Skript zum Praktikum Instrumentelle Analytik der Universität Heidelberg im 4. Fachsemester Pharmazie

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1 HPLC 1 Skript zum Praktikum Instrumentelle Analytik der Universität Heidelberg im 4. Fachsemester Pharmazie 1. Aufgabe In diesem Versuch werden die Retentionszeiten der Substanzen Acetylsalicylsäure (ASS) und Salicylsäure (SS) bei unterschiedlichen Fließmittelzusammensetzungen bestimmt. Als stationäre Phase wird eine Normalphasen Kieselgel Säule, und als mobile Phase werden Fließmittelgemische aus Ethylacetat und n-hexan verwendet. 2.Theorie Die Retentionszeiten verschiedener Analyten sind abhängig von der Beschaffenheit des Fließmittels, der stationären Phase und der Substanz selbst. Bei der stationären Phase unterscheidet man zwischen polaren Normalphasen und unpolaren Umkehrphasen (reversed phase). In diesem Versuch wird eine Adsorptionschromatographie auf einer Kieselgelsäule durchgeführt. Das Fließmittelgemisch besteht aus Ethylacetat (polar) und n Hexan (unpolar). Je größer der Anteil von Ethylacetat ist, desto größer ist die Polarität und somit Elutionskraft des Fließmittels. Die Charakterisierung der Fließmittel aufgrund ihrer Elutionskraft, die sich nach Dissoziierbarkeit und Polarität richtet, gibt die Eluotrope Reihe wieder. Bei den Analyten ist die Polarität und die Fähigkeit intra- und intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden entscheidend für das Maß der Adsorption an der stationären Phase. Je stärker die Adsorption des Analyten an der stationären Phase ist, desto größer ist dessen Retentionszeit. Als Detektor wird ein UV-Vis-Detektor verwendet, der auf die Wellenlänge 254 nm eingestellt ist, um die π π*- Übergänge der aromatischen Systeme, die in beiden Substanzen vorkommen zu erkennen. ASS SS 3. Chemikalien Acetylsalicylsäure Salicylsäure Ethylacetat n-hexan konz. Essigsäure 4. Geräte 6 Messkolben (50 ml) 1 Vollpipette (25 ml) 1 Messpipette (25 ml) 1 Analysenwaage 1 HPLC-Injektionsspritze mit stumpfer Kanüle 1 HPLC-Anlage: Pumpe (LDV/Milton Roy), Steuerungseinheit mit aufmontierter Injektionsmechanik (Merck), HPLC-60 (5 µm) Säule, UV-Detektor (LDV/Milton Roy), Printer/Integrator (LDV/Milton Roy)

2 5. Herstellung der Fließmittel In einer Flasche wird n-hexan, in einer zweiten Flasche Ethylacetat jeweils mit konzentrierter Essigsäure versetzt, so dass die Konzentration der Essigsäure 0,5% beträgt. Beide Flaschen werden unmittelbar vor dem Gebrauch im Ultraschallbad 15 min entgast. 6. Probenvorbereitung Aus den Fließmitteln und den Reinsubstanzen werden folgende Proben hergestellt. Die Konzentration der Reinsubstanz beträgt jeweils 0,3 mg/ml. Probe Mischungsverhältnis Ethylacetat n-hexan ASS SS A1 15 mg - 70:30 35 ml 15 ml A2 B3 15 mg - 50:50 25 ml 25 ml B4 C5 15 mg - 30:70 15 ml 35 ml C6 7. Aufbau der HPLC-Anlage HPLC-Anlage im Praktikum

3 Injektor Gradientenmischer Probenschleife Abfall Fließmittel Pumpe Trennsäule Detektor Schreiber 8. Geräteeinstellung 8.1 Entgasung Im Beisein des Assistenten werden die Schläuche der einzelnen Fließmittelkomponenten entgast. Die Fließmittelschläuche der Flaschen sind mit Buchstaben (A, B, C) gekennzeichnet. Entsprechend dieser Kennzeichnung sind auch im Computer die Fließmittel als A und B definiert. C ist reines Ethylacetat und dient als Spülmittel am Ende des Versuchs. Das System muss blasenfrei sein, da Luftblasen am Detektor ein Signal hervorrufen. Diese Signale können die Substanzpeaks stören oder ganz überdecken. Außerdem führen Luftblasen zu einer ungleichmäßigen Sättigung der Säule mit Fließmittel und daher zu einer Störung der Chromatographie.

