PRIONTYPE post mortem

Transkript

1 Die neue Generation von BSE-Schnelltests Ulrike Krummrei, Claudia Engemann, Thomas Kramer, Jörg Lehmann und Jörg Gabert Labor Diagnostik GmbH Leipzig, Deutscher Platz 5b, Leipzig

2 TSE-Diagnostik Wieso wird noch ein BSE- Test benötigt? In der EU werden derzeit mehr als 10 Mio. Rinder pro Jahr auf BSE getestet. BSE-Schnelltests mit 100% Sensitivität und 100% Spezifität werden daher dringend benötigt. Alle bisher in der EU zugelassenen Tests verwenden zur Probenaufbereitung einen Proteinase K-Schritt. Der PRIONTYPE post mortem kommt ohne Proteinase K- Behandlung aus. Die Ergebnisse des PRIONTYPE post mortem können nicht durch unvollständige oder übermäßige Proteinase K-Behandlung verfälscht werden. Der PRIONTYPE post mortem zeigt 100% Sensitivität und 100% Spezifität ohne falsch negative oder falsch positive Befunde. 2

3 Die Vorteile des PRIONTYPE post mortem innovativ einfach automatisierbar präzise 3

4 Die Vorteile des PRIONTYPE post mortem innovativ Der Fangantikörper des ELISA ist spezifisch für PrP Sc. Daher ist kein Proteinase K-Verdau notwendig. 4

5 Die Vorteile des PRIONTYPE post mortem einfach kurze Probenvorbereitung Es werden keine neuen Laborgeräte benötigt. Die Standardausrüstung von BSE-Laboren ist zur Durchführung des Tests geeignet. 5

6 Die Vorteile des PRIONTYPE post mortem automatisierbar Der Testablauf kann bereits nach dem Homogenisierungsschritt automatisiert werden. Maximale Effizienz Identische Aufarbeitung von allen Proben 6

7 Die Vorteile des PRIONTYPE post mortem präzise Positiv- und Negativkontrollen werden auf jeder Testplatte mitgeführt. Die Testergebnisse sind Zahlenwerte (optische Dichte, od). Die Ergebnisse müssen nicht interpretiert werden, wie z.b. Western Blots. 7

8 Durchführung 1. Probenaufarbeitung Obex 350 mg 500 µl µl Denaturing Buffer Homogenization Testergebnisse innerhalb von 3 1/2 Stunden! Mix µl Sa mple Dilution Buffer + 50 µl Resolubilization Buffer µl Precipita ting Buffer 100 C, 5 min Vortex Vortex x g, 5 min 8

9 2. ELISA Durchführung 100 µl Wa sh x3 100 µl Conjuga te Incubation: 1h, RT Incubation: 1h, 4 C Wa sh x3 Mea sure 450/620nm 100 µl Stop Solution 100 µl TMB-Solution Incubation: 15 min, Dark 9

10 Testprinzip Spezifische Erkennung von bovinem PrP Sc durch einen differenzierenden monoklonalen Antikörper. Durch diesen Antikörper wird die Proteinase K-Behandlung umgangen. Homogenisierung des Gewebes im Ribolyzer. Solubilisierung und Denaturierung durch Detergentien, Protein- Fällung und anschließende Resolubilisierung Die Proteinlösung wird auf der Antikörper-beschichteten Mikrotiterplatte analysiert. Sandwich-ELISA Colorimetrische Detektion mit TMB durch einen Peroxidasemarkierten Zweitantikörper Das vorliegende Format kann für höheren Durchsatz automatisiert werden. Die manuelle Durchführung liefert die Testergebnisse innerhalb von 3,5 Stunden. 10

11 Nachweis von BSE-positiven Tieren 100% Sensitivität und 100% Spezifität Priontype post mortem 5 4 BSE negative BSE positive 3 OD Obex Samples 11

12 Auswertung Cut-off Definition Der Cut-off Wert wird auf jeder Platte berechnet: Cut-off = MW OD 450 nm (4xNegativkontrolle) Die Cut-off Werte liegen i.d.r. zwischen od 0,95 und od 0,1. Proben, deren Extinktion direkt unter dem Cut-off-Wert liegt (Cut-off-Wert - 10%), sind als zweifelhaft einzustufen und müssen wiederholt werden. Sensitivität und Spezifität BSE-positiv BSE-negativ gesamt positives Testergebnis negatives Testergebnis gesamt

13 Evaluierung Alle Proben wurden in zwei unahängigen Messungen ausgehend von einem Homogenat analysiert. Der Test zeigt eine sehr gute Übereinstimmung der Doppelbestimmungen. 13

14 BSE-Diagnostik PRIONTYPE post mortem, Labor Diagnostik Leipzig Der PRIONTYPE post mortem wird zur Zeit durch die Kommission der EU evaluiert. Die zweite Stufe der Evaluierung umfasste 150 BSE-negative und 50 BSE-positive Proben. Die anstehende Feldstudie umfasst die Testung von BSEnegativen und 200 BSE-positiven Proben in zwei Mitgliedsländern der EU. Die Zulassung des PRIONTYPE post mortem für die EU wird für das erste Quartal 2005 erwartet. 14