Arbeitsanleitung. Röteln IgG ELISA
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- Günter Bader
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1 Arbeitsanleitung Röteln IgG ELISA Enzymimmunoassay auf Mikrotiterbasis zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von humanen IgG-Antikörpern gegen Rubellavirus in Serum und Plasma Z Kat.-Nr.: ILE-RUB01 Lagerung: 2-8 C Nur für in-vitro Diagnostik Dezember 2014 IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D Kassel Tel: , Fax: , info@immunolab.de
2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Verwendungszweck 3 2. Klinische Bedeutung 3 3. Testprinzip 3 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4 5. Inhalt des Testbestecks 4 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben 5 8. Testdurchführung 5 9. Auswertung Testcharakteristika Literatur 8 Symbole und Übersetzungen Symbol English French German Italian Spanish Greek CAL Calibrator Etalon Standard Calibratore Calibrador Πρότυπο Διάλυμα Conjugate Conjugué Konjugat Coniugato Conjugado Διάλυμα CONJ Συμπλόκου CONC SAMP DIL STOP SUBS MT PLATE WASH BUF Stop Solution Concentré (<n> fois) Diluant échantillon Solution d arrêt Konzentrat (<n>-fach) Proben verdünner Stopp-Lösung Concentrate (<n>-fold) Sample Diluent Concentrato Diluente del campione Soluzione d arresto Concentrado (<n>-veces) Diluyente de muestra Solución de parada Συμπύκνωση (<n> φορές) Διάλυμα Αραίωσης Δειγμάτων Διάλυμα Αναστολής Substrate Substrat Substrat Substrato Sustrato Διάλυμα Υποστρώ ματος Microtiter plate Wash buffer Microplaque Mikrotiterplatte Piastre Placa microtiter Tampon de lavage Waschpuffer Soluzione di lavaggio Tampón de lavado Μικρόπλακα Πλυστικό Διάλυμα :03 2
3 1. Verwendungszweck Der Röteln IgG ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von humanen IgG- Antikörpern gegen Rubellavirus im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion. Dieser Test ist nur für in-vitro-diagnostische Anwendungen ausgelegt. Die Anwendung zum Monitoring von Transplantationsempfängern bzw. in anderen Körperflüssigkeiten wurde nicht evaluiert und erfolgt ggf. in alleiniger Verantwortung des Anwenders. Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden. 2. Klinische Bedeutung Röteln gehören zu den klassischen Kinderkrankheiten mit lebenslanger Immunität, wobei das Virus weltweit endemisch verbreitet ist. In nichtgeimpften Populationen erfolgen 80-90% der Infektionen im Kindesalter. Trotz der 1974 eingeführten Rötelnimpfung kommt es in Deutschland immer noch zu einigen konnatalen Erkrankungen. Der Erreger ist ein genetisch stabiles RNA-Virus, das in der Familie der Togaviridae dem Genus Rubivirus zugeordnet wird. Der Mensch ist der einzige bekannte natürliche Wirt für das Rötelnvirus. Die Übertragung erfolgt über Tröpfcheninfektion, mit einer Inkubationszeit von Tagen. Klinisch manifestiert sich die Erkrankung wie ein leichter grippaler Infekt. Die nuchalen und retroaurikulären Lymphknoten sind geschwollen, und man beobachtet eine mäßige Milzvergrößerung. Bei nur geringem Krankheitsgefühl tritt eine kurze und mittlere Temperaturerhöhung auf. Röteln werden leicht mit harmlosen und leichten Erscheinungen im Kindesalter überstanden, verdienen jedoch Aufmerksamkeit wegen der durch sie verursachten kindlichen Missbildungen bei der Infektion nichtgeimpfter Mütter. Da die Infektion über die Plazenta weiter gegeben wird, kann der sich entwickelnde Fötus schwere Schäden nehmen, deren Häufigkeit und Schweregrad vom Infektionszeitpunkt während der Schwangerschaft abhängen. Eine Rötelninfektion im Monat kann zum Spontanabort oder zur Frühgeburt führen. Da eine spezifische kausale Therapie nicht existiert, werden die Sekundärsymptome wie Fieber, Arthritiden oder Arthralgien symptomatisch behandelt. Die klinische Differentialdiagnose ist problematisch, da ähnliche Exantheme und fieberhafte Erkrankungen auch bei anderen Kinderkrankheiten wie Masern, Scharlach und Ringelröteln auftreten. Es stehen folgende Labormethoden zur Verfügung: Hämagglutinationshemmtest (HHT), Hämolysis-in-Gel Test oder ELISA. Wichtig ist der Nachweis virusspezifischer IgM-Antikörper bei frischen Infektionen, der IgG Test dient dem Nachweis der Immunität. Bei schweren konnatalen Infektionen kann auch eine Isolierung des Rubella-Virus aus Rachenspülflüssigkeit, Urin und anderen Sekreten versucht werden. 3. Testprinzip Der IMMUNOLAB Röteln IgG Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays (EIA). Auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist Rubellavirus-Antigen gebunden. Verdünntes Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Kalibratoren werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Es findet eine Bindung zwischen den IgG-Antikörpern aus dem Serum und dem immobilisierten Rubellavirus-Antigen statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte mit verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen. Danach wird gebrauchsfertiges Anti-human-IgG-Peroxidase Konjugat zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert und 20 Minuten inkubiert, wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Konzentration der IgG-Antikörper ist der Intensität der Färbung direkt proportional :03 3
