Nachweis von Aviären Bornaviren mittels konventioneller RT-PCR bei Psittaziden mit Proventricular Dilatation Disease in der Schweiz

Institut für Veterinärpathologie Abteilung Immunpathologie der Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich Direktor: Prof. Dr. A. Pospischil Arbeit unter Leitung von Prof. Dr. em. F. Ehrensperger Nachweis von Aviären Bornaviren mittels konventioneller RT-PCR bei Psittaziden mit Proventricular Dilatation Disease in der Schweiz Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich vorgelegt von Karin Madlen Röttele Tierärztin von Domat/Ems, Graubünden genehmigt auf Antrag von Prof. Dr. em. F. Ehrensperger, Referent Prof. Dr. R. Hoop, Korreferent Zürich 2012

Inhaltsverzeichnis 1. ZUSAMMENFASSUNG 3 2. SUMMARY 4 3. EINLEITUNG 5 3.1. Proventricular Dilatation Disease (PDD) Übersicht 5 3.2. PDD Klinik 6 3.3. PDD Pathologie 7 3.3.1. Pathogenese 7 3.3.2. Makroskopische Befunde 7 3.3.3. Histologische Befunde 8 3.4. PDD Entdeckung der Aviären Bornaviren und aktuelle Entwicklungen 10 3.5. Studienziele 12 4. MATERIAL UND METHODEN 13 4.1. Proben 13 4.1.1. Retrospektive Studie 13 4.1.2. Prospektive Studie 14 4.1.2.1. Tupferproben 14 4.1.2.2. Sektionsmaterial 17 4.2. Methoden 18 4.2.1. RNA-Extraktion 18 4.2.1.1. Retrospektive Studie RNA-Extraktion aus Paraffinblöcken 18 4.2.1.2. Prospektive Studie RNA-Extraktion aus Frischmaterial 18 4.2.1.3. Prospektive Studie RNA-Extraktion aus Tupfer 18 4.2.2. Konventionelle RT-PCR 19 4.2.3. Sequenzierung und phylogenetische Analyse 20 4.2.4. Immunhistochemie (IHC) 20 5. RESULTATE 22 5.1. Retrospektive Studie 22 5.2. Prospektive Studie 25 5.2.1. Tupferproben von Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht 25 5.2.2. Tupferproben von klinisch unverdächtigen Psittaziden aus Beständen mit nachgewiesener PDD 26 5.2.3. Tupferproben aus der Papageienauffangstation 28 5.2.4. Sektionsmaterial 29 5.3. Sequenzierung und phylogenetische Analyse 37 6. DISKUSSION 44 6.1. Retrospektive Studie 44 6.2. Prospektive Studie 45 6.3. Phylogenetische Analyse 47 7. REFERENZEN 48 8. DANK 52 9. CURRICULUM VITAE 53

1. Zusammenfassung Die Proventricular Dilatation Disease (PDD) ist weltweit eine der bedeutendsten entzündlichen Erkrankungen des animalen und vegetativen Nervensystems bei Psittaziden. Erst im Jahr 2008, knapp 40 Jahre nachdem die PDD zum ersten Mal beschrieben worden war, gelang die Identifizierung des infektiösen Agens, das heute als Aviäres Bornavirus (ABV) bezeichnet wird. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 171 Psittaziden aus der Schweiz mittels konventioneller reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) sowie in Einzelfällen mittels Immunhistochemie (IHC) auf ABV untersucht. Retrospektiv standen in Paraffin eingebettete Gehirnproben von 69 PDD-Fällen aus den Jahren 1989 bis 2002 zur Verfügung. Das prospektive Untersuchungsmaterial von 102 Psittaziden bestand aus Choanen- und/oder Kloakentupfern von Vögeln mit PDD- Verdacht, von klinisch unauffälligen Vögeln aus Beständen mit nachgewiesener PDD, von Tieren aus einer Papageienauffangstation sowie aus Sektionsmaterial von Psittaziden mit PDD-Verdacht. Diese Arbeit zeigt einen klaren Zusammenhang zwischen PDD und ABV auf. Insgesamt wiesen wir bei 52 Psittaziden ABV-Virus-RNA nach, dabei wurden 3 asymptomatische Trägertiere identifiziert. Weiter stellten wir fest, dass die Infektion mit einem phylogenetisch identischen Virus zu sehr unterschiedlicher Manifestation der PDD führen kann, dass Tupferproben ein hilfreiches diagnostisches Mittel sind und dass in der Schweiz ABV 2 der vorherrschende Subtyp ist. 3

2. Summary Proventricular dilatation disease (PDD) is one of the world's most important inflammatory diseases of the somatic and autonomic nervous system in psittacines. Only in 2008, almost 40 years after PDD has been described for the first time, one succeeded in identifying the infectious agent that is now known as Avian Bornavirus (ABV). In the present study, a total of 171 psittacines from Switzerland were examined on ABV by conventional reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and partly also by immunohistochemistry (IHC). Retrospectively paraffin-embedded brain samples from 69 PDD cases from 1989 to 2002 were analysed. The prospective study consisted of 102 psittacine samples of choanae and/or cloacal swabs of birds with PDD-suspicion, of clinically normal birds from flocks with confirmed PDD, of animals from a parrot rescue center as well as from necropsy material from psittacines with clinical and/or gross PDD-suspicion. This work shows a clear relationship between PDD and ABV. Overall, we detected ABV-RNA in 52 psittacines, thereby 3 asymptomatic carrier animals were identified. Next, we found that the infection with a phylogenetically identical virus can lead to very different manifestations of PDD, that smears are a useful diagnostic tool and that in Switzerland ABV 2 seems to be the predominant subtype. 4

3. Einleitung 3.1. Proventricular Dilatation Disease (PDD) - Übersicht Die Proventricular Dilatation Disease (PDD) ist weltweit eine der bedeutendsten entzündlichen Erkrankungen des animalen und vegetativen Nervensystems bei Psittaziden. Gefürchtet ist diese ansteckende Erkrankung insbesondere in Zuchtbeständen, wo die Mortalität nahezu 100% betragen kann. 24 PDD wurde zum ersten Mal in den späten 1970er-Jahren bei einem Ausbruch unter Aras beschrieben und deshalb Macaw wasting disease genannt. 4,24 Mittlerweile sind über 70 Papageienspezies von PDD betroffen, was dazu führte, dass diese Erkrankung weitere Namen wie Psittacine proventricular dilatation syndrome, Psittacine wasting syndrome oder Myenteric ganglioneuritis and encephalomyelitis erhielt. 10,13 Gleichartige Läsionen, wie sie bei der PDD auftreten, wurden auch bei einigen Nicht-Psittaziden festgestellt. Zu diesen Tieren gehören Kanarienvögel (Serinus canaria, Ordnung: Passeriformes), Grünfinken (Carduelis chloris, Ordnung: Passeriformes), Langlappen-Schirmvögel (Cephalopterus penduliger, Ordnung: Passeriformes), Kanadagänse (Branta canadensis, Ordnung: Anseriformes), Rosalöffler (Ajaja ajaja, Ordnung: Pelecaniformes), Wanderfalken (Falco peregrinus, Ordnung: Falconiformes), Tukane (Ramphastos sp, Ordnung: Piciformes) und Senegal-Furchenschnäbel (Lybius dubius, Ordnung: Piciformes). 6,10,27,41 Klinisch manifestiert sich die PDD in gastrointestinalen und / oder neurologischen Symptomen. 24 Aufgrund der Tatsache, dass bei den an PDD erkrankten Psittaziden weder Bakterien noch Parasiten oder Pilze als infektiöses Agens identifiziert werden konnten, wurde seit fast 40 Jahren eine virale Ätiologie vermutet. 24 Dank fortgeschrittener molekularer Techniken wurden im Jahr 2008 in zwei voneinander unabhängigen Studien in an PDD erkrankten Psittaziden ein neues Bornavirus entdeckt, das nun als Aviäres Bornavirus (ABV) bezeichnet wird. 18,20 5

