Titel: Teststrategie, Methoden und Beispiele zur Gentoxizitätsprüfung von Wasserproben Humantoxikologische Untersuchungen Tamara Grummt Umweltbundesamt, Dienstgebäude Bad Elster Informationsveranstaltung Grundwassersanierung Korneuburg Veranstaltungszentrum Grunerhof, Leobendorf, 13. November 2013
Zur Person Dr. Tamara Grummt, Umweltbundesamt, Dienstgebäude Bad Elster Abteilung Trink- und Badebeckenwasserhygiene Fachgebietsleiterin II 3.6 Toxikologie des Trinkwassers und des Badebeckenwassers Schwerpunkte: Findung gesundheitlicher Grenz- und Richtwerte im Gesamtsystem der hygienischen Bewertung des Wasserkreislaufs, insbesondere des Roh- und Trinkwassers Stoffbewertungen mit umweltmedizinischen Fragestellungen durch den Einsatz von humanrelevanten Biomarkern (integrierte Risikoabschätzung) Mitarbeit bei der Ableitung von Richt- und Grenzkonzentrationen für Stoffe im Roh- und Trinkwasser Mitarbeit an Konzepten zur Verminderung relevanter gesundheitlicher, technischer und umwelthygienischer Risiken im System Trinkwasser 2
Humantoxikologische Bewertung epidemiologische Studien bei gegebener Exposition und überschaubarer Populationsgröße Bewertung von Einzelsubstanzen und Stoffgemischen Grundlage für Risikomanagement und Ableitung von Maßnahmeoptionen 3
Regulative Basis für PSM Zulassungsverfahren für PSM Einträge des Wirkstoffes und relevanter Metabolite von 0,1 µg/l in das Grundwasser Trinkwasserrichtlinie / -verordnung PSM-Grenzwert Einzelstoff 0,1 µg/l; 0,5 µg/l Maßnahmehöchstwerte für PSM und deren relevante Metaboliten (LL 9 + 10 TrinkwV 2001 mit Hinweis auf ADI-Liste des BfR) LW TW (BfR) MW TW des UBA Stoffgruppe des UBA 10 µg/l 10 µg/l C 3 µg/l bis 10 µg/l 3,0 µg/l B 1,0 µg/l bis 3,0 µg/l 1,0 µg/l A zeitliche Begrenzung in Bezug zur Trinkwasserrichtlinie / -verordnung gesundheitliche Orientierungswerte (GOW) für nicht relevante Metaboliten 4
Ausgangspunkt bei Schadensfällen Sanierungsbedarf in Bezug zu bestehenden Regulationen (z.b. Trinkwasserrichtlinie / -verordnung) biologisches Krisenmanagement zur Abschätzung von Gefährdungspotenzialen Risikokommunikation auf der Basis transparenter Wissenschaft Vertrauensbildung 5
Situation in Bad Münder Anwendungsbeispiel /1 Situation in Bad Münder am 9. September 2002 Zusammenstoß zweier Güterzüge u.a. ein Kesselwagen mit Epichlorhydrin explodiert und brennt aus ECH-Freisetzung: durch Auslaufen und Explosion ECH-Exposition der Einsatzkräfte bei Löscharbeiten Expositionspfad: vorrangig inhalativ Start des Human-Monitoring am 8. Oktober 2002 6
Biomonitoring Blutabnahme Kulturansatz mit Vollblut und PHA 44 h Kultur + Colchizin + 3 h Kultur Lymphozytenpräparation: - Hypotonie - Fixierung Metaphase Mikroskopische Auswertung Färbung der Präparate 7
Anwendungsbeispiel /2 Modellstandort Stadtallendorf Produktion von 125.000 Tonnen TNT bei Kriegsende Bedeutendster Delaborierungsstandort 1968 1977 Trinkwassergewinnung für 250.000 EW Mittelhessens 8
Sanierung Großflächige Kontamination 150 200 sanierungsbedürftige Grundstücke Nutzungsbezogene Sanierung Toxikologische Aspekte Trinkwassergängigkeit der Verbindungen Komplexe Gemische Um- und Abbauprodukte der Altstoffe Gefährdungsabschätzung 9
Lösungsweg/komplexe Gemische Expositionsabschätzung Wasserkreislauf Gefährdungsabschätzung Chemische Analyse Black box Biotests Schlüsselmechanismen prognostisch relevante Biologie für den Menschen Toxikologische Sicherheit 10
Neuartige Wirkungen - physiologische Regelkreise Regelkreise ZNS, Nerven Neurotoxisch Neuartige Wirkungen Hormone Endokrine Disruptoren Gene Gentoxisch Reproduktives Reproduktives System System Reprotoxisch Immunsystem Immunotoxisch 11
Chemische Kanzerogenese Endogene Effekte Exposition Metabolismus Addukte Mutation Transduktion Signalwirkung Zellproliferation Metastasen Krebs Reparatur Wirkschwelle 12
Einbeziehung von Präkursorereignissen Membranpotenzial ROS Bezug zum adversen Effekt Zellkontakt Energiestoffwechsel 13
