i C Anti-Gangliosid-IgG/M-LINA 6

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1 i C Anti-Gangliosid-IgG/M-LINA

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3 Inhaltsverzeichnis 1. Einführung Allgemeine Hinweise Inhalt Exklusives Material Testprinzip Durchführung Auswertung Anhang

4 1. Einführung Der Anti-Gangliosid-IgG/M-LINA 6 ist ein Testkit zur qualitativen Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern gegen folgende 11 Parameter in humanem Serum für die Differentialdiagnose von autoimmunen Neuropathien. GM1 GM2 GM3 GM4 GD1A GD1B GD2 GD3 GT1A GT1B GQ1B Entzündliche Neuropathien des peripheren Nervensystems sind durch zahlreiche klinische Symptome gekennzeichnet, die von leichter Ermüdbarkeit und uncharakteristischem Missempfinden über neuromuskuläre Störungen bis zu Funktionsausfällen wie Atemlähmung und Herzstillstand reichen können. Bei Erkrankungen des peripheren Nervensystems sind in der letzten Zeit zunehmend Autoantikörper gegen Ganglioside identifiziert worden. Ganglioside sind saure Glycolipide, die aus einem Lipid (Ceramid), einer Oligosaccharidkette und Sialinsäure bestehen. Ganglioside sind Bestandteile von Plasmamembranen, wobei sie besonders häufig auf der Oberfläche von Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems anzutreffen sind. Gangliosiden ähnliche Strukturen kommen auch an der Oberfläche von Mikroorganismen vor. So treten entzündliche Neuropathien häufig infolge einer Infektion mit Campylobacter jejuni, Cytomegalievirus, Epstein-Barr Virus, Mycoplasma pneumoniae oder Hämophilus influenzae auf. Antikörper gegen Gangliosidstrukturen der Erreger können mit Gangliosiden von Markscheiden oder Nervenfasern kreuzreagieren und bewirken Entzündungen mit nachfolgender Demyelinisierung. 2

5 Tab.1 Neuropathie-Gangliosid-Antikörper-Korrelationen Neuropathie Antikörper gegen Isotyp Guillain-Barré Syndrom GM1GD1aGD1bGT1aGT1bGQ1b IgG (IgM) Miller-Fisher Syndrom GT1aGQ1b IgG Multifokale motorische Neuropathie GM1GM2GM3GD1aGD1b IgM Chronisch-entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP) Chronisch-ataxische Neuropathie (CANOMAD) GM2GM3GD1aGD1b GM3GD1bGD2GD3GT1bGQ1b IgM IgM Akute ataxisch-sensorische Neuropathie GD1bGD3 IgG Akute motorische axonale Neuropathie GM1GD1a IgG (1) Willison HJ, Yuki N: Peripheral neuropathies and anti-glycolipid antibodies. Brain, 2002, 125, (2) Khalili-Shirazi A, Gregson N, Gray I, Rees J, Winer J, Hughes R: Antiganglioside antibodies in Guillain- Barre syndrome after a recent cytomegalovirus infection, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1999, 66, (3) Schwerer B, Neisser A, Bernheimer H: Distinct immunoglobulin class and immunoglobulin G subclass patterns against ganglioside GQ1b in Miller Fisher syndrome following different types of infection. Infect Immun, 1999, 67, (4) Alaniz ME, Lardone RD, Yudowski SL, Farace MI, Nore GA: Normally occurring human anti-gm1 immunoglobulin M antibodies and the immune response to bacteria. Infect Immun, 2004, 72,

6 2. Allgemeine Hinweise Dieser Reagenziensatz ist zum in-vitro-gebrauch bestimmt und muss von geschultem Laborpersonal in einem entsprechend eingerichteten Labor durchgeführt werden! Als Probenmaterial ausschließlich humanes Serum verwenden! Beim Umgang mit den Komponenten des Testkits und mit den Patientenproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung beim Umgang mit potentiell infektiösem Material und gefährlichen Chemikalien zu beachten! Insbesondere sind folgende Regeln einzuhalten: Nicht essen, trinken oder rauchen! Nie mit dem Mund pipettieren! Handschuhe zur Vermeidung von Kontakt mit den Reagenzien und Seren tragen! Sicherheitshinweise zu den einzelnen Testkomponenten beachten! Die Arbeitsanweisung muss strikt befolgt und jegliche Zeitverschiebung vermieden werden! Die angegebenen Lagerungstemperaturen der Einzelkomponenten des Testkits sind einzuhalten! Die Testreifen sind mittels Schere von der Schutztasche zu trennen und mittels Pinzette zu handhaben (nicht mit der ungeschützten Hand berühren)! Das Mischen von Testkitkomponenten verschiedener Chargen ist nicht erlaubt! Dies gilt auch für die Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller zur Komplettierung eines geöffneten Testkits! Der Testkit oder seine geöffneten Reagenzien sind nur innerhalb der angegebenen Haltbarkeitsfristen zu verwenden! Tubes mit geringen Flüssigkeitsmengen vor dem Gebrauch kurz zentrifugieren! Wir empfehlen, mittels laborinterner Kontrollseren eigene Qualitätskontrollen durchzuführen (s.a. Eichordnung, Bundesgesetzblatt I, S. 1657, 1988 sowie Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, Dt. Ärzteblatt 98, Heft 42, S. A , 2001). 4