3.2. PDD Klinik PDD tritt am häufigsten bei Aras, afrikanischen Graupapageien, Amazonen, Kakadus und Sittichen auf. 24 Die Tiere erkranken zumeist im Alter von 3 bis 4 Jahren, wobei aber auch vereinzelt Tiere im Alter von 10 Wochen oder 17 Jahren mit für PDD typischen Läsionen gefunden wurden. 13 Die Inkubationszeit ist äusserst variabel. Unter experimentellen Bedingungen wird über ein Minimum von 11, 21 beziehungsweise 66 Tagen berichtet. 9,12,34 Sie kann aber auch zwischen mehreren Monaten und über einem Jahr liegen. 34 Da Verteilungsmuster und Verteilungsgrad der Läsionen sehr unterschiedlich sind, werden bei den erkrankten Vögeln unterschiedliche und verschieden ausgeprägte Symptome beobachtet. Zum einen können gastrointestinale Symptome wie Regurgitieren, Kropfstasis, Ausscheidung von unverdauten Körnern im Kot, Anorexie, zunehmende Apathie und Abmagerung festgestellt, zum anderen ZNS-Symptome wie Ataxie, Zittern, Kopfschütteln, Lahmheiten und Lähmungen beobachtet werden. 13,24 Zudem wurde auch über Blindheiten im Zusammenhang mit PDD berichtet. 38 Die gastrointestinalen und die ZNS-Symptome treten zusammen oder einzeln auf und entwickeln sich langsam und allmählich oder treten plötzlich und heftig in Erscheinung. 13,24 Aufgrund der Symptomatik ist keine sichere Diagnosestellung möglich und differentialdiagnostisch kommen viele Erkrankungen in Frage, die es abzuklären gilt (z.b. intestinale Neoplasien, intestinale Fremdkörper, massiver Wurmbefall, bakterielle und mykologische Infektionen, Schwermetallvergiftungen). 24 Im typischen Fall präsentiert sich die PDD mit einer oft massiven Dilatation des Proventrikulus, was sich röntgenologisch darstellen lässt. 24 Mit einer Kontrastmittelstudie lässt sich die verzögerte Passagezeit der Ingesta verfolgen. 24 Radiologische Untersuchungen sind eine wertvolle Hilfe bei der Diagnosefindung, ermöglichen aber nur das Stellen einer Verdachtsdiagnose. 10 Als wichtiges diagnostisches Werkzeug dient die Kropfbiopsie. 14 Allerdings sind nur positive Ergebnisse aussagekräftig, da die für PDD typischen histologischen Veränderungen fehlen können, obwohl PDD vorliegt. 14 Proventrikulus- oder Ventrikulusbiopsien wären aufschlussreicher, da an diesen Lokalisationen am häufigsten PDD-Läsionen zu sehen sind. Sie werden jedoch selten durchgeführt, da sie ein höheres Risiko für das Tier darstellen. 10,13,14 Eine Therapie der Erkrankung ist bis heute nicht möglich. Es kann lediglich versucht werden, die Symptome zu bekämpfen, indem dem Tier leichtverdauliches Futter 6

angeboten, Stress vermieden und Sekundärinfektionen therapiert werden. 5 Ausserdem kann mittels Celecoxib, einem nichtsteroidalen Cox-2-Hemmer, oder Tepoxalin, einem kombinierten Cox-1- und Cox-2-Hemmer, versucht werden, die Entzündung des betroffenen Nervengewebes zu mildern und so die Symptome zu lindern. 5 Bei ZNS-Symptomen hat sich eine zusätzliche Therapie mit dem antiviralen Wirkstoff Amantadin als hilfreich gezeigt. 5 Die Prognose gilt trotz intensiver Therapieversuche als vorsichtig und die Lebenserwartung der betroffenen Tiere ist nicht vorhersehbar. 5 Um die Einschleppung der Erkrankung in Vogelbestände zu verhindern, sind prophylaktische Massnahmen unabdingbar. Zugekaufte Tiere sollten über längere Zeit in Quarantäne verbracht und auf PDD untersucht werden. Erkrankt ein Tier in einem Bestand, ist es wichtig, dieses Tier von den anderen abzusondern und hygienische Massnahmen zu treffen. 10 3.3. PDD Pathologie 3.3.1. Pathogenese Bei der PDD handelt es sich um eine Erkrankung, die zu lymphoplasmazellulären Infiltrationen des animalen und vegetativen Nervensystems führt, dies in unterschiedlichem Verteilungsmuster und grad. 13,24 Die Veränderungen im vegetativen Nervensystem (Ganglien und Nerven) haben zur Folge, dass die glatte Muskulatur des gastrointestinalen Traktes atrophiert, was typischerweise zu einem angeschoppten und dilatierten Proventrikulus führt. Auch Kropf, Muskelmagen und Darm können anschoppen und dilatieren. Die Futterverwertung wird dadurch nicht mehr gewährleistet und Körner werden unverdaut wieder ausgeschieden. 13,24 Das Gehirn, das Rückenmark, das Reizleitungssystem und das Nervengewebe des Herzens, die Nebennieren und periphere Nerven können gleichartige Infiltrationen aufweisen. 13,24 3.3.2. Makroskopische Befunde Mögliche Befunde sind hochgradige Abmagerung und Atrophie der Mm. pectorales (Abb. 1a) und ein dilatierter, dünnwandiger und angeschoppter Drüsenmagen (Abb. 1b und 1c), der in seltenen Fällen sogar rupturiert sein kann. Ausserdem können 7

Ösophagus, Kropf und Muskelmagen dilatiert und angeschoppt, Dünndärme dilatiert und unverdaute Körner im Darmlumen vorhanden sein. 4,13,24 Abb. 1 a c: Typische makroskopische Befunde bei einem Vogel mit PDD. a: Hochgradige Abmagerung und Atrophie der Musculi pectorales mit prominenter Crista sterni (Molukkenkakadu). b: Hochgradig angeschoppter und dilatierter Proventrikulus, einen grossen Teil der Leibeshöhle ausfüllend (Molukkenkakadu). c: Hochgradig angeschoppter und dilatierter Proventrikulus (Molukkenkakadu). 3.3.3. Histologische Befunde Die histologischen Läsionen sind gekennzeichnet durch lymphoplasmazelluläre Infiltrationen im Gewebe des animalen und vegetativen Nervensystems (Abb. 2a und 2b) und sind pathognomonisch für PDD. Die Läsionen können in unterschiedlichem Verteilungsmuster und grad im Plexus myentericus und submucosus des gastrointestinalen Traktes (Kropf, Proventrikulus, Muskelmagen, Darm), im Gehirn, im Herz, in den Nebennieren und weiteren peripheren Nerven gefunden werden. Berhane et al. fanden die typischen Läsionen im Kropf bei 43% der PDD-Fälle, im Drüsenmagen bei 36%, im Muskelmagen bei 93%, im Duodenum bei 21%, im Herz bei 79%, in den Nebennieren bei 50%, im Rückenmark bei 69%, im Gehirn bei 46%, im Nervus vagus bei 46%, im Plexus brachialis bei 46% und im Nervus ischiadicus bei 58%. 2 Ausserdem können in den betroffenen Organen auch perivaskuläre lymphoplasmazelluläre Infiltrationen und ein Übergreifen auf umliegendes Gewebe 8

auftreten. 2,4,13,24 Mehrere Studien berichten darüber, dass intranukleäre und intrazytoplasmatische Einschlusskörperchen im Bereich von Läsionen beobachtet wurden. 24,39,42 Abb. 2a: Grosshirn: Mittelgradige lymphoplasmazelluläre Enzephalitis (Graupapagei). Abb. 2b: Muskelmagen: Hochgradige lymphoplasmazelluläre myenterische Ganglioneuritis (Graupapagei). 9

