Chromatographie Version 04/2008

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1 Chromatographie Version 04/ Erläutern Sie das Prinzip der Chromatographie. 2. In der Dünnschichtchromatographie kann man mit der sogenannten eindimensionalen Mehrfachentwicklung bzw. der zweidimensionalen Entwicklung arbeiten. Erläutern Sie den Unterschied zwischen den beiden Arbeitstechniken. 3. DC-Platten sollen vor dem Auftrag der Proben konditioniert werden. a) Erläutern Sie, warum eine Konditionierung notwendig ist. b) Geben Sie zwei gebräuchliche Maßnahmen zur Konditionierung an. 4. a) Nennen Sie drei typische Verfahren der Detektion in der DC. b) Beschreiben Sie eines der genannten Verfahren. 5. Die drei folgenden Stoffgemische sollen mittels DC getrennt werden. Geben Sie in der Tabelle an, ob die mobile Phase eher polar oder unpolar sein sollte und geben Sie jeweils einen geeigneten Nachweis an. Stoffgemisch Polarität der mobilen Phase Nachweis Aminosäuregemisch Phenolgemisch Azobenzol/Naphthalin/Anthracen 6. Geben Sie drei prinzipielle Schwächen der klassischen DC an im Vergleich zur Elutionstechnik in der HPLC. 7. Bei der Adsorptionschromatographie kann man als stationäre Phase polare bzw. unpolare Materialien wählen. Geben Sie zwei polare und zwei unpolare Materialien an. 8. In der GC wird bei der Verteilungschromatographie eine flüssige stationäre Phase eingesetzt. Nennen Sie vier Anforderungen, die solche Flüssigkeiten erfüllen müssen. 9. Zur Quantifizierung eines Analyten in einem Gemisch mittels der GC, müssen einige Bedingungen erfüllt sein. Nennen Sie mind. drei dieser Bedingungen. 10. Im Vorfeld einer chromatographischen Analyse stellt sich heraus, dass einige Matrixbestandteile durch Peaküberlagerung stören werden. Geben Sie zwei Möglichkeiten an, um diese Störung zu eliminieren und eine zuverlässige Quantifizierung zu bekommen. 11. Eine gaschromatographische Untersuchung wird mit einer 320 µm-kapillarsäule, Split- Injektor und WLD durchgeführt. Die Nachweisgrenze soll nun durch Änderungen der Geräte- bzw. Verfahrensparameter gesenkt werden. Nennen Sie dazu drei Möglichkeiten. 12. In der GC kommt als Detektor der FID momentan am häufigsten zum Einsatz. a) Nennen Sie dafür zwei Gründe. b) Welche Verbindungen lassen sich besonders gut detektieren?

2 13. In der GC verwendet man in Verdampfungsinjektoren gewöhnlich sogenannte Liner (Insert). Nennen Sie drei Aufgaben, die der Liner hat. 14. In der GC gibt es neben der Direktinjektion auch die Splitinjektion. a) Erläutern Sie den Begriff Splitdiskriminierung b) Welche Auswirkungen hat die sogenannte Splitdiskriminierung? 15. Ein Zweistoffgemisch wurde chromatographisch getrennt. Skizzieren Sie mit Hilfe der folgenden Kenngrößen das Chromatogramm mit der Lage der Peaks (inkl. Totzeitpeak). Durchflusszeit (Totzeit) t M = 1,0 min Auflösung R S = 1,5 Kapazitätsfaktor von Peak 1 k 1 = Für ein GC-System mit 30 m-säule soll die Trennstufenzahl und die Bodenhöhe in Abhängigkeit von der linearen Gasgeschwindigkeit ermittelt werden. Dazu wurde ein Analyt und Methan in das System injiziert. Das untenstehende Chromatogramm wurde mit einer Schreibergeschwindigkeit von 1 cm/min aufgezeichnet. Berechnen Sie - die lineare, mittlere Gasgeschwindigkeit u in cm/s - die Trennstufenzahl N - die Bodenhöhe H in cm 17. Bei einer Bestimmung mittels GC wurde eine Trennsäule mit der Trennstufenzahl N = 5500 eingesetzt. Für den Analyten ist eine Retentionszeit von 5 min zu erwarten. Die Geschwindigkeit des Schreibers beträgt 1,0 cm/min. Welche Peakbreite ist an der Grundlinie zu erwarten? 18. Geben Sie für die in der Tabelle stehenden Substanzen ein geeignetes Chromatographie- Verfahren und einen Detektor an. Substanz Chromatographie-Verfahren Detektor Wasser n-hexan Coffein Chlorbenzol Glucose

