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1 WESAMIN GmbH & Co. KG Arbeitsanleitung Histamin - Lebensmittel ELISA Enzymimmunoassay für die quantitative Bestimmung von Histamin in Wein, Fischmehl, Fisch, Wurst, Käse und Milch REF HLM C WESAMIN GmbH & Co.KG / Gesellschaft für die Entwicklung und Produktion von diagnostischen Artikeln mbh Graff Oersdorf Tel Fax Internet: Version 1, Juli 2011 Seite 2

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Testprinzip Seite 4 2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Seite 5 3. Lagerung und Haltbarkeit Seite 5 4. Inhalt des Testbestecks Seite 6 5. Probenvorbereitung Seite 8 6. Vorbereitung der Reagenzien Seite 9 7. Testdurchführung zur Bestimmung in Wein und Fischmehl Seite Testdurchführung zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse Seite Auswertung Seite Testcharakteristika Seite 15 Pipettierschema zur Bestimmung in Wein und Fischmehl Seite 19 Pipettierschema zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse Seite Einleitung und Testprinzip Histamin ist ein Naturstoff, der im menschlichen und tierischen Organismus weit verbreitet ist. Er ist gut wasserlöslich und hat einen basischen Charakter. Histamin gehört biochemisch zu den biogenen Aminen und wird aus der Aminosäure Histidin durch Decarboxylierung gebildet. Der Prozess der Decarboxylierung wird z.t. bewusst zur Reifung bestimmter Lebensmittel eingesetzt. Ein erhöhter Histamingehalt in Lebensmittel kann aber auch durch bakteriellen Verderb hervorgerufen werden. Eine übermäßige Histaminbelastung kann auf Grund der unkontrollierten Histaminaufnahme durch bestimmte Nahrungsmittel, wie Wein, Sekt, Fisch, Käse, Wurst u.a. auftreten. Diese toxischen Begleiterscheinungen können, besonders bei Allergikern, zu Symptomen, wie Kopfschmerzen, Migräne, Asthmaanfälle, Magen und Darmbeschwerden, Herzrhythmusstörungen, Hautreaktionen und Leberschädigungen führen. Der Histamin-Lebensmittel ELISA-Kit enthält Reagenzien für die quantitative Bestimmung von derivatisiertem Histamin in Lebensmitteln. Die Derivatisierung erfolgt während der Acylierung, dabei wird Histamin durch das Acylierungsreagenz quantitativ in N-Acylhistamin umgewandelt. Der Histamin-Lebensmittel ELISA ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay. An die Festphase gebundenes und freies, in Lösung befindliches Antigen konkurrieren um eine definierte Anzahl von Antikörper- Bindungsstellen. Wenn sich das System im Gleichgewicht befindet, wird der nicht-gebundene Antigen-Antikörper-Komplex in einem Waschschritt entfernt und der entsprechend gebundene Komplex mittels eines Peroxidase-Konjugats nachgewiesen und über den Umsatz von Tetramethylbenzidin (TMB) bestimmt. Die TMB/POD-Reaktion wird gestoppt und bei 450 nm gemessen. Die Konzentration des an die Festphase gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexes ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe. Seite 3 Seite 4

3 2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Dieser Kit ist lediglich zum in vitro-gebrauch bestimmt. Die angegebenen Verfallsdaten sind unbedingt zu beachten. Die Reagenzien bis zur Verwendung bei 2-8 C lagern. Während der Testdurchführung Einmal-Handschuhe und Schutzbrille tragen. Ein Teil der Komponenten dieses Testbestecks sind kennzeichnungspflichtig. Diese Komponenten tragen das entsprechende Gefahrensymbol auf ihrem Etikett. 3. Lagerung und Haltbarkeit Der Kit ist bei Lagerung zwischen 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Zur Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Reagenzien siehe Vorbereitung der Reagenzien. Alle Reagenzien müssen vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur gebracht und sofort nach Gebrauch wieder kühl gestellt werden. 4. Inhalt des Testbestecks 4.1 MT-Streifen STRIPS-HIS 12 Streifen Mikrotiterstreifen mit je 8 Kavitäten, einzeln abbrechbar beschichtet mit Histamin. 4.2 Standards 1-9 CAL Fläschchen Je 4 ml, gebrauchsfertig, Konzentrationen: Standard: Histamin µg / l nmol / l µg/l = µg/kg = ppb = ng/ml Für die Bestimmung in Wein und Fischmehl werden der Std 1 und die Std s 4 9 verwendet. Für die Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse werden die Std s 1 7 verwendet. 4.3 Kontrolle CON 1 Fläschchen 4 ml, gebrauchsfertig Bereich: Siehe Q.C.-Zertifikat im Kit 4.4 Acylierungspuffer ACYL-BUFF 1 Fläschchen 21 ml, gebrauchsfertig 4.5 Acylierungsreagenz ACYL-REAG 3 Fläschchen lyophilisiert, Inhalt eines Fläschchens mit 1,8 ml DMF bzw. SOLVENT lösen und gegebenenfalls vereinigen (s. auch 6.1) 4.6 Histamin-Antiserum AS-HIS 1 Fläschchen 5,5 ml, gebrauchsfertig, blau gefärbt Kaninchen-anti-N-Acylhistamin 4.7 Enzymkonjugat CONJ 1 Fläschchen 12 ml, gebrauchsfertig Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase Seite 5 Seite 6