3.4. PDD Entdeckung der Aviären Bornaviren und aktuelle Entwicklungen Für PDD wurden schon verschiedene Viren als ursächliches Agens in Erwägung gezogen, so zum Beispiel Paramyxoviren, Coronaviren, Reoviren, Polyomaviren, Enteroviren oder Avian Encephalitis Virus. 11,15,24,33 Da diese Hypothesen jedoch nicht bestätigt werden konnten, blieb der Auslöser der PDD lange Zeit ein Rätsel. Im Jahr 2008 gelang zwei unabhängigen Forschungsgruppen dank fortgeschrittener molekularer Methoden der Durchbruch in der Identifizierung des infektiösen Agens, das heute als Aviäres Bornavirus (ABV) bezeichnet wird. 18,20 Kistler et al. wendeten einen Pan-viral Microarray, der alle viralen Taxonome enthält, an 2 Fall-Kontroll Studien an. Mit dieser Methode wurden in 62.5% der PDD-Fälle eine neue Bornavirussignatur entdeckt aber in keinem der Kontrolltiere. Die Bornaviruspositiven Beispiele wurden durch eine virusspezifische PCR bestätigt und die komplette Gensequenz aufgeschlüsselt. Die Sequenzanalyse legte nahe, dass das entdeckte Virus einen neuen, genetisch unterschiedlichen Stamm der Familie der Bornaviridae bildet. 20 Honkavuori et al. extrahierten RNA aus Geweben von Psittaziden, schrieben sie in cdna um und führten direkt Sequenzanalysen durch. Wiederum wurde die Bornavirussignatur in an PDD erkrankten Tieren entdeckt. 18 Der Sequenzvergleich in der Arbeit von Kistler et al. zwischen ABV- und Borna Disease Virus (BDV)-Isolaten ergab eine Übereinstimmung von weniger als 70%. Trotz der Sequenzunterschiede besitzen aviäre Bornaviren alle Kennzeichen eines Familienmitgliedes der Bornaviridae: 6 ORFs ( Open reading frames ), die für die Gene N (Nucleoprotein), X (Protein mit noch unbekannter Funktion), P (Phosphoprotein), M (Matrixprotein), G (Glykoprotein) und L (grosses ( large ) Polyprotein mit Replikaseaktivität) kodieren und nicht-kodierende regulatorische Sequenzelemente. Weitere Sequenzanalysen dieser Forschungsgruppe wiesen zudem auf mindestens 5 verschiedene genetische Subgruppen hin. 20 Diese erhebliche Diversität innerhalb der ABV-Subtypen ist überraschend, da die bisher bekannten BDV-Subtypen untereinander eine sehr geringe Diversität aufweisen. 20,37,41,42 10

Seit der Publikation der Arbeiten von Kistler et al. und Honkavuori et al. wiesen mehrere Forschungsgruppen von verschiedenen Kontinenten ABV in an PDD erkrankten Psittaziden nach. 9,12,16,19,21,23,26,30,32,40,41,42 Im Gegensatz zu BDV zeigt ABV nicht ausschliesslich Neurotropismus, sondern ist in unterschiedlichen Zelltypen in verschiedenen Geweben nachweisbar. 23,26,32,41,42 Zudem wurde eine sechste genetische Subgruppe entdeckt und ausserdem konnte erstmals ABV in Nicht- Psittaziden nachgewiesen werden, einerseits bei einem Kanarienvogel (Serinus canaria) mit enterischer Ganglioneuritis und Enzephalitis und andererseits bei einem Riesentukan (Ramphastos toco), der in einer Flugvoliere mit ABV-positiven Aras gehalten wurde. 19,41,42 Gancz et al. gelang die experimentelle Induktion von PDD in Nymphensittichen (Nymphicus hollandicus) durch Inokulierung von Gehirnhomogenaten, die ABV 4 enthielten. 9 Die Koch schen Postulate konnten schlussendlich durch Gray et al. erfüllt werden, die ABV 4 in Embryofibroblasten von Enten kultivieren und durch Injektion der Kulturen in Felsensittiche (Cyanoliseus patagonus) PDD induzieren konnten. 12 Der Übertragungsweg von ABV ist noch nicht endgültig geklärt. Die faeko-orale Route wird als wahrscheinlich angenommen, da ABV regelmässig in an PDD erkrankten Psittaziden entweder in Kloakentupfern oder in Faezes nachgewiesen werden konnten. 9,12,16,19,21,23,30,32,40 Hoppes et al. filtrierten Luft aus einem Käfig mit einem ABV-positiven Vogel und wiesen in dieser Luft ABV nach. Ausserdem untersuchte diese Gruppe Nasen- und Choanentupfer von ABVpositiven Graupapageien mit positiven Ergebnissen. Dies lässt vermuten, dass ABV auch über den respiratorischen Weg übertragen werden könnte. 19 Weiter wurde intermittierende Virusausscheidung bei an PDD erkrankten Tieren beobachtet und asymptomatische Trägertiere konnten identifiziert werden, welche wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Epidemiologie von PDD spielen. 7,9,19,30,40 Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sämtliche Forschungsarbeiten seit der Entdeckung der Aviären Bornaviren überzeugende Beweise liefern, dass das auslösenden Agens der PDD endlich gefunden wurde. Es werden aber noch weitere Forschungsarbeiten nötig sein, um die Epidemiologie der PDD zu klären und verlässliche diagnostische Tests zu etablieren. 11

3.5. Studienziele Das Ziel dieser Studie war es, eine konventionelle RT-PCR zu entwickeln, um in einer retrospektiven und einer prospektiven Studie in Psittaziden aus der Schweiz mit bestätigter PDD oder mit PDD-Verdacht, sowohl aus in Paraffin eingebetteten Proben als auch aus frischem Gehirnmaterial und aus Choanen- bzw. Kloakentupfern, Aviäre Bornaviren nachzuweisen. Weiter sollten durch Sequenzieren und einer phylogenetischen Analyse die ABV-Subtypen bestimmt und graphisch dargestellt werden. 12

4. Material und Methoden 4.1. Proben 4.1.1. Retrospektive Studie Für diese Studie standen in Paraffin eingebettete Gehirnproben von 69 Psittaziden zur Verfügung (Tab. 1). Die Proben stammen aus den Jahren 1989 bis 2002 und waren im Archiv des Instituts für Veterinärpathologie Zürich gelagert. Bei allen Tieren wurde anhand der histopathologischen Befunde die Diagnose Macaw wasting disease beziehungsweise Proventricular dilatation disease gestellt und ausführlich in der Dissertation von Ines Krähenbühl beschrieben. 22 Tab. 1: Retrospektives Probenmaterial (69 Tiere). Anzahl Tiere Papageienspezies 14 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn 12 Ara Gehirn 9 Kakadu Gehirn 9 Papagei Gehirn 7 Amazone Gehirn 4 Zwergara (Diopsittaca nobilis) Gehirn 3 Hyazinthara (Anodorhynchus hyacinthinus) Gehirn 2 Gelbbrustara (Ara ararauna) Gehirn 2 Goldsittich (Guaruba guarouba) Gehirn 2 Molukkenkakadu (Cacatua moluccensis) Gehirn 1 Edelpapagei (Eclectus roratus) Gehirn 1 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Gehirn 1 Rosakakadu (Eolophus roseicapilla) Gehirn 1 Rotbauchpapagei (Poicephalus rufiventris) Gehirn 1 Sittich Gehirn Organ (in Paraffin eingebettet) 13