4 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten. Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden auf HBsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden. Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.b. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden. Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht werden. Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden. Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen. Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden sollten. Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate Einmal- Pipettenspitzen verwendet werden. Es dürfen keine Reagenzien von verschiedenen Kitchargen verwendet und diese nicht miteinander vermischt werden. Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen. In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a. Mikropipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader). Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen. 5. Inhalt des Testbestecks Komponenten Volumen / Menge MT PLATE Rubellavirus-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen 12 CAL Kalibratoren (Standards) 0, 10, 50, 200, 500 IU/mL CONJ Anti-human-IgG-Enzymkonjugat SUBS Substratlösung STOP Stopp-Lösung SAMP DIL Probenverdünner 5 x 2 ml 15 ml 15 ml 15 ml 60 ml WASH BUF CONC Waschpuffer (10 ) 60 ml Plastikfolien 2 Plastikbeutel 1 Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten) Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8 C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und der Kit wieder bei 2-8 C gelagert werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden, der endverdünnte Waschpuffer hält 4 Wochen bei 2-8 C MT PLATE Mikrotiterstreifen 12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit Rubellavirus-Antigen (Stamm HPV-77, kultiviert in Affennierenzellen). Gebrauchsfertig :03 4
5 5.2. CAL Kalibratoren A-E (Standards) 5 x 2 ml, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit 0, 10, 50, 200, 500 IU/mL an IgG-Antikörpern gegen Rubellavirus. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig CONJ Anti-human-IgG-Enzymkonjugat 15 ml, Anti-human-IgG-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l Proclin TM. Gebrauchsfertig SUBS Substratlösung 15 ml, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig STOP Stopp-Lösung 15 ml, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig SAMP DIL Probenverdünner 60 ml, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig WASH BUF CONC Waschpuffer 60 ml, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen Plastikfolien 2 Stück zur Abdeckung der Mikrotiterplatten während der Inkubation Plastikbeutel Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen. 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 µl-, 100 µl- und 500 µl-mikro- bzw. Mehrkanalpipetten Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Mikrotiterplatten-Waschgerät Reagenzgläser für die Serumverdünnung Bidestilliertes Wasser 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Citrat) verwendet werden. Aus dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum durch Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 2 Tagen gekühlt (2-8 C) haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20 C gelagert werden. Die Proben sollten nicht mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell kontaminierte Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Standards) mit gebrauchsfertigem Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.b. 5 µl Serum µl Probenverdünner). 8. Testdurchführung 8.1. Vorbereitung der Reagenzien Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen :03 5
6 Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen. Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden. Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Mit jedem Test muss eine Standardkurve erstellt werden. Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen Einzelne Assay-Schritte 1. Für die Kalibratoren und die Proben im Doppelansatz sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl an Mikrotitervertiefungen vorbereiten. 2. Je 100 µl der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Kalibratoren in die Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 3. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren. 4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 5. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 6. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. 7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 8. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 9. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.b. Schublade) 20 Minuten inkubieren. 