4 4.8 Waschpuffer WASH 1 Fläschchen 20 ml, Konzentrat Inhalt jedes Fläschchens mit bidest. Wasser auf 500 ml auffüllen. 4.9 Substrat SUB 1 Fläschchen 12 ml TMB-Lösung, gebrauchsfertig 4.10 Stopplösung STOP 1 Fläschchen 12 ml, gebrauchsfertig Enthält 0,3 M Schwefelsäure 4.11 Reaktionsplatte ACYL-PLATE 1 Stück für die Acylierung 4.12 DMF DMF 1 Fläschchen 6 ml DMF zum Lösen des Acylierungsreagenzes in der Variante zur Bestimmung in Wein und Fischmehl 4.13 Lösungsmittel SOLVENT 1 Fläschchen 6 ml Lösungsmittel zum Lösen des Acylierungsreagenzes in der Variante zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse Enthält DMSO und Aceton 4.14 Haftklebefolie FOIL 2 Stück Gebrauchsfertig Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten): Evtl: Präzipitator zur Probenvorbereitung von Milch und Sahne Pipetten für 10, 25, 50, 100 und 1000 µl Mehrkanalpipette oder Waschgerät Photometer für die Auswertung von Mikrotiterplatten (450 nm) 5. Probenvorbereitung 5.1 Wein 10 µl der Weinproben werden ohne Probenvorbereitung direkt zur Acylierung eingesetzt (keine Probenvorbereitung erforderlich). 5.2 Fischmehl 0,1 g Fischmehl in 20 ml Wasser (oder 1 g in 200 ml) suspendieren und für 20 Minuten durchmischen. Von dieser Suspension 1 ml in ein Eppendorf Reaktionsgefäß (oder Vergleichbares) überführen und für 5 Minuten bei mind g zentrifugieren. 20 µl des Überstandes mit 200 µl Wasser verdünnen und durchmischen. Hiervon werden 10 µl zur Acylierung eingesetzt. 5.3 Fisch, Wurst und Käse 10 g Fisch, Wurst oder Käse in 100 ml Wasser (oder 20 g in 200 ml) in einem Haushaltsmixer (oder Vergleichbares) für 2 Minuten homogenisieren. Von dieser Suspension 1 ml in ein Eppendorf Reaktionsgefäß (oder Vergleichbares) überführen und für 5 Minuten bei mind g zentrifugieren. 20 µl des Überstandes mit 500 µl Wasser verdünnen und durchmischen. Hiervon werden 25 µl zur Acylierung eingesetzt. 5.4 Milch und Sahne Zur Probenvorbereitung ist ein Präzipitator erforderlich. Dieser ist gesondert zu bestellen (keine Komponente des Kits). 50 µl Milch oder Sahne in ein Eppendorf Reaktionsgefäß (oder Vergleichbares) vorlegen und mit 25 µl Präzipitator versetzen. Anschließend 500 µl Wasser hinzugeben und für 10 Minuten schütteln lassen. Abschließend 5 Minuten bei mind g zentrifugieren. 25 µl des Überstandes werden zur Acylierung eingesetzt. Seite 7 Seite 8