4.1.2. Prospektive Studie 4.1.2.1. Tupferproben Während der Laufzeit der Studie wurden von verschiedenen Tierärztinnen und Tierärzten Tupferproben (Choanen- und / oder Kloakentupfer oder kombinierte Choanen- / Kloakentupfer) von Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht (Tab. 2) oder aus Beständen mit nachgewiesener PDD (histologisch und / oder ABV-PCR positiv) entnommen (Tab. 3). Ausserdem wurden in einer Papageienauffangstation, die ein PDD-verdächtiges Tier besass, Kloakentupfer entnommen (Tab. 4). Insgesamt standen 103 Tupferproben von 87 Psittaziden für die Untersuchung zur Verfügung. 96 Tupferproben wurden mit UTM-Kit s gesammelt, welche je aus einem speziellem Tupfer ( flocked swab ) und 1ml UTM-Medium (Universal Transport Medium) bestanden (Copan Italia, Brescia Italien). Die restlichen 7 Tupferproben wurden mit handelsüblichen Tupfern ohne Transportmedium entnommen. Alle Tupferproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 C gelagert. Tab. 2: Tupferproben (Choanen- und / oder Kloakentupfer oder kombinierte Choanen- / Kloakentupfer) von Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht (11 Tiere). Anzahl Tiere Papageienspezies 3 Graupapagei (Psittacus erithacus) 2 Ara 2 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) 1 Fächerpapagei (Deroptyus accipitrinus) 1 Grünflügelara (Ara chloroptera) 1 Grünzügelpapagei (Pionites melanocephalus) 1 Wellensittich (Melopsittacus undulatus) 14

Tab. 3: Tupferproben (Choanen- und / oder Kloakentupfer oder kombinierte Choanen- / Kloakentupfer) von Psittaziden aus Beständen mit nachgewiesener PDD (31 Tiere). Anzahl Tiere Papageienspezies 12 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) 5 Graupapagei (Psittacus erithacus) 3 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) 2 Gelbbrustara (Ara ararauna) 2 Pennantsittich (Platycercus elegans) 2 Springsittich (Cyanoramphus auriceps) 1 Ara 1 Grünflügelara (Ara chloroptera) 1 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) 1 Rotbugara (Ara severa) 1 Rotohrara (Ara rubrogenys) Tab. 4: Anzahl Tiere Kloakentupferproben aus der Papageienauffangstation (45 Tiere). * Tier mit klinischem PDD-Verdacht. Papageienspezies 8 Graupapagei (Psittacus erithacus) 6 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) 4 Gelbhaubenkakadu (Cacatua galerita) 3 Edelpapagei (Eclectus roratus) 3 Gelbwangenkakadu (Cacatua sulphurea) 3 Papagei 2 Gelbnackenamazone (Amazona auropalliata) 2 Gelbstirnamazone (Amazona ochrocephala panamensis) 2 Mohrenkopfpapagei (Poicephalus senegalus) 1 Doppelgelbkopfamazone (Amazona oratrix) 1 Fächerpapagei (Deroptyus accipitrinus) * 1 Gelbseitensittich (Pyrrhura hypoxantha) 1 Gelbwangenamazone (Amazona autumnalis) 1 Goffinikakadu (Cacatua goffiniana) 15

1 Graukopfpapagei (Poicephalus fuscicollis) 1 Halsbandsittich (Psittacula krameri) 1 Mülleramazone (Amazona farinosa) 1 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) 1 Tiricasittich (Brotogeris tirica) 1 Venezuelaamazone (Amazona amazonica) 1 Weissstirnamazone (Amazona albifrons) 16

4.1.2.2. Sektionsmaterial Weiter wurden in dieser Zeit 18 verendete oder euthanasierte Psittaziden oder Organproben von Tieren mit klinischem PDD-Verdacht untersucht (Tab. 5). Nach Möglichkeit wurden Proben von Kropf, Drüsen-, Muskelmagen und Gehirn in RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bei -80 C gelagert, je ein Choanen- und ein Kloakentupfer (UTM-Kit, Copan Italia, Brescia Italien) entnommen und Proben von Kropf, Drüsen-, Muskelmagen, Gehirn, Herz, Lunge, Milz, Leber, Niere, Nebenniere, Dünn-, Dickdarm und Nervus ischiadicus mit Oberschenkelmuskulatur in 4% Formaldehydlösung fixiert. Für die Abklärung auf PDD wurden wenn möglich pro Tier von Kropf, Drüsen-, Muskelmagen und Gehirn histologische Schnitte angefertigt. Bei fünf Vögeln wurde zusätzlich eine ABV- Immunhistochemie durchgeführt. Tab. 5: Anzahl Tiere Sezierte Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht (18 Tiere). Papageienspezies 6 Graupapagei (Psittacus erithacus) 2 Doppelgelbkopfamazone (Amazona oratrix) 2 Fächerpapagei (Deroptyus accipitrinus) 2 Goldsittich (Guaruba guarouba) 1 Amazone 1 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) 1 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) 1 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) 1 Rotohrara (Ara rubrogenys) 1 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) 17

4.2. Methoden 4.2.1. RNA-Extraktion 4.2.1.1. Retrospektive Studie RNA-Extraktion aus Paraffinblöcken Von den in Paraffinblöcken eingebetteten Organen wurden 10 μm dicke Schnitte hergestellt, 2 bis 8 Schnitte pro Paraffinblock gepoolt und gleichentags die RNA- Extraktion mit dem RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden Deutschland) gemäss Anleitung des Herstellers durchgeführt. 4.2.1.2. Prospektive Studie RNA-Extraktion aus Frischmaterial Die in RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bei -80 C gelagerten Organproben wurden auf Eis aufgetaut und weiterverarbeitet. Jeweils 30 mg einer Probe wurden in einem 2 ml Precellys Lysing Tube (mit 1.4 mm grossen Keramikkügelchen (Zirkoniumoxid); Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux Frankreich) homogenisiert. Dazu wurden zuerst 600 μl RNeasy RLT-Puffer (Qiagen, Hilden Deutschland) mit β-mercaptoethanol (10 μl β-mercaptoethanol (Carl Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland) pro 1 ml RLT-Puffer) zur Probe gegeben und anschliessend der Homogenisationsprozess im Precellys 24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux Frankreich) gemäss Protokoll durchgeführt. Danach wurde die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden Deutschland) gemäss Anleitung des Herstellers extrahiert. 4.2.1.3. Prospektive Studie RNA-Extraktion aus Tupfer Tupfer ohne Transportmedium wurden in 1 ml sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, Invitrogen, Carlsbad CA, USA) eingetaucht und die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden Deutschland) gemäss Anleitung des Herstellers extrahiert. Die Tupfer in UTM-Medium benötigten keine Vorbehandlung und wurden ebenfalls mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden Deutschland) extrahiert. Sämtliche RNA-Extrakte wurden bis zur Durchführung der RT-PCR bei -80 C gelagert. 18

