Toxoplasma IgG ELISA
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- Klaudia Giese
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1 Arbeitsanleitung Toxoplasma IgG ELISA Enzymimmunoassay auf Mikrotiterbasis zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von humanen IgG-Antikörpern gegen Toxoplasma gondii in Serum und Plasma Z Kat.-Nr.: ILE-TOX01 Lagerung: 2-8 C Nur für in-vitro Diagnostik Dezember 2014 IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D Kassel Tel: , Fax: , info@immunolab.de
2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Verwendungszweck 3 2. Klinische Bedeutung 3 3. Testprinzip 3 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4 5. Inhalt des Testbestecks 4 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben 5 8. Testdurchführung 5 9. Auswertung Testcharakteristika Literatur 8 Symbole und Übersetzungen Symbol English French German Italian Spanish Greek CAL Calibrator Etalon Standard Calibratore Calibrador Πρότυπο Διάλυμα Conjugate Conjugué Konjugat Coniugato Conjugado Διάλυμα CONJ Συμπλόκου CONC SAMP DIL STOP SUBS MT PLATE WASH BUF Concentrate (<n>-fold) Sample Diluent Stop Solution Concentré (<n> fois) Diluant échantillon Konzentrat (<n>-fach) Proben verdünner Concentrato Diluente del campione Solution d arrêt Stopp-Lösung Soluzione d arresto Concentrado (<n>-veces) Diluyente de muestra Solución de parada Συμπύκνωση (<n> φορές) Διάλυμα Αραίωσης Δειγμάτων Διάλυμα Αναστολής Substrate Substrat Substrat Substrato Sustrato Διάλυμα Υποστρώ ματος Microtiter plate Wash buffer Microplaque Mikrotiterplatte Piastre Placa microtiter Tampon de lavage Waschpuffer Soluzione di lavaggio Tampón de lavado Μικρόπλακα Πλυστικό Διάλυμα :37 2
3 1. Verwendungszweck Der Toxoplasma IgG ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von humanen IgG-Antikörpern gegen Toxoplasma gondii im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion. Dieser Test ist nur für in-vitro-diagnostische Anwendungen ausgelegt. Die Anwendung zum Monitoring von Transplantationsempfängern bzw. in anderen Körperflüssigkeiten wurde nicht evaluiert und erfolgt ggf. in alleiniger Verantwortung des Anwenders. Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden. 2. Klinische Bedeutung Unter Toxoplasmose versteht man eine Infektion, die durch den Parasiten Toxoplasma gondii hervorgerufen wird. Bis zu 20% der Bevölkerung tragen den Erreger in sich, aber nur sehr wenige spüren Symptome, da das Immunsystem die Krankheit nicht zum Ausbruch kommen lässt. Schwangere Frauen sollten aber vorsichtig sein, da eine Infektion den Fötus schädigen kann. Toxoplasma gondii gehört zu den Protozoen und ist ein Parasit, der viele verschiedene Säugetierspezies infizieren kann, darunter auch den Menschen. Es werden sowohl Oozysten als auch Gewebezysten von Tieren wie Katzen, Schweinen und Schafen abgegeben, die sich nach der Aufnahme durch den Menschen in Tachyzoiten umwandeln, die man dann im Nerven- und Muskelgewebe finden kann. Wenn eine schwangere Frau infiziert wird, können die Tachyzoiten den Fötus über die Plazenta erreichen. Die Symptome der Toxoplasmose sind sehr unterschiedlich, wobei die meisten Infizierten sich nicht krank fühlen. Typisch für die Erkrankung ist ein Grippe-Gefühl mit geschwollenen Lymphknoten und Muskelschmerzen, das Monate anhalten kann. Die schwere Form der Toxoplasmose verursacht Schäden am Gehirn, den Augen sowie weiteren Organen. Aus einer bereits abgeklungenen Toxoplasmose kann sich eine reaktivierte chronische Form entwickeln. Die Übertragung der Krankheit kann vor allem durch die Aufnahme von Katzenkot, zum Beispiel bei der Gartenarbeit oder der Haustierpflege stattfinden. Aber auch in rohem Fleisch oder kontaminiertem Wasser können Erreger enthalten sein. Üblicherweise klingen die Krankheitssymptome nach einigen Wochen ohne Behandlung wieder ab, bei schwangeren Frauen und bei Personen mit reduziertem Immunsystem sollte aber eine medikamentöse Therapie eingeleitet werden. Es stehen folgende Labormethoden zur Verfügung: Komplementbindungsreaktion (KBR), Immunfluoreszenz (IFT) oder ELISA. Wichtig ist der Nachweis virusspezifischer IgM-Antikörper bei frischen oder reaktivierten Infektionen, der IgG Test dient dem Nachweis der Immunität. Bei schweren konnatalen Erkrankungen kann auch eine Identifizierung des Parasiten aus peripherem Blut, Amnionflüssigkeit oder Gewebeproben versucht werden. 3. Testprinzip Der IMMUNOLAB Toxoplasma IgG Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays (EIA). Auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist Toxoplasma-Antigen gebunden. Verdünntes Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Kalibratoren werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Es findet eine Bindung zwischen den IgG-Antikörpern aus dem Serum und dem immobilisierten Toxoplasma-Antigen statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte mit verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen. Danach wird gebrauchsfertiges Anti-human-IgG-Peroxidase Konjugat zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert und 20 Minuten inkubiert, wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Konzentration der IgG-Antikörper ist der Intensität der Färbung direkt proportional :37 3