5 6. Vorbereitung der Reagenzien 6.1 Acylierungsreagenz ACYL-REAG Das Acylierungsreagenz sollte unmittelbar vor Gebrauch frisch gelöst werden und nach Gebrauch ist der verbleibende Rest zu verwerfen. Durch die drei Flaschen im Kit ist der ELISA in drei Ansätzen teilbar. Falls der Kit in einem Ansatz verbraucht werden soll, den aufgelösten Inhalt zweier Fläschchen vereinigen Zur Bestimmung in Wein und Fischmehl Inhalt eines Fläschchens in 1,8 ml DMF lösen und für 5 min auf einen Horizontal-Schüttler oder Rollmischer legen. Bitte beachten: DMF reagiert mit vielen Plastikmaterialien, z.b. Plastikschälchen. Es reagiert nicht mit normalen Pipettenspitzen und Glasgefäßen Zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse Inhalt eines Fläschchens in 1,8 ml Solvent lösen und für 5 min auf einen Horizontal-Schüttler oder Rollmischer legen. Bitte beachten: Lösungsmittel reagieren mit vielen Plastikmaterialien, z.b. Plastikschälchen. Sie reagieren nicht mit normalen Pipettenspitzen und Glasgefäßen. Solvent ist leicht flüchtig und verdampft schnell. Daher bitte keine Gefäße zusammen mit Mehrkanalpipetten verwenden, da sie eine hohe Oberfläche besitzen. Bitte Multipetten o.ä. verwenden, das aufgelöste Acylierungsreagenz direkt aus dem Fläschchen aufziehen und Vertiefung für Vertiefung pipettieren. 6.2 Waschpuffer WASH Inhalt des Fläschchens mit destilliertem Wasser auf 500 ml auffüllen. Der fertige Waschpuffer muss für den späteren Gebrauch bei 2-8 C gelagert werden und bleibt so für 4 Wochen verwendbar. 7. Testdurchführung zur Bestimmung in Wein und Fischmehl 7.1 Acylierung (Wein und Fischmehl) Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Es empfiehlt sich, Doppelbestimmungen anzusetzen. Die für die Acylierung verwendeten Vertiefungen der Reaktionsplatte markieren (Edding) und nicht noch einmal verwenden! µl Standard 1 und 4-9, 10 µl Kontrolle, 10 µl Wein oder 10 µl vorbereitete Fischmehlprobe in die jeweiligen Vertiefungen der im Kit enthaltenen Reaktionsplatte pipettieren. 2. Je 200 µl Acylierungspuffer in alle Vertiefungen pipettieren. 3. Reaktionsplatte ca. 10 Sekunden auf einem Horizontalschüttler mischen 4. Je 25 µl frisch angesetztes Acylierungsreagenz (gelöst in DMF) in alle Vertiefungen pipettieren und sofort schütteln. Bitte beachten: DMF reagiert mit vielen Plastikmaterialien, z.b. Plastikschälchen. Es reagiert nicht mit normalen Pipettenspitzen und Glasgefäßen. 5. Reaktionsplatte 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. Je 10 µl werden hiervon im ELISA eingesetzt. Alle anderen Reagenzien sind gebrauchsfertig. Seite 9 Seite 10