Ergebnisse - Präkursorereignisse Probencode/ Bezeichnung - MK_HF05/Z HOT SPOT 2 Zulauf (Hahnentnahme) - MK_HF05/A HOT SPOT 2 Ablauf (Hahnentnahme) - WG1 Pumpwerk Drainagen 1 Tresdorf (Schöpfprobe) - MK_OW23 Auslauf des Ableitungskanals des Feuerlöschteiches (Schöpfprobe) - MK_HF03 Brunnen Tierspital Korneuburg (Bepumpung) ROS-Bildung (JURKAT) Rohwasser RTCA-Zellproliferation (HepaRG TM ) Konzentrate ROS-Bildung (JURKAT) + + 14
Teststrategie und Methoden in der Gentoxizitätsprüfung In-vitro-Kurzzeittest Bakterieller Test Ames I Zellkultur Mikrokerne Control Genotoxic Ames II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0A 4A Count the number of the revertant (yellow) wells in each 48-well section 1A 2A 5A 6A 3A +A FACS 15
Etablierung der Zelllinien HepG2-Zellen Primäre Leberzellen Mensch HepaRG TM - Zellen 16
Ergebnisse - Gentoxizität Rohwasser Konzentrate Probencode/ Ames-Test Mikrokerne Ames-Test Mikrokerne Bezeichnung - MK_HF05/Z HOT SPOT 2 Zulauf (Hahnentnahme) - MK_HF05/A HOT SPOT 2 Ablauf (Hahnentnahme) - WG1 Pumpwerk Drainagen 1 Tresdorf (Schöpfprobe) - MK_OW23 Auslauf des Ableitungskanals des Feuerlöschteiches (Schöpfprobe) - MK_HF03 Brunnen Tierspital Korneuburg (Bepumpung) (TA 98 S9; TA 100 S9) (HepG2) (HepaRG TM ) (TA 98 +S9-human; TA 100 +S9-human) (HepaRG TM ) + + + 17
Wirkmechanismus - Endokrine Wirkungen Wissenschaftliche Unsicherheiten ergeben sich aus den komplexen Wirkmechanismen. Das Reagieren ist biologisch determiniert und ist nicht zwingend nachteilig für den Organismus. Rezeptorbindung allein sagt nichts über adversen Effekt. 18
Womit wird es gemacht? z. B. Womit wird es gemacht? Reportergenassay (Estrogen Receptor α specific Chemical Activated Luciferase gene expression) Basis: humane Zelllinie U-2 OS (entartete Osteoblasten) Gentechnisch verändert (Estrogenrezeptor-α- und Luciferase-Expressions- )
Was passiert in der Zelle? Der biologische Schaltkreis Add substrate (luciferine) Light Ligand Proteins Enzymes Luciferase Transport protein Chemical receptor Ligand binding Hsp Chemical Responsive Element (CRE) Transcription BDS 2008 Nucleus Cytosol 20
Was passiert im Labor? GV Humane Osteoblasten (U-2 OS) kultivieren 80 95 % 72 h Zellen in Versuchsplatte einsäen 16 h Exposition der Zellen mit Proben und Standards 96 well-microtiter Plates 24 h Luciferase-Freisetzung durch Lyse der Zellen 96 well-microtiter Plates 1 h Messung der Luciferasekonzentration mittels Lumineszenzmessung Luminometer 21
Wie wird das Ergebnis kontrolliert? Extraktion: Referenzsubstanz (Estradiol) + Blank Extraktion Assay: Überprüfung der Zellmorphologie und LDH-Bestimmung Estradiol-Standardreihe auf jeder Versuchsplatte Auswertung: Bestimmung der Induktionsrate (mind. > 6) Messwert < Halbmaximale Effektkonzentration (EC 50 ) Nachweisgrenze (LOD) = 0,21 ng EEQ/L Quantifizierungsgrenze (LOQ) = 0,70 ng EEQ/L Korrelationsfaktor der Estradiol-Standardkurve (> 0,98) Fehlergrenze der Dreifachstimmung (< 15 %) 22
Ergebnisse - Endokrine Wirkung Proben-Nr. - MK_HF05/Z Anlagenbezeichnung HOT SPOT 2 Zulauf (Hahnentnahme) - MK_HF05/A HOT SPOT 2 Ablauf (Hahnentnahme) - WG1 Pumpwerk Drainagen 1 Tresdorf (Schöpfprobe) - MK_OW23 Auslauf des Ableitungskanals des Feuerlöschteiches (Schöpfprobe) - MK_HF03 Brunnen Tierspital Korneuburg (Bepumpung) Kontrollen Extraktions-Blank Extraktions-Referenz (17beta-Estradiol) ERα-CALUX-Test / Estrogene Aktivität negativ negativ negativ negativ negativ negativ positiv (1,05 ng/l) Nachweisgrenze: 0,2 ng EEQ/L Quantifizierungsgrenze: 0,7 ng EEQ/L 23
Fazit keine Gentoxizität nachweisbar keine endokrinen Wirkungen nachweisbar keine Gefährdungspotenziale nachweisbar Abklärung positiver Befunde durch wirkungsbezogene Analytik Überwachung der Sanierungsmaßnahmen 24
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Dr. Tamara Grummt Umweltbundesamt, Dienstgebäude Bad Elster Heinrich-Heine-Str. 12 D-08645 Bad Elster tamara.grummt@uba.de Tel.: +49 (0)37437-76354 25