4 An dieser Steuerungseinheit werden alle folgenden Einstellungen zur Entgasung vorgenommen. Entgast werden die Fließmittelschläuche A und B, der Spülmittelschlauch C muss nicht entgast werden. Manual Set Fließmittel durch Enter auswählen 100 % eingeben Enter Fließgeschwindigkeit auf 1 ml/min setzen Ventil (Vorderseite der HPLC-Anlage, rechts unten) aufdrehen Pump Purge. Die Entgasung ist abgeschlossen, wenn in den Schläuchen keine Luftbläschen mehr zu sehen sind. Ventil geschlossen Ventil offen 8.2 Einstellen der Säule auf das Fließmittel Die Fließmittelzusammensetzung wird durch folgende Schritte eingestellt: Manual Set Enter prozentualer Anteil eines Fließmittels (A oder B) eingeben, das zweite wird automatisch auf 100 % ergänzt Enter Pump Autozero Autozero dient zur Definierung der Basislinie. Zeigt die Anzeige über einen längeren Zeitraum einen konstanten Wert ( ) an, hat sich die Säule auf das Fließmittel eingestellt. Dieser Vorgang dauert ca. 10 min. Die Einstellung der Säule auf das Fließmittelgemisch wird bei jeder Änderung der Zusammensetzung durchgeführt. 9. Chromatographie LOAD-Stellung INJECT-Stellung Mit Hilfe der Injektionsspritze wird die Probenschleife ca. 3 mal mit je einer Spritzenfüllung reinem Ethylacetat gespült. Hierzu befindet sich das Injektionsventil in der LOAD-Position. Dieser Spülvorgang muss vor jeder neuen Probeninjektion wiederholt werden.bei der Injektion ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen injiziert werden, um das System blasenfrei zu halten.

5 Anschließend werden 50 µl der Probe aufgezogen und bei LOAD-Stellung in die Probenschleife injiziert. Die Probenschleife fasst 20 µl, der Injektionsüberschuss wird automatisch verworfen. Die Spritze verbleibt im Ventil. Durch zeitgleiches Drehen des Ventils in INJECT-Position und Starten des Schreibers durch Drücken von RUN wird die Chromatographie gestartet. Nach ca. einer Minute wird das Ventil zurück in die LOAD- Stellung gedreht und die Spritze kann entfernt werden. Nach 10 Minuten wird die Aufzeichnung des Chromatogramms durch den Schreiber beendet. Durch Drücken der Taste STOP integriert der Schreiber die Peaks und druckt diese Daten. Nach Abschluss der Chromatographie wird die Säule mit reinem, frisch entgastem, Ethylacetat (Lösungsmittel C) vom Assistenten gespült. Dies ist ein Chromatogramm, wie es der Schreiber für SS mit einer Fließmittelzusammensetzung von 50:50 ausgibt. 10. Auswertung Zur Auswertung werden die Retentionszeiten der einzelnen Substanzen bestimmt. Diese können aus den Daten, die der Schreiber ausgibt, abgelesen werden. Der Peak mit der größten Intensität stellt den Substanzpeak dar. Es erscheint ein weiterer, wesentlich kleinerer Peak, der bei allen Chromatogrammen etwa zur gleichen Zeit detektiert wird und die Totzeit des Systems angibt. Bärbel Fischer, Katharina Anhalt, Sarah Claus, Evelyn Sawa und Julia Horscht