6 7.2 ELISA (Wein und Fischmehl) Die Reagenzien auf Raumtemperatur bringen µl acylierte Standards 1 und 4-9, 10 µl acylierte Kontrolle und 10 µl acylierte Proben in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterstreifen pipettieren µl des Antiserums in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterstreifen pipettieren. Platten mit Haftklebefolie abdecken und 45 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. 3. Vertiefungen entleeren, mit ca. 250 µl Waschpuffer füllen und wieder entleeren. Anschließend die Mikrotiterstreifen umgedreht auf eine saugfähige Unterlage (Papierhandtuch) legen und kurz ausklopfen, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. Diesen Vorgang insgesamt 4 mal durchführen. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugat in die Vertiefungen pipettieren. 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. 5. Waschen: Wie unter Punkt 3. beschrieben. 6. Jeweils 100 µl Substrat in die Vertiefungen pipettieren und 15 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. 7. Jeweils 100 µl Stopplösung in die Vertiefungen pipettieren; dabei die gleiche Reihenfolge und den gleichen Zeittakt einhalten wie bei Zugabe der Substratlösung. 8. Streifen im Mikrotiterplattenphotometer bei einer Messwellenlänge von 450 nm innerhalb 15 Minuten (Referenzwellenlänge zwischen 570 nm und 650 nm) messen. 8. Testdurchführung zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch und Käse 8.1 Acylierung (Fisch, Wurst, Milch und Käse) Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Es empfiehlt sich, Doppelbestimmungen anzusetzen. Die für die Acylierung verwendeten Vertiefungen der Reaktionsplatte markieren (Edding) und nicht noch einmal verwenden! 1. Je 25 µl Standard 1-7, 25 µl Kontrolle, 25 µl vorbereitete Probe in die jeweiligen Vertiefungen der im Kit enthaltenen Reaktionsplatte pipettieren. 2. Je 200 µl Acylierungspuffer in alle Vertiefungen pipettieren. 3. Reaktionsplatte ca. 10 Sekunden auf einem Horizontalschüttler mischen 4. Je 25 µl frisch angesetztes Acylierungsreagenz (gelöst im Solvent) in alle Vertiefungen pipettieren und sofort schütteln. Platte nicht abkleben oder abdecken, Platte offen schütteln. Bitte beachten: Lösungsmittel reagieren mit vielen Plastikmaterialien, z.b. Plastikschälchen. Sie reagieren nicht mit normalen Pipettenspitzen und Glasgefäßen. Solvent ist leicht flüchtig und verdampft schnell. Daher bitte keine Gefäße zusammen mit Mehrkanalpipetten verwenden, da sie eine hohe Oberfläche besitzen. Bitte Multipetten o.ä. verwenden, das aufgelöste Acylierungsreagenz direkt aus dem Fläschchen aufziehen und Vertiefung für Vertiefung pipettieren. 5. Reaktionsplatte 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. Je 25 µl werden hiervon im ELISA eingesetzt. Seite 11 Seite 12

7 8.2 ELISA (Fisch, Wurst, Milch und Käse) Die Reagenzien auf Raumtemperatur bringen µl acylierte Standards 1-7, 25 µl acylierte Kontrolle und 25 µl acylierte Proben in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterstreifen pipettieren µl des Antiserums in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterstreifen pipettieren. Platten mit Haftklebefolie abdecken und 45 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler inkubieren. 3. Vertiefungen entleeren, mit ca. 250 µl Waschpuffer füllen und wieder entleeren. Anschließend die Mikrotiterstreifen umgedreht auf eine saugfähige Unterlage (Papierhandtuch) legen und kurz ausklopfen, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. Diesen Vorgang insgesamt 4 mal durchführen. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugat in die Vertiefungen pipettieren. 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. 5. Waschen: Wie unter Punkt 3. beschrieben. 6. Jeweils 100 µl Substrat in die Vertiefungen pipettieren und 15 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen. 7. Jeweils 100 µl Stopplösung in die Vertiefungen pipettieren; dabei die gleiche Reihenfolge und den gleichen Zeittakt einhalten wie bei Zugabe der Substratlösung. 8. Streifen im Mikrotiterplattenphotometer bei einer Messwellenlänge von 450 nm innerhalb 15 Minuten (Referenzwellenlänge zwischen 570 nm und 650 nm) messen. 9. Auswertung Die OD-Werte der Standards (linear) werden gegen die entsprechenden Konzentrationen der Standards (logarithmisch) aufgetragen. Bei Verwendung eines Computerprogramms wird die 4-Parameter- Analyse empfohlen. Alternativ kann auch die Cubic-Spline-Methode oder die Logit-Log-Berechnung verwendet werden. Die Konzentrationen der Kontrolle und Proben können dann aus den Standardkurven in µg / l abgelesen werden. Die abgelesenen Werte der Proben müssen mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren (s. Tabelle) multipliziert werden. Probenvorbereitung Fisch Milch Probe Wein Fischmehl Wurst Sahne Käse Verdünnungsfaktor ,5 Umrechnung: Histamin: 1 µg / l = 9,00 nmol / l Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Beispiel einer Standardkurve: 2,12 1,62 1,12 0,62 Histamine 0,12 0, Histamine conc. (µg / l) y = ( (A - D)/(1 + (x/c)^b ) ) + D: A B C D R^2 Wine, Fish meal (Standards: Concentration vs Mea... 2,299 0, ,936 0,083 1 Fish, sausage, milk, cheese (Group#1: Concentrati... 2,25 0,837 50,707 0,124 1 Seite 13 Seite 14