3 19. Nennen Sie je zwei Vor- und Nachteile, die die Kapillarsäulen gegenüber den gepackten Säulen in der GC haben. 20. Bei einer GC wurden zwei Analyten unvollständig getrennt. a) Geben Sie fünf Maßnahmen an, mit denen eine Trennung der Peaks bis zur Basislinie erreichen werden könnte. b) Machen Sie eine begründete Aussage, welche der genannten Maßnahmen zuerst durchgeführt werden sollte. 21. Bei einer Analyse mittels GC wurde für einen Analyten eine Retentionszeit von 3,45 min gemessen. Eine Vergleichssubstanz liefert unter identischen Bedingungen eine Retentionszeit von 3,47 min. Geben Sie drei mögliche Vorgehensweisen an, mit denen die Identität des Analyten und der Vergleichssubstanz bestätigt bzw. widerlegt werden kann. 22. In einem GC-System mit einer 30 m-säule wurde eine aus zwei Analyten bestehende Probe mit Methan als Totzeit-Marker untersucht. Ermitteln Sie mit Hilfe des beschrifteten Chromatogramms die folgenden Kenngrößen: a) mittlere, lineare Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases in cm/s b) Selektivität (Trennfaktor) zwischen den Peaks der beiden Analyten c) Auflösung (Resolution) zwischen den Peaks der beiden Analyten d) Bodenzahl, bezogen auf den zweiten Analytenpeak e) Bodenhöhe in cm, bezogen auf den zweiten Analytenpeak 23. Bei einer - GC mit WLD bzw. - HPLC mit UV-Detektor wird die Säulenlänge erhöht. Welche Auswirkungen hat das auf die unten angegebenen Parameter? Entscheiden Sie sich für die GC oder HPLC und tragen Sie die folgenden Auswahlantworten in die Tabelle ein: wird größer, wird kleiner, bleibt gleich Totzeit Retentionszeit Trennstufenzahl Bodenhöhe Peakfläche 24. Die HPLC hat gegenüber der klassischen Säulenchromatographie einige Vorteile. Nennen Sie mind. zwei dieser Vorteile.

4 25. Um eine Trennaufgabe zu lösen, stehen i.d.r. mehrere Lösemittel zur Herstellung eines Eluenten zur Verfügung. Nennen Sie fünf Kriterien zur Auswahl der mobilen Phase in der HPLC. 26. Für eine neue HPLC-Methode (bzw. GC-Methode) soll eine sogenannte Robustheitsprüfung durchgeführt werden. Wählen Sie je fünf geeignete Parameter aus, um die Robustheit der jeweiligen Methode zu überprüfen. 27. Bei einer chromatographischen Quantifizierung zweier Analyten mittels GC bzw. HPLC erfolgte keine vollständige Trennung. Die Peaks zeigen etwa 20 % Überlappung. Entscheiden Sie sich für die GC oder HPLC und geben Sie für die von Ihnen ausgewählte Methode an, durch welche fünf Modifikationen am chromatographischen System die Peaks getrennt werden könnten. 28. Geben Sie in der nachfolgenden Tabelle jeweils an, ob die dort formulierte Aussage richtig oder falsch ist. zu überprüfende Aussage richtig falsch Die Probennahme sollte grundsätzlich repräsentativ erfolgen. In der HPLC bewegt sich der Eluent; in den Poren der stationären Phase bewegt er sich nicht. Die Verzögerung des Analyten in der Säule erfolgt dadurch, dass der Analyt in der Säule kürzer verweilt als die mobile Phase. Der Vorgang der Analytenadsorption muss reversibel sein. Man kann mit der Eluentenstärke die Verzögerung des Analyten in der Säule kontrollieren. 29. Zur quantitativen Bestimmung mittels HPLC wurde eine Kalibrierung mit fünf Standards im Bereich zwischen 2 und 10 µg/g des Analyten durchgeführt. Folgende Geradengleichung wurde aufgestellt: A = 1015 g/µg x mit x: Konzentration, A: Peakfläche Die Probe lieferte eine Peakfläche von Counts. Berechnen Sie die Konzentration des Analyten in µg/g und machen Sie eine Aussage über die Gültigkeit des Verfahrens. 30. Eine HPLC von drei unbekannten Analyten A, B, C und einer Referenzsubstanz R liefert die folgenden Retentionszeiten: Analyt A 3,33 min Analyt B 4,96 min. Analyt C 5,91 min. Referenz R 5,00 min Wie würden Sie vorgehen, um die Identität eines der drei Analyten mit der Referenzsubstanz R möglichst sicher zu beweisen. Kopplungsmöglichkeiten mit spektroskopischen Methoden (IR, NMR, MS) stehen ihnen nicht zur Verfügung! 31. Mit einem HPLC-System wurde eine Zweipunktkalibrierung durchgeführt. Folgende Daten liegen vor: 2,0 mg Einwaage Analyt liefern Counts 4,0 mg Einwaage Analyt liefern Counts Anschließend wurde die reine Probenmatrix mit 2,5 mg Analyt versetzt und mit dem HPLC-System untersucht. Die Probengemisch lieferte Counts Berechnen Sie die Wiederfindungsrate WFR.