4.2.2. Konventionelle RT-PCR Die reverse Transkription und Amplifikation der RNA-Extrakte wurden mittels einer konventionellen One-Step RT-PCR unter Anwendung des QuantiTect Probe RT- PCR Kit s (Qiagen, Hilden Deutschland) und den von Weissenböck et al. publizierten Primern für die Nukleoprotein- und Matrixprotein-Genregionen durchgeführt (Tab. 6). 42 Jede Reaktion bestand aus 25 μl 2x QuantiTect Probe RT-PCR Mastermix, 0.5 μl QuantiTect RT Mix, 2 μl (0.4 μm) von jedem Primer, 15.5 μl DEPC-H 2 O und 5 μl RNA. Das totale Reaktionsvolumen betrug somit 50 μl. Das Temperaturprofil für die RT-PCR im Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City CA, USA) war folgendermassen: 30 Min. bei 50 C (Reverse Transkription), 15 Min. bei 95 C (Inaktivierung der Omniscript und Sensiscript Reversen Transkriptasen und Aktivierung der HotStarTaq DNA Polymerase), gefolgt von 45 Amplifikationszyklen zu 1 Min. bei 94 C (Denaturierung), 1 Min. bei 55 C (Primerhybridisierung) und 1 Min. bei 72 C (Elongation). Die Reaktionen wurden beendet mit einem letzten Elongationsschritt über 10 Min. bei 72 C. Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch in einem 1.5% TAE-Agarosegel mit Ethidiumbromid aufgetrennt. Als Marker diente eine 100 bp DNA-Leiter (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Fotografiert wurden die Gele mit einem AlphaImager und der entsprechenden Software (Alpha Innotech Corp., San Leandro CA, USA). Tab. 6: Primer für die konventionelle One-Step RT-PCR. 42 Primer Matrixprotein-Genregion (M) Nukleoprotein-Genregion (N) Forward 5 - CAAGGTAATYGTYCCTGGATGG-3 Reverse 5 -ACCAATGTTCCGAAGMCGAWAY-3 5 - CATGAGGCTATWGATTGGATTA-3 5 -TAGCCNGCCMKTGTWGGRTTYT-3 19

4.2.3. Sequenzierung und phylogenetische Analyse Vor der Sequenzierung durch die Firma Microsynth AG (Balgach Schweiz) wurden 60 PCR-Produkte mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden Deutschland) gemäss Anleitung des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR Produkte wurden mit den Primern, welche eine Sequenz innerhalb des Matrix Genes amplifizieren, sequenziert (Tab. 6). Die erhaltenen Sequenzen wurden mithilfe des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analysiert. 1 Innerhalb der 60 Sequenzen konnten 38 weiterverwendet werden. Das zur Bestimmung der DNA Evolution geeignetste Modell wurde mithilfe des MRAIC.pl Perl-Skriptes ermittelt. 25 Die Bayes sche Phylogenie wurde anhand von MRBAYES (Version 3.2, Markow Chain Monte Carlo Simulation unter Verwendung der HKY Substitutionsmatrix mit variablen Gamma Raten und 2 parallelen Läufen von je 4 Ketten über 10 000 000 Generationen) erstellt. 35 Anschliessend wurde die MCMC Simulation mit TRACER evaluiert, und die Darstellung des Baumes mittels FIGTREE verfeinert. 8 Die paarweise Identität der Sequenzen wurde mit NEEDLE (EMBOSS Software Paket) berechnet. 31 Die Editierung des Multi Sequenz Alignment wurde mit SHOWALIGN durchgeführt (EMBOSS Software Paket). 31 4.2.4. Immunhistochemie (IHC) Alle retrospektiven Fälle und eine Auswahl der Sektionsfälle wurden mittels Immunhistochemie (IHC) untersucht. Dazu wurde die EnVision-Methode zum Nachweis von Aviären Bornaviren (ABV) an Paraffinschnitten angewendet. 3 Bei jedem Durchlauf wurde eine Positivkontrolle von einem ABV-positiven Molukkenkakadu und zusätzlich zu jedem Gewebeschnitt eine Negativkontrolle mitgeführt, die anstelle der Primärantikörper mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS ph 8.0) inkubiert wurde. Als Primärantikörper wurden polyklonale rabbit-anti- ABV-N (N = ABV-Nukleoprotein; Kaninchen Nr. 182, Virus 1605) verwendet, die freundlicherweise von Prof. Dr. Peter Stäheli (Abteilung für Virologie, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg im Breisgau, Deutschland) zur Verfügung gestellt wurden. 20

EnVision-Protokoll: Zu Beginn wurden die 3 μm dicken Paraffinschnitte, die auf positiv geladenen Objektträgern (Superfrost Plus, Menzel GmbH & Co, Braunschweig Deutschland) aufgezogen und über Nacht bei 37 C getrocknet waren, mit Xylol in einer absteigenden Alkoholreihe (2 x 100%, 2 x 96%, 1 x 70% EtOH, 3 x H 2 O; jeweils 4 Min.) entparaffiniert. Darauf wurde mit Hämalaun gegengefärbt (2 Min.) und mit Leitungswasser gewässert (3 bis 5 Min.). Im folgenden Schritt wurde die endogene Peroxidase blockiert (3% H 2 O 2 in H 2 O dest. + 0,2% NaN 3 ; 100 μl pro Schnitt; 10 Min. bei Raumtemperatur (RT)) und mit PBS ph 8.0 gut gespült. Dann wurde die Unspezifität blockiert (Protein Block X0909, DAKO, Glostrup Dänemark; 100 μl pro Schnitt; 10 Min./RT). Nun wurden die Schnitte mit den primären Antikörpern inkubiert (100 μl pro Schnitt; PBS ph 8.0: Verdünnung 1:1000; über Nacht/RT). Bei den Negativkontrollen wurde der primäre Antikörper durch PBS ph 8.0 ersetzt. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Schnitte mit PBS ph 8.0 gespült und im folgenden Schritt mit dem sekundären Antikörper (EnVision + Anti-Rabbit K4003, DAKO, Glostrup Dänemark; 100 μl pro Schnitt; 30 Min./RT) inkubiert und danach wieder mit PBS ph 8.0 gespült. Darauf wurden die Schnitte mit 100 μl AEC- Substrat (AEC (red) Substrate KIT, Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro Schnitt inkubiert, die Reaktion am Mikroskop während ungefähr 20 Min./RT kontrolliert und mit PBS ph 8.0 gespült. Zum Schluss wurden die Schnitte mit Glyceringelatine (Kaiser s Glyzeringelatine, Merck, Darmstadt Deutschland) eingedeckt und unter dem Lichtmikroskop beurteilt. 21

5. Resultate Total wurden 219 Proben von 171 unterschiedlichen Psittaziden mittels konventioneller RT-PCR untersucht. Dadurch konnte bei 52 Psittaziden ABV-Virus- RNA nachgewiesen werden. 5.1. Retrospektive Studie Die in Paraffin eingebetteten Gehirnproben der 69 Psittaziden wurden sowohl mittels RT-PCR als auch mittels Immunhistochemie (IHC) untersucht (Tab. 7). Bei 32 Tieren konnte durch die RT-PCR Virus-RNA nachgewiesen werden, was anhand einer Bande in der Gelelektrophorese ersichtlich war. Dabei fiel auf, dass der RT-PCR Ansatz mit dem M-Primer sensitiver war als derjenige mit dem N-Primer. Teilweise waren mit dem N-Primer gar keine Banden vorhanden oder die Banden im Gel waren schwächer als mit dem M-Primer (Abb. 3). Unter den 32 positiven Tieren konnten durch Sequenzanalysen bei 15 Psittaziden ABV 2 und bei 4 Psittaziden ABV 4 identifiziert werden (Abb. 7). Bei den restlichen 13 Psittaziden war eine Sequenzanalyse nicht möglich. Der immunhistochemische Virusantigennachweis gelang bei 60 Psittaziden. Tab. 7: PDD-Fälle 1989 bis 2002 (69 Tiere). Nummer Vogelspezies Organ IHC RT-PCR Subtyp M N (M) H89-1503 Kakadu Gehirn + - - H89-2298 Kakadu Gehirn ++ - - H90-0075 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + - - H90-0854 Amazone Gehirn ++ pos. - n.b. H90-1100 Kakadu Gehirn ++ pos. - 2 H90-1174 Gelbbrustara (Ara ararauna) Gehirn + - - H90-1223 Papagei Gehirn - - - H90-2165 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + - - H90-3173 Papagei Gehirn + - - H91-0472 Ara Gehirn +++ pos. pos. n.b. H91-1313 Hyazinthara (Anodorhynchus hyacinthinus) Gehirn + - - H91-2046 Kakadu Gehirn - - - H91-2803 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn ++ pos. - n.b. H91-3166 Ara Gehirn + - - H92-0346 Goldsittich (Guaruba guarouba) Gehirn + - - H92-0882 Ara Gehirn - - - 22

