe.gov A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 3
Celluloseabbau durch T. reesei Cellulasen ß-Glucosidase CBH II Cellobiohydrolase CBH I nicht-reduzierendes Ende kristallin Trichoderma reesei Endoglucanase amorph kristallin Celluclast Novo, DK reduzierendes Ende A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 4
Cellulaseaktivität und Adsorption 1 g/l α-cellulose,,1 M Acetat-Puffer, ph 4,8, Celluclast entsalzt, 3 C, 4 min, 1 rpm 8 4. Adsorbierte Cellulase [mg Cellulase/g Cellulose] 7 6 5 4 3 2 1 adsorbierte Cellulase Anfangsreaktionsgeschwindigkeit...5 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 Freie Cellulasekonzentration [g/l] 3.5 3. 2.5 2. 1.5 1..5 Reaktionsgeschwindigkeit [g/l/h] Cellulaseaktivität ist proportional zur adsorbierten Enzymmenge Helene Wulfhorst, Sachiko Wakimura A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 5
Cellulaseaktivität und Struktur der Cellulose -15 g/l Cellulose,.25 g/l Celluclast,.1 M Acetatpuffer, ph 4.8, 2 µl, 37 C, 9 rpm, 3 mm, 96-MTP Kristallinität [%] Sigmacell berfläche [m²/g] * 64* Avicel α-cellulose.25.9 82*.5 berfläche erhöht Cellulaseaktivität bei hoher Konzentration Kristallinität verringert Cellulaseaktivität bei geringer Konzentration Jäger G et al., Biotechnol. Biofuels 3:18 (21) A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 6
Vorbehandlung durch ionische Flüssigkeit (Ligno-) Cellulose Enzymatische Hydrolyse in ionischer Flüssigkeit Glucose Lösen in ionischer FlüssigkeitQuantitative Beschreibung der homo- und heterogenen Depolymerisation Enzymatische Hydrolyse Selektive Fällung A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 7
Ionische Flüssigkeiten (IL) Bestehen meist aus organischen Ionen Schmelztemperatur unter 1 C (gemäß Definition) Kationen 1-Butyl-3-methylimidazolium (BMIM) 1-Allyl-3-methylimidazolium (AMIM) Cl - Cl - Anionen Chlorid (Cl) 1-Ethyl-3-methylimidazolium (EMIM) Acetat (Ac) 1,3-Dimethylimidazolium (MMIM) Einstellbare Eigenschaften Einige IL lösen Cellulose derivatisierungsfrei Dimethylphosphat (DMP). Seddon K. tce 73:33 (22) A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 8
Einige ionische Flüssigkeiten lösen Holz 5 % w/w Holzpulver in IL, 1 rpm, 9 C AMIM Cl EMIM Cl EMIM Ac BMIM Cl MMIM DMP Fichte + + Weißtanne + Buche + vollständiges Lösen, teilweises Lösen + + Kastanie + + EMIM Ac, Buche, 1 rpm, 9 C, 1 h Ionische Flüssigkeiten, die im Screening Cellulose lösen, lösen zumindest teilweise auch Holz Zavrel M et al. Biores. Technol. 1:258 (29). A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 9
(Ligno-)Cellulose aus IL regeneriert Mikroskopische Aufnahmen, Nikon Eclipse E6, 4X Regenerierte Cellulose, suspendiert Avicel Jörn Viell, AVT-PT Fichte 5µm Regenerierte Fraktion, getrocknert und zerkleinert Ungelöster Rückstand, cellulosearme Fraktion Cellulosestruktur zerstört vermutlich amorphes Material Vergrößerte berfläche A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 Daniela Bross, Jörn Viell 1
Enzymatische Hydrolyse nach Vorbehandlung mit IL (Ligno-) Cellulose Enzymatische Hydrolyse in ionischer Flüssigkeit Glucose Lösen in ionischer FlüssigkeitQuantitative Beschreibung der homo- und heterogenen Depolymerisation Enzymatische Hydrolyse Selektive Fällung A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 11
Einfluss ionischer Flüssigkeiten auf Cellulaseaktivität 1 g/l α-cellulose, 1 % (v/v) IL in 5 mm NaAc, ph 4.5, 1.8 g/l Cellulase, 45 C Relative Enzymaktivität (-) 1..8.6.4.2. NaAc Puffer [MMIM] [DMP] Merck [MMIM] [DMP] IoLiTec [AMIM] [Cl] Merck [BMIM] [Cl] Merck [EMIM] [Ac] BASF [EMIM] [Ac] IoLiTec Ionische Flüssigkeiten verringern Enzymaktivität stark Kann Strukturveränderung den Aktivitätsverlust kompensieren? Engel P et al. Green Chem. doi:1.139/cgc135j. A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 12
Hydrolyseverlauf mit regenerierter Cellulose 1 g/l Cellulose, MMIM DMP in 5 mm NaAc, ph 4.8, 1.8 mg/ml Cellulase, 45 C 1 Umsatz red. Zucker (%) 8 6 4 unbehandelte Cellulose reg. Cellulose; % (v/v) IL 2 reg. Cellulose; 1 % (v/v) IL reg. Cellulose; 2 % (v/v) IL reg. Cellulose; 3 % (v/v) IL 12 24 36 48 Zeit (h) Anfängliche Aktivitätssteigerung (bis zu 2-fach), Aber: Bei steigenden IL-Gehalten geringere Endoglucanaseaktivität Engel P et al. Green Chem. doi:1.139/cgc135j. A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 13
Hydrolyseverlauf von IL-vorbehandelter Fichte Fichte vorbehandelt mit BMIM Cl, 1 g/l Substrat, 2.5 g/l Celluclast entsalzt, 9 rpm, 45 C 1 1 Reduzierende Zucker [g/l] 8 regenerierte Fraktion 8 72 % 6 6 ungelöster Rückstand 4 42 % 4 2 Holz ohne Vorbehandlung 16 % 2 12 24 36 48 6 Massenverlust Substrat [%] Zeit [h] Effektiver Abbau des Celluloseanteils in beiden Fraktionen Helene Wulfhorst, Anita golong A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 14