5 32. Erklären Sie die folgenden Begriffe: - Trennfaktor α = 1 (Selektivität, Relative Retention) - Headspace - RP 8 bzw. RP 18 - Permeabilität - Auflösung R s = 1,5 33. In einer HPLC mit UV-Detektor wird eine Probe untersucht, die nur einen Analyten enthält. Der Volumenstrom des Elutionsmittel wird von 0,6 ml/min auf 1,2 ml/min erhöht. Welche Auswirkungen hat diese Parameteränderung auf die Retentionszeit und die Peakfläche? 34. Als stationäre Phase bei der RP-HPLC wird sogenanntes modifiziertes Silicagel eingesetzt. a) Wie wird die Säulenfüllung modifiziert und welchen chemischen Aufbau hat das modifizierte Silicagel? b) Welche Polarität hat das RP-Material? 35. In einem HPLC-System mit einem UV-Detektor und einer RP-Säule wurde bei einem Volumenstrom von 1,2 ml/min das folgende Chromatogramm erhalten. Es ist der Totzeitpeak und der Analytpeak zu erkennen. Der Volumenstrom wird nun verdoppelt (2,4 ml/min). Skizzieren und erläutern Sie das zu erwartende Chromatogramm. 36. Eine Säule hat eine theoretische Bodenzahl von N th = Stufen. Weisen Sie durch eine Rechnung nach, ob man mit dieser Säule einen Peak erhalten kann, der eine Retentionszeit von 24 min. und eine Peakbreite auf der Grundlinie von 12 s hat.

6 37. Ein Analyt liefert eine Peakfläche von Counts. Die gleiche Probe wird mit 0,5 mg/l des gleichen Analyten versetzt und auch untersucht. Diese Probe liefert Counts als Peakfläche (Linearität ist im Messbereich nachgewiesen!). Berechnen Sie die Konzentration an Analyt in mg/l in der ursprünglichen Probe? 38. In der GC und HPLC tritt das Phänomen des Tailings und des Frontings auf. Geben Sie dafür jeweils eine Ursache an. 39. Das linke Chromatogramm wurde mehrfach für ein Analysengemisch mittels HPLC mit UV-Detektion erhalten. Nach dem wohlverdienten Urlaub wurde mit der selben HPLC- Anlage für das Analysengemisch das rechte Chromatogramm gemessen. a) Nennen Sie die chromatographischen Parameter, die sich optisch erkennbar verändert haben? b) Geben Sie vier denkbare Bedingungen an, die zu diesen Veränderungen im Chromatogramm geführt haben könnten. 40. Bei einer HPLC-Anlage musste die Säule ausgetauscht werden. In den beiden folgenden Chromatogrammen sind je zwei Peaks erkennbar, Totzeit-Marker (Duchflusszeit-Marker) und Analytpeak. Geben Sie an, wie sich die in der Tabelle angegebenen chromatographischen Kenngrößen nach dem Säulenwechsel verändert haben. Tragen Sie ein: wird größer oder wird kleiner oder bleibt gleich. Kenngröße Durchflusszeit t M (Totzeit) Retentionszeit reduzierte Retentionszeit Bodenzahl Retentionsfaktor k (Kapazitätsfaktor) Veränderung nach Säulenwechsel

7 41. Zur Vorbereitung einer chromatographischen Analyse wurden drei Kalibrierlösungen des Analyten mit den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen injiziert und jeweils die Peakflächen (counts) bestimmt. a) Berechnen Sie für alle drei Konzentrationen den Responsefaktor R (Detektorempfindlichkeit S) und tragen Sie die Werte in die Tabelle ein. b) Erläutern Sie, ob bei dieser Methode mit Linearität zu rechnen ist. Injektion Nr. Konz. in mg/l Peakfläche (counts) 1 0, , , Responsefaktor R (Detektorempfindlichkeit S) 42. Zunächst wurden die Proben 1 und 2 gemessen. Anschließend wurde Probe 3 bestimmt. Berechnen Sie die Wiederfindungsrate WFR in %. Probe Analyt in 100 ml Lösung Peakfläche in counts 1 0,33 mg ,63 mg ,46 mg Ein HPLC-System soll qualifiziert werden. Dazu wird ein Analyt sechsmal nacheinander eingespritzt. Folgende Ergebnis wurden ermittelt: Probennr. Retentionszeit in min. Peakfläche in Counts 1 5, , , , , , a) Wie beurteilen Sie die Messwerte? Sind Fehler erkennbar? b) Wie könnte man den Fehler mathematisch beschreiben? c) Wo könnten die Ursachen für den Fehler liegen? 44. to be continued

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