H92-1258 Ara Gehirn ++ - - H92-1956 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + - - H92-2063 Goldsittich (Guaruba guarouba) Gehirn + pos. pos. 2 H92-2783 Sittich Gehirn - - - H92-3005 Rotbauchpapagei (Poicephalus rufiventris) Gehirn ++ - - H92-3276 Papagei Gehirn + - - H93-0477 Ara Gehirn + - - H93-0481 Edelpapagei (Eclectus roratus) Gehirn +++ pos. - 2 H93-1224 Kakadu Gehirn ++ - - H93-1695 Rosakakadu (Eolophus roseicapilla) Gehirn ++ pos. pos. 2 H93-2000 Kakadu Gehirn + - - H93-3081 Molukkenkakadu (Cacatua moluccensis) Gehirn - - - H94-0195 Kakadu Gehirn ++ - - H94-2470 Ara Gehirn ++ pos. - n.b. H95-0356 Amazone Gehirn +++ pos. pos. 2 H95-1138 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn +++ - - H95-1519 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + - - H95-1759 Molukkenkakadu (Cacatua moluccensis) Gehirn + pos. - n.b. H96-0503 Papagei Gehirn +++ pos. pos. 2 H96-0633 Gelbbrustara (Ara ararauna) Gehirn + - - H96-1318 Zwergara (Diopsittaca nobilis) Gehirn ++ - - H96-1484 Zwergara (Diopsittaca nobilis) Gehirn +++ pos. - n.b. H96-2034 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn ++ - - H96-2340 Zwergara (Diopsittaca nobilis) Gehirn ++ pos. - n.b. H96-2523 Kakadu Gehirn +++ - - H96-3267 Ara Gehirn ++ pos. n.d. 4 H96-4180 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + pos. n.d. 2 H98-0237 Kakadu Gehirn + pos. n.d. n.b. H98-0918 Zwergara (Diopsittaca nobilis) Gehirn + pos. n.d. n.b. H98-2058 Ara Gehirn + - - H98-2283 Ara Gehirn ++ pos. n.d. n.b. H98-2584 Papagei Gehirn + - - H99-1686 Papagei Gehirn + pos. n.d. n.b. H99-1772 Hyazinthara (Anodorhynchus hyacinthinus) Gehirn + pos. n.d. 2 H99-2586 Ara Gehirn - - n.d. H99-3199 Papagei Gehirn - - n.d. H99-3550 Papagei Gehirn +++ pos. pos. 2 H99-3663 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn +++ pos. pos. 2 H99-4200 Hyazinthara (Anodorhynchus hyacinthinus) Gehirn ++ pos. pos. 2 H01-0122 Papagei Gehirn - - - H01-1221 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + pos. pos. 2 H01-2092 Amazone Gehirn + - - H01-2225 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn ++ pos. pos. 4 H01-2436 Ara Gehirn +++ pos. pos. 2 H01-3436 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + pos. pos. 2 H01-3449 Amazone Gehirn ++ - - H01-4727 Amazone Gehirn + pos. - n.b. H02-0052 Ara Gehirn ++ pos. pos. n.b. H02-0232 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Gehirn + - - H02-0345 Amazone Gehirn - - - H02-2483 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn + pos. pos. 4 H02-3091 Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn ++ pos. pos. 2 H02-3220 Amazone Gehirn +++ pos. pos. 4 pos. = positiv, - = negativ, + = leichtgradig, ++ = mittelgradig, +++ = hochgradig, n.b. = nicht bestimmbar, n.d. = nicht durchgeführt 23

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 L 400bp 300bp Abb. 3: Beispiel einer Gelelektrophorese. Da die Banden mit dem N-Primer zumeist schwächer waren als mit dem M-Primer, musste das Gel stärker beleuchtet werden (b). a: ABV-RT-PCR mit M-Primern PCR-Produkt: 352bp 42 b: ABV-RT-PCR mit N-Primern PCR-Produkt: 389bp 42 L = 100bp DNA-Leiter 6 = H02-2483 12 = H98-2584 1 = H 2 O 7 = H02-3091 13 = H99-1783 2 = Eluatkontrolle 8 = H02-3220 14 = Positivkontrolle: H09-1248 (1:10 verdünnt) 3 = H02-0052 9 = H96-1484 4 = H02-0232 10 = H96-2034 5 = H02-0345 11 = H98-2058 24

5.2. Prospektive Studie Wie in der retrospektiven Studie fiel auch hier auf, dass der RT-PCR Ansatz mit dem M-Primer sensitiver war als derjenige mit dem N-Primer. Tab. 8: Tupferproben (Choanen- und / oder Kloakentupfer oder kombinierte Choanen- / Kloakentupfer) von Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht (11 Tiere). 5.2.1. Tupferproben von Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht Unter den eingesandten Tupferproben von 11 Vögeln konnte durch die RT-PCR bei 3 Psittaziden Virus-RNA nachgewiesen werden (Tab. 8). Die Tiere K10_01 und K10_02 stammten aus demselben Bestand Nr. 1. Ihnen wurden zweimal im Abstand von 35 Tagen je ein Kloakentupfer entnommen. Alle 4 Proben waren positiv. Durch Sequenzanalysen konnte man sie dem ABV Subtyp 4 zuordnen (Abb. 7). Tier K10_01 wurde knapp 10 Monate nach dem ersten ABV-RNA Nachweis und der damit gestellten Diagnose PDD aufgrund der progressiven Verschlechterung der neurologischen Symptome euthanasiert. Die weiteren Untersuchungen und Resultate zu diesem Vogel sind im Kapitel 4.2.4. Sektionsmaterial (Fallnr. H10-3027) aufgeführt. Tier K10_91 stammte aus Bestand Nr. 2. Bei diesem Graupapagei war sowohl der Choanen- als auch der Kloakentupfer ABV-RT-PCR positiv. Die Sequenzanalyse identifizierte bei diesem Tier ABV Subtyp 2 (Abb. 7). Bestand Nummer Vogelspezies Probe RT-PCR Subtyp M N 1 K10_01 Orangenhaubenkakadu (Cacatua Kloakentupfer pos. pos. 4 (H10-3027) sulphurea citrinocristata) Kloakentupfer pos. pos. n.d. 1 K10_02 Orangenhaubenkakadu (Cacatua Kloakentupfer pos. pos. 4 sulphurea citrinocristata) Kloakentupfer pos. pos. n.d. 2 K10_91 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer pos. pos. 2 Kloakentupfer pos. pos. n.d. 4 K8 Fächerpapagei (Deroptyus Choanen- - - accipitrinus) /Kloakentupfer K3 Wellensittich (Melopsittacus Choanen- - - undulatus) /Kloakentupfer K38 Graupapagei (Psittacus erithacus) Tupfer - - K39 Grünflügelara (Ara chloroptera) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - K40 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - K43 Ara Choanen- - - /Kloakentupfer K44 Ara Kloakentupfer - - K45 Grünzügelpapagei (Pionites Tupfer - - melanocephalus) pos. = positiv, - = negativ, n.d. = nicht durchgeführt 25