4 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten. Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden auf HbsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden. Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.b. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden. Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht werden. Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden. Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen. Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden sollten. Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate Einmal- Pipettenspitzen verwendet werden. Es dürfen keine Reagenzien von verschiedenen Kitchargen verwendet und diese nicht miteinander vermischt werden. Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen. In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a. Mikropipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader). Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen. 5. Inhalt des Testbestecks Komponenten Volumen / Menge MT PLATE Toxoplasma-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen 12 CAL Kalibratoren (Standards) : 0, 10, 40, 100, 250 IU/mL CONJ Anti-human-IgG-Enzymkonjugat SUBS Substratlösung STOP Stopp-Lösung SAMP DIL Probenverdünner WASH BUF CONC Waschpuffer (10 ) 5 x 2 ml 15 ml 15 ml 15 ml 60 ml 60 ml Plastikfolien 2 Plastikbeutel 1 Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten) Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8 C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und der Kit wieder bei 2-8 C gelagert werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden, der endverdünnte Waschpuffer hält 4 Wochen bei 2-8 C MT PLATE Mikrotiterstreifen 12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit Toxoplasma-Antigen (Stamm RH, isoliert aus infizierten Mäusen). Gebrauchsfertig :37 4
5 5.2. CAL Kalibratoren A-E (Standards) 5 x 2 ml, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit 0, 10, 40, 100, 250 IU/mL an IgG-Antikörpern gegen Toxoplasma. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig CONJ Anti-human-IgG-Enzymkonjugat 15 ml, Anti-human-IgG-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l Proclin TM. Gebrauchsfertig SUBS Substratlösung 15 ml, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig STOP Stopp-Lösung 15 ml, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig SAMP DIL Probenverdünner 60 ml, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig WASH BUF CONC Waschpuffer 60 ml, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen Plastikfolien 2 Stück zur Abdeckung der Mikrotiterplatten während der Inkubation Plastikbeutel Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen. 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 µl-, 100 µl- und 500 µl-mikro- bzw. Mehrkanalpipetten Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Mikrotiterplatten-Waschgerät Reagenzgläser für die Serumverdünnung Bidestilliertes Wasser 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Citrat) verwendet werden. Aus dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum durch Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 2 Tagen gekühlt (2-8 C) haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20 C gelagert werden. Die Proben sollten nicht mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell kontaminierte Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Standards) mit gebrauchsfertigem Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.b. 5 µl Serum µl Probenverdünner). 8. Testdurchführung 8.1. Vorbereitung der Reagenzien :37 5
6 Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen. Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden. Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Mit jedem Test muss eine Standardkurve erstellt werden. Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen Einzelne Assay-Schritte 1. Für die Kalibratoren und die Proben im Doppelansatz sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl an Mikrotitervertiefungen vorbereiten. 2. Je 100 µl der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Kalibratoren in die Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 3. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren. 4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 5. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 6. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. 7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 8. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 9. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.b. Schublade) 20 Minuten inkubieren. 10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µl der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion bei 450 nm (eventuell Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil. 9. Auswertung Es werden die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen jeweils nach Abzug des Substrat- Leerwerts berechnet. Die Abweichung zwischen den Einzelwerten sollte unter 10 % liegen. Beispiel Substrat-Leerwert 0,020 Messwerte (OD) korr. Messwerte (OD) Mittelwert (OD) Kalibrator A (0 IU/mL) 0,044 / 0,045 0,024 / 0,025 0,025 Kalibrator B (10 IU/mL) 0,454 / 0,462 0,434 / 0,442 0,438 Kalibrator C (40 IU/mL) 0,931 / 0,969 0,911 / 0,949 0,930 Kalibrator D (100 IU/mL) 1,511 / 1,509 1,491 / 1,489 1,490 Kalibrator E (250 IU/mL) 1,981 / 2,009 1,961 / 1,989 1, :37 6