Verständnis für Polymerabbau (Ligno-) Cellulose Enzymatische Hydrolyse in ionischer Flüssigkeit Glucose Lösen in ionischer FlüssigkeitQuantitative Beschreibung der homo- und heterogenen Depolymerisation Enzymatische Hydrolyse Selektive Fällung A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 15
Populationbilanzmodell für polymeres Substrat Population:= Chemisch identische Spezies, die sich in einer Eigenschaft unterscheidet Cellulosekonzentration C C s (homogene) Elementarreaktionen Kettenlänge s großes Differentialgleichungssystem Implementation in Predici (CiT Wulkow, Rastede) A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 16
Cellulosepolymerisationsgrad in homogener Reaktion Normierte Gewichtskonzentration 3 mg/ml Endoglucanase Normierte Gewichtskonzentration 15 mg/ml Exoglucanase Kettenlänge (s) Normierte Gewichtskonzentration Philip Engel, Patrick Schmidt Kettenlänge (s) Kettenlänge (s) 3 mg/ml Endo- + 15 mg/ml Exoglucanase A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 17
Homogene enzymatische Cellulosehydrolyse (Ligno-) Cellulose Enzymatische Hydrolyse in ionischer Flüssigkeit Glucose Lösen in ionischer FlüssigkeitQuantitative Beschreibung der homo- und heterogenen Depolymerisation Enzymatische Hydrolyse Selektive Fällung A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 18
Ionische Flüssigkeit: Cellulaseaktivität vs. Celluloselöslichkeit Cellulaseaktivität Betriebsfenster Celluloselöslichkeit % 5 % 1 % Konzentration der ionischen Flüssigkeit Neue Enzyme finden, die bei hohem IL-Anteil aktiv sind! A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 19
Viskositätsmessung für Cellulose 1 mg/ml α-cellulose, 9 %(v/v) EMIM Ac, 8 C, Scherrate 1 1/s Viskositätsmessung ist sensitiv auf Veränderungen (langer) Polymerketten Philip Engel, Xin Lin A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 21
Integrierter chemo-enzymatischer Prozess (Ligno-) Cellulose Enzymatische Chemische Hydrolyse in ionischer Flüssigkeit Glucose Lösen in ionischer Flüssigkeit + Geschwindigkeit - Abbauprodukte Enzymatische Hydrolyse Selektive Fällung A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 23
Hydrolyse von Cello-ligomeren und Cellulose 1 g/l Substrat,.5 % (v/v) Celluclast, Acetatpuffer ph 4.5, 45 C Cellulose nach chemischer Vorhydrolyse DP W ~ 7 Aus IL regenerierte Cellulose DP W ~ 16 Unbehandelte Cellulose DP W ~ 32 Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (21). A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 24
Vergleich mit konventioneller Cellulosehydrolyse t [min] 2 5 7 1 12 15 3 45 6 9 12 4.5 h Chemo-enzymatische Cellulosehydrolyse 5 h Konventionelle enzymatische Cellulosehydrolyse Bisher schnellster Prozess für die selektive Umsetzung von Cellulose zu löslichen Zuckern! Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (21). A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 25
Zusammenfassung Lösen und Fällen aus ionischen Flüssigkeiten ist eine Vorbehandlung für enzymatischen Celluloseabbau Verständnis der (Ligno-)Cellulosehydrolyse Chemo-physikalische Wirkung ionischer Flüssigkeiten Beitrag von Endo- und Exoglucanasen durch mathematische Modellierung Erstmaliger Nachweis von Cellulaseaktivität in ionischen Flüssigkeiten Effektiver chemo-enzymatischer Prozess für Cellulosehydrolyse A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 26
Ausblick Verständnis für Celluloseabbau durch iteratives Wechselspiel von Modell und Experiment verbessern Übertragung auf verschiedene Lignocellulosen und Vorbehandlungsverfahren Maßgeschneiderte Enzympräparationen für homogenen und heterogenen Abbau von Lignocellulose-haltiger Biomasse A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 26.1.21 27
Vielen Dank an alle Mitwirkenden Benjamin Bonhage (Dipl) Daniela Bross (BSc) Jochen Büchs (Prof) Efthimia Ellinidou (BSc) Philip Engel (PhD) Kerstin Garschhammer (BSc) Gernot Jäger (PhD) Martin Kunze (PhD) Xin Lin (MSc) Radoslav Mladenov (BSc) Anita golong (Res) Martin Pöhnlein (BSc, Res) Patrick Schmidt (Dipl) Bianca Seiferheld (BSc, Res) Sachiko Wakimura (Res) Helene Wulfhorst (PhD) Michael Zavrel (PhD) Erik Zeithammel (Res) an die Kooperationspartner Roberto Rinaldi, MPI Ferdi Schüth, MPI Michele Girfoglio, IMB Ulli Commandeur, IMB Raffaele Cannio, CNR Napoli Jörn Viell, AVT.PT für finanzielle Unterstützung Deutsche Forschungsgemeinschaft ExC 236 Tailor-made fuels from biomass GK 1166 Biocatalysis using non-conventional media NRW Forschungsschule BreNaRo für Ihre Aufmerksamkeit A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.1.21 28