10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µl der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion bei 450 nm (eventuell Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil. 9. Auswertung Es werden die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen jeweils nach Abzug des Substrat- Leerwerts berechnet. Die Abweichung zwischen den Einzelwerten sollte unter 10 % liegen. Beispiel Substrat-Leerwert 0,020 Messwerte (OD) korr. Messwerte (OD) Mittelwert (OD) Kalibrator A (0 IU/mL) 0,029 / 0,035 0,009 / 0,015 0,012 Kalibrator B (10 IU/mL) 0,479 / 0,462 0,459 / 0,442 0,451 Kalibrator C (50 IU/mL) 1,235 / 1,269 1,215 / 1,249 1,232 Kalibrator D (200 IU/mL) 2,062 / 2,109 2,042 / 2,089 2,066 Kalibrator E (500 IU/mL) 2,483 / 2,409 2,463 / 2,389 2,426 Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien in gleicher Art wiedergefunden werden müssen :03 6
7 9.1. Qualitative Auswertung Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off Standard (10 IU/ml) verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives Resultat. Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Standards liegt ein negatives Resultat vor. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu definieren. Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum oder mit einer nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide Proben sollten parallel in einem Testansatz gemessen werden Quantitative Auswertung Die gebrauchsfertigen Kalibratoren des Röteln-IgG-Antikörper Kits sind auf Internationale Units (IU/mL) mit dem WHO-Standard RUBI-1-94 (1st Intl. Standard) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung. Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für die Kalibratoren sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionen der Kalibratoren gegen ihre Konzentrationen graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die Extinktion jeder Patientenprobe das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden. Es können auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. 10. Testcharakteristika Röteln ELISA IgG Intra-Assay-Präzision 4,3 7,2 % Inter-Assay-Präzision 2,6 17,0 % Inter-Lot-Präzision 5,3 23,2 % Analytische Sensitivität 0,29 IU/mL Wiederfindung % Linearität % Kreuzreaktivität Interferenzen Keine Kreuzreaktivität gegen Herpes 1, Zytomegalie, Toxoplasma, dsdna, Masern, Mumps, Varizella und EBV-VCA. Interferenzen von Parainfluenza und Parvovirus positiven Proben können nicht vollständig ausgeschlossen werden. Keine Interferenzen mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/ml, Hämoglobin bis zu 8,0 mg/ml und Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/ml Klinische Spezifität 100 % Klinische Sensitivität 100 % Messbereich IU/mL :03 7
8 11. Literatur 1. Davidkin, I. et al.: Epidemiology of rubella in Finland. Euro. Surveill. 1: 9 (2004). 2. Gutierrez-Zufiaurre, N. et al.: Seroprevalence of antibodies against Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, rubella virus, hepatitis B and C virus, and HIV in pregnant women. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(9): 512 (2004). 3. Ki, M. R. et al.: Rubella seroprevalence in Korean children. J. Korean Med. Sci. 18(3): 331 (2003). 4. Pinsky, N. A. et al.: Effect of multiple freeze-thaw cycles on detection of measles, mumps, and rubella virus antibodies. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10(1): 19 (2003). 5. Mitchell, L. A. et al.: Characterization of rubella virus-specific antibody responses by using a new synthetic peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 30(7): 1841 (2002). 6. Rafila, A. et al.: A large rubella outbreak, Romania Euro. Surveill. 1: 4 (2004). 7. Reis, M. M. et al.: Avidity of IgG for rubella: an evaluation of the need for implementation at the Materno-Infantil Presidente Vargas Hospital in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil. Braz. J. Infect. Dis. 8(3): 249 (2004). 8. Rey, L. C. et al.: Serologic survey of rubella in the pre-vaccine era in child-care centers, schools and maternity units of Fortaleza. J. Pediatr. (Rio J.). 74(6): 467 (1998). 9. Shapiro, R. et al.: Protein-enhanced fluorescein chemiluminescence used in an immunoassay for rubella antibody in serum. Clin. Chem. 30: 889 (1984). 10. Skurrie, I. J. et al.: Detection of rubella-specific immunoglobulin G: comparison of the enzyme-linked immunosorbent assay and an automated microparticle enzyme immunoassay (IMx). J. Clin. Microbiol. 29(8): 1752 (1991). 11. Terada, K.: Rubella and congenital rubella syndrome in Japan: epidemiological problems. Jpn. J. Infect. Dis. 56(3): 81 (2003). 12. Ushida, M. et al.: Congenital rubella syndrome due to infection after maternal antibody conversion with vaccine. Jpn. J. Infect. Dis. 56(2): 68 (2003). 13. WHO Europe: Strategic plan for measles and congenital rubella infection in the European region of the WHO :03 8
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