Rheumafaktor IgG ELISA

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1 Arbeitsanleitung Rheumafaktor IgG ELISA Enzymimmunoassay auf Mikrotiterbasis zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Rheumafaktor (RF) IgG in Serum und Plasma Kat.-Nr.: Lagerung: ILE-RHF C Dezember 2014 IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D Kassel Tel: , Fax: , info@immunolab.de

2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Verwendungszweck 3 2. Klinische Bedeutung 3 3. Testprinzip 3 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4 5. Inhalt des Testbestecks 4 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben 6 8. Testdurchführung 6 9. Auswertung Testcharakteristika Literatur 8 2

3 1. Verwendungszweck Der Rheumafaktor IgG ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von Rheumafaktor IgG im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion. Weitere Anwendungen in anderen Körperflüssigkeiten sind möglich und können beim Technischen Service von IMMUNOLAB erfragt werden. Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden. 2. Klinische Bedeutung Die Bestimmung der IgG, IgA und IgM Rheumafaktoren wird vor allem bei der Differentialdiagnose von Rheumatischer Arthritis (RA), wobei überwiegend positive Testergebnisse auftreten, und rheumatischem Fieber eingesetzt. Es scheinen auch RF-IgG-Immunkomplexe als Mediatoren einer immunologischen Verletzung eine pathogenetische Rolle zu spielen. Daneben findet man Rheumafaktoren auch bei anderen Autoimmunkrankheiten wie systemischem Lupus erythematosus, Hepatitis, Leberzirrhose, Bronchialasthma, synovialen Entzündungen und bakterieller Endokarditis. Rheumafaktoren sind in der Serologie seit langem als interferierende Substanzen bei bestimmten Nachweistesten bekannt (vor allem IgM). Dies ist in ihrer Eigenschaft begründet, mit dem Fc Teil von Immunglobulin G zu reagieren. Rheumafaktoren können zu den Klassen IgG, IgA und IgM gehören, wobei letztere in diesem Zusammenhang die größte Bedeutung zu haben scheinen. Im Rahmen der klassischen serologischen Methoden ist schon seit Jahrzehnten die Bestimmung des Rheumafaktors (RF-Test) mithilfe der Agglutination gebräuchlich. Daneben wurden Tests mit sensibilisierten Erythrozyten (Waaler-Rose) eingesetzt. Diese Nachweise zeigen aber im Vergleich zu modernen ELISA Tests eine deutlich niedrigere Sensitivität und erlauben keine Differenzierung der Immunglobulinklasse, da sie nur das pentamere IgM nachweisen. Heute ist es möglich, mit dem Enzymimmunoassay alle drei Rheumafaktoren vom Typ IgG, IgA und IgM nebeneinander mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität quantitativ zu bestimmen. Die von IMMUNOLAB angebotenen Testkits können auch auf gängigen automatischen Gerätesystemen abgearbeitet werden. 3. Testprinzip Der IMMUNOLAB Rheumafaktor IgG Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays (EIA). Auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist IgG von der Ziege gebunden. Verdünntes Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Kalibratoren bzw. Kontrollen werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Es findet eine Bindung zwischen den Rheumafaktor IgG aus dem Serum und dem immobilisierten Ziegen IgG statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte mit verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen. Danach wird gebrauchsfertiges Anti-human-IgG-Peroxidase Konjugat zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert und 20 Minuten inkubiert, wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Konzentration des Rheumafaktor IgG ist der Intensität der Färbung direkt proportional. 3

4 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten. Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden auf HBsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden. Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.b. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden. Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht werden. Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden. Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen. Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden sollten. Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate Einmal- Pipettenspitzen verwendet werden. Es dürfen keine Reagenzien von verschiedenen Kitchargen verwendet und diese nicht miteinander vermischt werden. Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen. In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a. Mikroliterpipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader). Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen. 5. Inhalt des Testbestecks Komponenten Volumen / Menge Ziege IgG beschichtete Mikrotiterstreifen 12 Kalibratoren mit 0, 50, 100 und 200 IU/mL 4 x 2 ml Positive Kontrolle 2 ml Negative Kontrolle 2 ml Anti-human-IgG-Enzymkonjugat 15 ml Substratlösung 15 ml Stopp-Lösung 15 ml Probenverdünner 60 ml Waschpuffer (10 ) 60 ml Plastikfolien 2 Plastikbeutel 1 4

5 Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten) Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8 C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und der Kit wieder bei 2-8 C gelagert werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden Mikrotiterstreifen 12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit affinitätsgereinigtem Ziegen IgG. Gebrauchsfertig Kalibratoren 4 x 2 ml, humanes Serum verdünnt mit PBS, mit 0, 50, 100 und 200 IU/mL von IgG Rheumafaktor. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig Positive Control 2 ml, humanes Serum verdünnt mit PBS, enthält Rheumafaktor IgG. Der Konzentrationsbereich ist auf dem Etikett angegeben. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig Negative Control 2 ml, humanes Serum verdünnt mit PBS, enthält kein Rheumafaktor IgG. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig Anti-human-IgG-Enzymkonjugat 15 ml, Anti-human-IgG-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l Proclin TM. Gebrauchsfertig Substratlösung 15 ml, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig Stopp-Lösung 15 ml, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig Probenverdünner 60 ml, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig Waschpuffer 60 ml, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen Plastikfolien 2 Stück zur Abdeckung der Mikrotiterplatten während der Inkubation Plastikbeutel Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen. 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 µl-, 100 µl- und 500 µl-mikro- bzw. Mehrkanalpipetten Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Mikrotiterplatten-Waschgerät Reagenzgläser für die Serumverdünnung Bidestilliertes Wasser 5