5.2.2. Tupferproben von klinisch unverdächtigen Psittaziden aus Beständen mit nachgewiesener PDD Insgesamt wurden 31 Psittaziden aus 3 verschiedenen Beständen beprobt. In jedem Bestand konnte bei je einem Vogel mittels RT-PCR Virus-RNA nachgewiesen werden (Tab. 9). Vom Weisshaubenkakadu K10_13 aus Bestand Nr. 1 stand ein Kloakentupfer zur Verfügung. Die Sequenzanalyse identifizierte bei diesem Tier ABV Subtyp 4 (Abb. 7). Beim Graupapagei K10_31 aus Bestand 2 und beim Rotohrara K10_94 aus Bestand 3 standen jeweils ein Choanen- und ein Kloakentupfer zur Verfügung. Alle Proben der beiden Psittaziden waren RT-PCR positiv und bei beiden wurde ABV Subtyp 2 festgestellt (Abb. 7). Tab. 9: Tupferproben (Choanen- und / oder Kloakentupfer oder kombinierte Choanen- / Kloakentupfer) von klinisch unverdächtigen Psittaziden aus Beständen mit nachgewiesener PDD (31 Tiere). Bestand Nummer Vogelspezies Probe RT-PCR Subtyp M N 1 K9 Pennantsittich (Platycercus elegans) Kloakentupfer - - 1 K10 Springsittich (Cyanoramphus auriceps) Kloakentupfer - - 1 K11 Pennantsittich (Platycercus elegans) Kloakentupfer - - 1 K12 Springsittich (Cyanoramphus auriceps) Kloakentupfer - - 1 K10_13 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) Kloakentupfer pos. pos. 4 1 K14 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) Kloakentupfer - - 1 K15 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea Kloakentupfer - - citrinocristata) 1 K16 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K17 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K18 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K19 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K20 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K21 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K22 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K23 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K24 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K25 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K26 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 1 K27 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) Kloakentupfer - - 2 K28 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 2 K29 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 2 K30 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 2 K10_31 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer pos. n.d. n.d. Kloakentupfer pos. n.d. 2 2 K93 Graupapagei (Psittacus erithacus) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K32 Gelbbrustara (Ara ararauna) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K33 Gelbbrustara (Ara ararauna) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 26

3 K34 Grünflügelara (Ara chloroptera) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K35 Rotbugara (Ara severa) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K36 Ara Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K37 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) Choanentupfer - - Kloakentupfer - - 3 K10_94 Rotohrara (Ara rubrogenys) Choanentupfer pos. pos. 2 Kloakentupfer pos. - n.d. pos. = positiv, - = negativ, n.d. = nicht durchgeführt 27

5.2.3. Tupferproben aus der Papageienauffangstation Alle Kloakentupferproben der 45 Psittaziden aus der Papageienauffangstation waren ABV-RT-PCR negativ (Tab. 10). Tab. 10: Kloakentupferproben aus der Papageienauffangstation (45 Tiere). Bestand Nummer Vogelspezies Probe RT-PCR M N 4 K46 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K47 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K48 Graukopfpapagei (Poicephalus fuscicollis) Kloakentupfer - - 4 K49 Weissstirnamazone (Amazona albifrons) Kloakentupfer - - 4 K50 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K51 Papagei Kloakentupfer - - 4 K52 Doppelgelbkopfamazone (Amazona oratrix) Kloakentupfer - - 4 K53 Gelbnackenamazone (Amazona auropalliata) Kloakentupfer - - 4 K54 Goffinikakadu (Cacatua goffiniana) Kloakentupfer - - 4 K55 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K56 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K57 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K58 Gelbhaubenkakadu (Cacatua galerita) Kloakentupfer - - 4 K59 Gelbwangenkakadu (Cacatua sulphurea) Kloakentupfer - - 4 K60 Edelpapagei (Eclectus roratus) Kloakentupfer - - 4 K61 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K62 Gelbwangenamazone (Amazona autumnalis) Kloakentupfer - - 4 K63 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K64 Papagei Kloakentupfer - - 4 K65 Gelbstirnamazone (Amazona ochrocephala panamensis) Kloakentupfer - - 4 K66 Gelbhaubenkakadu (Cacatua galerita) Kloakentupfer - - 4 K67 Halsbandsittich (Psittacula krameri) Kloakentupfer - - 4 K68 Gelbwangenkakadu (Cacatua sulphurea) Kloakentupfer - - 4 K69 Gelbnackenamazone (Amazona auropalliata) Kloakentupfer - - 4 K70 Edelpapagei (Eclectus roratus) Kloakentupfer - - 4 K71 Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Kloakentupfer - - 4 K72 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K73 Tiricasittich (Brotogeris tirica) Kloakentupfer - - 4 K74 Mülleramazone (Amazona farinosa) Kloakentupfer - - 4 K75 Gelbhaubenkakadu (Cacatua galerita) Kloakentupfer - - 4 K76 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K77 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K78 Gelbstirnamazone (Amazona ochrocephala panamensis) Kloakentupfer - - 4 K79 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) Kloakentupfer - - 4 K80 Mohrenkopfpapagei (Poicephalus senegalus) Kloakentupfer - - 4 K81 Papagei Kloakentupfer - - 4 K82 Mohrenkopfpapagei (Poicephalus senegalus) Kloakentupfer - - 4 K83 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K84 Venezuelaamazone (Amazona amazonica) Kloakentupfer - - 4 K85 Fächerpapagei (Deroptyus accipitrinus) * Kloakentupfer - - 4 K86 Graupapagei (Psittacus erithacus) Kloakentupfer - - 4 K87 Edelpapagei (Eclectus roratus) Kloakentupfer - - 4 K88 Gelbhaubenkakadu (Cacatua galerita) Kloakentupfer - - 4 K89 Gelbwangenkakadu (Cacatua sulphurea) Kloakentupfer - - 4 K90 Gelbseitensittich (Pyrrhura hypoxantha) Kloakentupfer - - * Tier mit klinischem PDD-Verdacht, - = negativ 28

5.2.4. Sektionsmaterial Unter den 18 Psittaziden konnte bei 14 Tieren mittels konventioneller RT-PCR ABV- RNA nachgewiesen werden (Tab. 11). Von den 14 positiven Vögeln wurden 12 histologisch untersucht. Bei 11 Tieren konnte anhand der typischen Läsionen die Diagnose PDD gestellt werden (11/12). Bei 7 Psittaziden waren sowohl eine nicht-eitrige myenterische Ganglioneuritis als auch eine Enzephalitis vorhanden (7/12), bei 4 Tieren war nur eine nicht-eitrige myenterische Ganglioneuritis zu sehen und das Gehirn ohne besondere Befunde (4/12). Lediglich eine Doppelgelbkopfamazone (H09-3709, Tier 1) war histologisch unauffällig (1/12). Makroskopisch fiel unter den ABV-positiven vor allem ein Orangenhaubenkakadu aus Bestand Nr. 1 auf (H10-3027 / K10_01), der chronisch an PDD litt und hauptsächlich neurologische Symptome zeigte. Der Vogel wies eine starke Verfettung auf, ansonsten war der Gastrointestinaltrakt makroskopisch unauffällig (Abb. 4 a c). Mit der ABV-Immunhistochemie konnte bei diesem Vogel in vielen verschiedenen Organen und Geweben (Gehirn, Kropf, Drüsen-, Muskelmagen, Leber, Niere, Herz, Nervus ischiadicus und angrenzende Muskulatur, Nebenniere, Ovar) in unterschiedlichsten Zellen eine hochgradige Menge an ABV-Virusantigen nachgewiesen werden (Abb. 5). Ausserdem wurden im histologischen Gehirnschnitt Einschlusskörperchen entdeckt (Abb. 6). Von den restlichen ABV-positiven Tieren, die makroskopisch beurteilt wurden (n=7), waren 6 Vögel abgemagert (6/7), 5 hatten zusätzlich eine Drüsenmagendilatation (5/7), wie das Beispiel eines Weisshaubenkakadus (H10-3341) aus Bestand Nr. 1 zeigt (Abb. 4 d f). Eine Amazone (H09-0375) war makroskopisch unauffällig (1/7). Bei allen 14 ABV-positiven Psittaziden wurde frisches Gehirnmaterial mittels RT-PCR auf ABV-RNA untersucht. 13 waren ABV-RNA positiv (13/14). Der Weisshaubenkakadu aus Bestand Nr. 1 (H10-3341) blieb auch nach wiederholter Untersuchung negativ (1/14). Immunhistochemisch konnten bei diesem Tier jedoch im Hirnstamm wenige Signale entdeckt werden. Bei 10 der 14 ABV-positiven Psittaziden wurden bei der Sektion entnommene Choanen- und Kloakentupfer mittels RT-PCR auf ABV-RNA untersucht (n=10). Beim adipösen Orangenhaubenkakadu (H10-3027 bzw. K10_01) aus Bestand Nr. 1 waren beide Tupfer positiv (1/10), bei einem Graupapagei (H10-0346) war nur der Choanentupfer positiv (1/10), bei 3 Tieren war nur der Kloakentupfer positiv (3/10). 29