8 10. Testcharakteristika 10.1 Sensitivität Die untere Nachweisgrenze wurde bestimmt, indem die 2-fache Standardabweichung der OD des Nullstandards gemessen und die entsprechende Konzentration an der Standardkurve abgelesen wurde. Variante Wein, Fischmehl Variante Fisch, Wurst, Käse, Milch 10.2 Spezifität (Kreuzreaktivitäten) Histamin 12,5 µg / l 0,7 µg / l Der in dem Test verwendete Antikörper ist spezifisch für Histamin. Getestet wurden die Kreuzreaktivitäten zu Tyramin, 3-Methylhistamin, L- Histidin, Tryptamin, Tyrosin. Substanz Kreuzreaktivität (%) Histamin-Ak Histamin 100 Tyramin < 0,005 3-Methylhistamin 0,096 L-Histidin < 0,005 Tryptamin < 0,005 Tyrosin < 0, Wiederfindung Unterschiedliche Mengen an Histamin wurden zu verschiedenen Proben gegeben und anschließend im ELISA gemessen. Die analytische Wiederfindung von Histamin wurde bei verschiedenen Konzentrationen aus den theoretisch erwarteten und den praktisch gemessenen Werten ermittelt. Konzentrationsangaben in µg / l Wiederfindung Histamin in Wein zugesetzt gemessen erwartet % Wiederfindung 0,0 37,8 45,5 98,0 83, , Mittlere Wiederfindung: Wiederfindung Histamin in Fisch zugesetzt gemessen erwartet % Wiederfindung 0,0 4, Mittlere Wiederfindung: 96 Seite 15 Seite 16

9 Wiederfindung Histamin in Milch zugesetzt gemessen erwartet % Wiederfindung 0,0 6,0 51,6 68,1 57, Mittlere Wiederfindung: Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit der ELISA-Methode wurde durch die Ermittlung des Intra-Assay-Variationskoeffizienten durch die wiederholte Messung einer Weinprobe gezeigt. Konzentrationsangaben in µg / l Anzahl n Mittelwert SD VK (%) Histamin ,6 46,6 5,7 Seite 17 Seite 18

10 Pipettierschema zur Bestimmung in Wein und Fischmehl Acylierung Standards Kontrolle Probe Standard 1 und 4 9 µl 10 Kontrolle µl 10 Vorbereitete Probe µl 10 Acylierungspuffer µl Sekunden schütteln Pipettierschema zur Bestimmung in Fisch, Wurst, Milch, Käse Acylierung Standards Kontrolle Probe Standard 1-7 µl 25 Kontrolle µl 25 Vorbereitete Probe µl 25 Acylierungspuffer µl Sekunden schütteln frisch in DMF gelöstes Acylierungsreagenz µl frisch in Solvent gelöstes Acylierungsreagenz µl Sofort für 20 Minuten auf einem Horizontal-Schüttler bei Raumtemperatur schütteln Jeweils 10 µl Überstand im ELISA einsetzen ELISA Standards Kontrolle Probe Acyl. Standard 1 und 4-9 µl 10 Acylierte Kontrolle µl 10 Acylierte Probe µl 10 Antiserum µl Platten mit Haftklebefolie abdecken und 45 Minuten bei Raumtemperatur schütteln 4 x Waschen Enzymkonjugat µl Minuten bei Raumtemperatur schütteln 4 x Waschen Substrat µl Minuten bei Raumtemperatur schütteln Stopplösung µl Messung der Extinktion bei 450 nm Platte nicht abkleben oder abdecken, offen schütteln Sofort für 20 Minuten auf einem Horizontal-Schüttler bei Raumtemperatur schütteln Jeweils 25 µl Überstand im ELISA einsetzen ELISA Standards Kontrolle Probe Acylierte Standard 1-7 µl 25 Acylierte Kontrolle µl 25 Acylierte Probe µl 25 Antiserum µl Platten mit Haftklebefolie abdecken und 45 Minuten bei Raumtemperatur schütteln 4 x Waschen Enzymkonjugat µl Minuten bei Raumtemperatur schütteln 4 x Waschen Substrat µl Minuten bei Raumtemperatur schütteln Stopplösung µl Messung der Extinktion bei 450 nm Seite 19 Seite 20

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