6 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Heparin) verwendet werden. Aus dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum durch Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 2 Tagen gekühlt (4-8 C) haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20 C gelagert werden. Die Proben sollten nicht mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell kontaminierte Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Kalibratoren) mit gebrauchsfertigem Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.b. 5 µl Serum µl Probenverdünner). 8. Testdurchführung 8.1. Vorbereitung der Reagenzien Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen. Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden. Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Mit jedem Test muss eine Kalibratorkurve erstellt werden. Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen Einzelne Assay-Schritte 1. Für die Kalibratoren sowie die Proben und Kontrollen im Doppelansatz sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl an Mikrotitervertiefungen vorbereiten. 2. Je 100 µl der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Kalibratoren und Kontrollen in die Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 3. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren. 4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 5. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 6. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. 7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 8. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 9. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.b. Schublade) 20 Minuten inkubieren. 10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µl der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 6

7 11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion bei 450 nm (eventuell Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil. 9. Auswertung Es werden die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen jeweils nach Abzug des Substrat-Leerwerts berechnet. Die Abweichung zwischen den Einzelwerten sollte unter 10 % liegen. Beispiel Messwerte (OD) korr. Messwerte (OD) Mittelwert (OD) Substratleerwert 0,010 Kalibrator 1 (0 IU/mL) 0,039 / 0,041 0,029 / 0,031 0,030 Kalibrator 2 (50 IU/mL) 0,744 / 0,698 0,734 / 0,688 0,711 Kalibrator 3 (100 IU/mL) 1,318 / 1,360 1,298 / 1,350 1,324 Kalibrator 4 (200 IU/mL) 2,035 / 2,123 2,025 / 2,113 2,069 Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien in gleicher Art wiedergefunden werden müssen Qualitative Auswertung Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off Kalibrator (= 50 IU/mL) verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives Resultat. Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Kalibrators liegt ein negatives Resultat vor. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu definieren. Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum oder mit einer nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide Proben sollten parallel in einem Testansatz gemessen werden. Der Kalibrator 4 muss mindestens die doppelte Extinktion verglichen mit dem Cut-Off Kalibrator zeigen Quantitative Auswertung Die gebrauchsfertigen Kalibratoren und Kontrollen des Rheumafaktor-IgG-Kits sind auf Intl. Units (IU/mL) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung. Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für Kontrollen und Kalibratoren sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionen der Kalibratoren gegen ihre Konzentrationen graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die Extinktion jeder Patientenprobe oder Kontrolle das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden. Es können auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. 7

8 10. Testcharakteristika Rheumafaktor IgG ELISA IgG IgA IgM Intra-Assay-Präzision 6.3 % 6.2 % 4.4 % Inter-Assay-Präzision 2.4 % 9.1 % 7.3 % Inter-Lot-Präzision % % % Analytische Sensitivität 0.67 IU/mL 0.28 IU/mL 0.16 IU/mL Wiederfindung % % % Linearität % % % Kreuzreaktivität Interferenzen Keine Kreuzreaktivität gegen Rheumafaktoren IgA und IgM. Keine Interferenzen mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/ml, Hämoglobin bis zu 8,0 mg/ml und Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/ml Klinische Spezifität 100 % 94 % 100 % Klinische Sensitivität 100 % 100 % 91 % Messbereich IU/mL IU/mL IU/mL 11. Literatur 1. Adebajo AO; Wright JK; Cawston TE; Hazleman BL: Rheumatoid factor quantitation: a comparison of ELISA and nephelometric methods. Med Lab Sci 1991 Jan; 48(1): Banchuin N; Janyapoon K; Sarntivijai S; Parivisutt L: Re-evaluation of ELISA and latex agglutination test for rheumatoid factor detection in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Asian Pac J Allergy Immunol 1992 Jun; 10(1): Barka NE; Agopian MS; Peter JB: False-positive IgM antibodies to Borrelia burgdorferi in indirect ELISA as a result of IgM rheumatoid factor. J Infect Dis 1990 Jun; 161(6): Dabadghao S; Misra R; Naveed M; Aggarwal A: IgM rheumatoid factor estimation by ELISA in seronegative rheumatoid arthritis. Rheumatol Int 1996; 15(5): Espersen GT; Ernst E; Vestergaard M; Grunnet N: ELISA estimations of rheumatoid factor IgM, IgA, and IgG in sera from RA patients with high disease activity. Scand J Rheumatol Suppl 1988; 75: Gargiulo AV Jr; Toto PD; Robinson JA; Gargiulo AW: Latex slide agglutination vs. ELISA system. Rheumatoid factor detection. J Periodontal Res 1985 Jan; 20(1): Gioud-Paquet M; Auvinet M; Raffin T; Girard P; Bouvier M; Lejeune E; Monier JC: IgM rheumatoid factor (RF), IgA RF, IgE RF, and IgG RF detected by ELISA in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1987 Jan; 46(1): Hoier-Madsen M; Grunnet N; Wiik A: A Danish inter-laboratory study of IgM rheumatoid factor (RF) determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Scand J Rheumatol Suppl 1988; 75: Jonsson T; Arnason JA; Valdimarsson H: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) screening test for detection of rheumatoid factor. Rheumatol Int 1986; 6(5): Karsh J; Halbert SP; Anken M; Klima E; Steinberg AD: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor measured by ELISA in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 1982; 68(1): Lucic N; Mahic Zikic A; Lipa I; Seremet M: Comparison of the immunoenzyme test (ELISA) with other methods in the detection of rheumatoid factor. Reumatizam 1989; 36(1-6):