Bei den restlichen 5 Psittaziden konnte keine ABV-RNA in den Tupfern nachgewiesen werden (5/10). Durch die Sequenzanalysen (Abb. 7) konnten 10 Psittaziden dem ABV-Subtyp 2 zugeordnet werden (10/14). Darunter sind alle Tiere aus den Beständen Nr. 2, 3 und 5. Bei 4 Vögeln wurde der ABV- Subtyp 4 nachgewiesen (4/14), darunter bei beiden Tieren aus Bestand Nr. 1. 30

Tab. 11: Sezierte Psittaziden mit klinischem PDD-Verdacht (18 Tiere). Bestand Vogelspezies Fallnummer 1 Orangenhaubenkakadu (Cacatua sulphurea citrinocristata) H10-3027 / K10_01 1 Weisshaubenkakadu (Cacatua alba) H10-3341 2 Graupapagei (Psittacus erithacus) H09-4328 2 Graupapagei (Psittacus erithacus) H10-1228 3 Rotohrara (Ara rubrogenys) H10-0345 5 Amazone H09-0375 5 Doppelgelbkopfamazone 1 (Amazona oratrix) H09-3709 5 Doppelgelbkopfamazone 2 (Amazona oratrix) H09-3709 Makroskopische Befunde Histologische Befunde / Diagnose Verfettung +++ Gastrointestinaltrakt o.b.b. Abmagerung +++ Drüsenmagendilatation+++ Dilatierte Därme ++ Durchfall Abmagerung +++ Drüsenmagendilatation+++ Myenterische Ganglioneuritis + Enzephalitis +++ Diagnose: PDD Myenterische Ganglioneuritis + Gehirn o.b.b. Diagnose: PDD Myenterische Ganglioneuritis ++ Enzephalitis + Diagnose: PDD k.a. Myenterische Ganglioneuritis ++ Gehirn o.b.b. Diagnose: PDD Abmagerung ++ Drüsenmagendilatation++ Myenterische Ganglioneuritis ++ Enzephalitis + Diagnose: PDD o.b.b. Myenterische Ganglioneuritis + Gehirn mit Gefrierartefakten Diagnose: PDD möglich Abmagerung +++ Myenterische Ganglien o.b.b. Gehirn o.b.b. Diagnose: keine PDD Abmagerung +++ Myenterische Ganglien o.b.b. Gehirn o.b.b. Diagnose: keine PDD Organ/Probe ABV-IHC RT-PCR Subtyp M N Gehirn +++ pos. pos. n.d. Kropf +++ n.d. n.d. Drüsenmagen +++ pos. n.d. n.d. Muskelmagen +++ n.d. n.d. Leber +++ n.d. n.d. Niere +++ n.d. n.d. Herz +++ n.d. n.d. N. ischiadicus +++ n.d. n.d. Nebenniere +++ n.d. n.d. Ovar +++ n.d. n.d. Choanentupfer pos. pos. n.d. Kloakentupfer pos. pos. 4 Gehirn + - - Muskelmagen + pos. n.d. n.d. Drüsenmagen + n.d. n.d. Choanentupfer - - Kloakentupfer pos. pos. 4 Gehirn n.d. pos. pos. 2 Choanentupfer - - Kloakentupfer - - Gehirn n.d. pos. - 2 Choanentupfer - - Kloakentupfer - - Gehirn n.d. pos. pos. n.d. Choanentupfer - - Kloakentupfer pos. pos. 2 Gehirn n.d. pos. pos. 2 Gehirn n.d. pos. pos. 2 Gehirn n.d. - - 31

5 Fächerpapagei 1 (Deroptyus accipitrinus) H10-0635-1 5 Fächerpapagei 2 (Deroptyus accipitrinus) H10-0635-2 Graupapagei (Psittacus erithacus) H08-4811 Graupapagei (Psittacus erithacus) H09-1248 Goldsittich (Guaruba guarouba) H09-3907 Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) H09-4547 Gefrierartefakte n.d. Gehirn n.d. pos. pos. 2 Choanentupfer - n.d. Kloakentupfer - n.d. Gefrierartefakte n.d. Gehirn n.d. pos. pos. 2 Choanentupfer - n.d. Kloakentupfer - n.d. Abmagerung, Drüsenmagendilatation, Ösophagusanschoppung Myenterische Ganglioneuritis + Gehirn o.b.b. Diagnose: PDD k.a. Myenterische Ganglioneuritis ++ Enzephalitis + Diagnose: PDD k.a. Myenterische Ganglioneuritis + Enzephalitis + Diagnose: PDD Drüsenmagendilatation Myenterische Ganglien o.b.b. Gehirn o.b.b. Diagnose: keine PDD k.a. Myenterische Ganglioneuritis ++ Enzephalitis + Diagnose: PDD Abmagerung +++ Myenterische Ganglien o.b.b. Gehirn o.b.b. Diagnose: keine PDD Gehirn n.d. pos. pos. 4 Gehirn + pos. pos. 2 Kropf n.d. pos. pos. n.d. Drüsenmagen n.d. pos. pos. n.d. Muskelmagen n.d. pos. pos. n.d. Choanentupfer - - Kloakentupfer pos. pos. n.d. Gehirn n.d. pos. pos. 4 Gehirn n.d. - - Graupapagei (Psittacus erithacus) H10-0346 Gehirn Choanentupfer n.d. pos. pos. pos. n.d. 2 n.d. Kloakentupfer - n.d. Graupapagei (Psittacus erithacus) Gehirn n.d. - - H10-1245 Choanentupfer - - Kloakentupfer - - Goldsittich (Guaruba guarouba) Abmagerung +++ Myenterische Ganglioneuritis + Gehirn + pos. pos. 2 H10-2687 Drüsenmagendilatation++ Enzephalitis ++ Kropf + n.d. n.d. Diagnose: PDD Drüsenmagen - n.d. n.d. Muskelmagen + n.d. n.d. Choanentupfer - - Kloakentupfer - - Blaustirnamazone (Amazona aestiva) Abmagerung +++ Myenterische Ganglien o.b.b. Gehirn - - - H10-2688 Drüsenmagendilatation++ Gehirn o.b.b. Kropf - n.d. n.d. Diagnose: keine PDD Drüsenmagen - n.d. n.d. Choanentupfer - - Kloakentupfer - - o.b.b. = ohne besondere Befunde, n.d. = nicht durchgeführt, k.a. = keine Angaben, pos. = positiv, - = negativ, + = leichtgradig, ++ = mittelgradig, +++ = hochgradig 32