7 Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien in gleicher Art wiedergefunden werden müssen Qualitative Auswertung Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off Standard (10 IU/ml) verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives Resultat. Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Standards liegt ein negatives Resultat vor. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu definieren. Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum oder mit einer nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide Proben sollten parallel in einem Testansatz gemessen werden Quantitative Auswertung Die gebrauchsfertigen Kalibratoren des Toxoplasma-IgG-Antikörper Kits sind auf Internationale Units (IU/mL) mit dem WHO-Standard TOXM (3rd Intl. Standard) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung. Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für die Kalibratoren sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionen der Kalibratoren gegen ihre Konzentrationen graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die Extinktion jeder Patientenprobe das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden. Es können auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. 10. Testcharakteristika Toxoplasma ELISA IgG Intra-Assay-Präzision 8,4 11,4 % Inter-Assay-Präzision 4,9 15,2 % Inter-Lot-Präzision 1,4 24,0 % Analytische Sensitivität 0,58 IU/mL Wiederfindung % Linearität % Kreuzreaktivität Interferenzen Keine Kreuzreaktivität gegen Herpes 1, Rubella, Zytomegalie, Bordetella, Borrelia, Brucella und Helicobacter. Keine Interferenzen mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/ml, Hämoglobin bis zu 8,0 mg/ml und Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/ml Klinische Spezifität 99 % Klinische Sensitivität 98 % Messbereich IU/mL :37 7
8 11. Literatur 1. Chemla, C. et al.: Preconception Seroconversion and Maternal Seronegativity at Delivery Do Not Rule Out the Risk of Congenital Toxoplasmosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 489 (2002). 2. Jenum, P. A. et al.: Improved diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of antitoxoplasma immunoglobulin G activity. J. Clin. Microbiol. 35: 1972 (1997). 3. Kaul, R. et al.: Detection of Immunoglobulin M Antibodies Specific for Toxoplasma gondii with Increased Selectivity for Recently Acquired Infections. J. Clin. Microbiol. 42: 5705 (2004). 4. Liesnard, C. et al.: Prenatal Diagnosis of Congenital Cytomegalovirus Infection: Prospective Study of 237 Pregnancies at Risk. Obstet. Gynecol. 95: 881 (2000). 5. Montoya, J. G. et al.: VIDAS test for avidity of Toxoplasma-specific immunoglobulin G for confirmatory testing of pregnant women. J. Clin. Microbiol. 40(7): 2504 (2002). 6. Paul, M. et al.: Prevalence of congenital Toxoplasma gondii infection among newborns from the Poznan region of Poland. J. Clin. Microbiol. 39: 1912 (2001). 7. Pinon, J.M. et al.: Strategy for diagnosis of congenital toxoplasmosis: evaluation of methods for postnatal detection of immunoglobulin G, M and A antibodies. J. Clin. Microbiol. 39: 2267 (2001). 8. Prince, H. E. et al.: Simplified Assay for Measuring Toxoplasma gondii Immunoglobulin G Avidity. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8: 904 (2001). 9. Remington, J. S. et al.: Recent Developments for Diagnosis of Toxoplasmosis. J. Clin. Microbiol. 42: 941 (2004). 10. Robert-Gangneux, F. et al.: Value of prenatal diagnosis and early postnatal diagnosis of congenital toxoplasmosis: a retrospective study of 110 cases. J. Clin. Microbiol. 37: 2893 (1999). 11. Segundo, G. R. et al.: A comparative study of congenital toxoplasmosis between public and private hospitals from Uberlandia, MG, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99(1): 13 (2004). 12. Shuhaiber, S. et al.: Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection among veterinary staff in Ontario, Canada (2002): implications for teratogenic risk. BMC Infect. Dis. 23: 8 (2003). 13. Sorensen, T. et al.: Automated Time-resolved Immunofluorometric Assay for Toxoplasma gondii-specific IgM and IgA Antibodies. Clin. Chem. 48: 1981 (2002). 14. Suzuki, L. A. et al.: Evaluation of serological markers for the immunodiagnosis of acute acquired toxoplasmosis. J. Med. Microbiol. 50: 62 (2001). 15. Suzuki, Y. et al.: Detection of Immunoglobulin M Antibodies to P35 Antigen of Toxoplasma gondii for Serodiagnosis of Recently Acquired Infection in Pregnant Women. J. Clin. Microbiol. 38: 3967 (2000). 16. Villard, O. et al.: Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, immunoblotting, and PCR for diagnosis of toxoplasmic chorioretinitis. J. Clin. Microbiol. 41(8): 3537 (2003) :37 8
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