7 3. Inhalt Tab.2 Testkitkomponenten Komponente b Details t Teststreifen 320 Puffer (10-fach) Teststreifen mit 12 Reaktionsfeldern 1 Funktionskontrollfeld und 11 Testfelder 15 ml Konzentrat (für 150 ml) Klares Röhrchen mit weißer Kappe 2 8 C 2 8 C Anti-IgG-POD (21-fach) 319 1,2 ml Konzentrat anti-human IgG Antikörper (Schaf - IgG) konjugiert mit Peroxidase (POD) rote Kappe, rötlich gefärbte Lösung 2 8 C Anti-IgM-POD (21-fach) 228 1,2 ml Konzentrat anti-human IgG Antikörper (Schaf - IgG) konjugiert mit Peroxidase (POD) grüne Kappe, grünlich gefärbte Lösung 2 8 C Substrat ml 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidine (TMB) blaue Kappe 2 8 C Der Testkit enthält weiterhin: 1x Archivmatrix 1x Interpretationsschablone 2x Inkubationswannen Das Verfallsdatum des kompletten Reagenziensatzes ist auf dem äußeren Etikett des Testkits angegeben. Die Verfallsdaten der Einzelreagenzien können ggf. darüber hinausgehen und sind auf den jeweiligen Reagenzien vermerkt. 5

8 4. Exklusives Material Einkanal-Mikropipette 1000 µl Verstellbare Einkanal-Mikropipette µl entsprechende Pipettenspitzen Wippschüttler Meßzylinder Bechergläser destilliertes oder entionisiertes Wasser Schere Pinzette Klebestift zum fixieren der Teststreifen auf der Archivmatrix Fineliner oder Permanentmarker zum beschriften der Archivmatrix 6

9 5. Testprinzip Der Anti-Gangliosid-IgG/M-LINA 6 ist ein Streifentest zur qualitativen Bestimmung von IgGund/oder IgM-Antikörpern gegen Ganglioside in humanem Serum. Jeder Kit enthält 20 nummerierte Teststreifen, welche jeweils mit einem Funktionskontrollfeld und 11 Testfeldern versehen sind. Auf jedem Testfeld befindet sich je ein hoch gereinigtes Antigen (siehe Abb. 2). Auf dem Teststreifen (A) immobilisierte Antigene (B) werden während des ersten Inkubationsschrittes durch in der Probe vorhandene spezifische Antikörper (C) gebunden. Nicht gebundenes Probenmaterial wird durch den ersten Waschschritt entfernt. Die nun immobilisierten humanen Primärantikörper (C) werden während des zweiten Inkubationsschrittes spezifisch durch antihuman-igg (oder -IgM) Sekundärantikörper (D) gebunden, welche mit dem Enzym Peroxidase (E) konjugiert sind. Ungebundene Konjugatmoleküle werden durch den zweiten Waschschritt entfernt. Abb.1 Schema Testprinzip Die Peroxidase (E) setzt im dritten Inkubationsschritt enzymatisch die farblose Substratlösung (F) in ein dunkles, violettes Präzipitat (G) um. Das Präzipitat (G) bindet auf Grund seines hydrophoben Charakters in unmittelbarer Nähe seiner Genese an den hydrophoben Teststreifen (A). Diese Reaktion wird durch einen dritten Waschschritt gestoppt. Nachdem die Streifen getrocknet sind, werden sie auf der Archivmatrix fixiert und mittels der Interpretationsschablone evaluiert. Es sollte ein Scanbild der bestückten Matrix zur Archivierung erstellt werden, da die Färbung der Streifen altert. 7

10 6. Durchführung Vorbereitungen Entwicklungsreagenzien auf Raumtemperatur bringen! Reagenzien vor Gebrauch vortexen (schütteln)! Puffer (10-fach) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 1-fach-Konzentration verdünnen (1 Teil Puffer (10-fach) + 9 Teile Wasser). Vor dem Verdünnen des Pufferkonzentrats müssen alle Salzkristalle gelöst sein. Wenn nötig, zum Lösen der Salzkristalle kurz erwärmen. Für jeden zu entwickelnden Teststreifen werden ca. 5 ml Puffer benötigt. Die auf diese Weise verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Die Testreifen sind in einer Schutztasche und einem Druckverschlussbeutel verpackt. Unmittelbar vor dem Einlegen der Teststreifen in die Inkubationswanne die benötigte Streifenanzahl mittels Schere entlang der aufgedruckten Linie von der Schutztasche abtrennen! Restliche Teststreifen mit der Schutztasche in den Druckverschlussbeutel zurücklegen und verschließen! Alle anderen Testkomponenten sind gebrauchsfertig und bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Substrat lichtgeschützt aufbewahren. Testdurchführung Siehe Tabelle nächste Seite. Die Reihenfolge der Pipettierschritte und deren Durchführung im Zeittakt sind einzuhalten! Sämtliche Reaktionsschritte finden auf einem Wippschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (ca Zyklen/ Minute) und Raumtemperatur (20-25 C) statt. Zeitbedarf Entwicklung von 20 Teststreifen: ca. 170 min (~3 h) 8

11 Tab.3 Arbeitsschritte Nr. Beschreibung 1. 1 ml Puffer (1-fach) in Inkubationsrinnen pipettieren µl Probe je Inkubationsrinne pipettieren (Verdünnung 1:101). 3. Teststreifen mittels Pinzette mit beschrifteter Reaktionsseite nach unten in die Inkubationsrinnen einlegen min Inkubation auf dem Wippschüttler. 5. Inkubationswanne dekantieren (entlang der Rinnenachse). 6. Waschen mit 1 ml Puffer (1-fach) für 5 min auf dem Wippschüttler ml Puffer (1-fach)+ 50 µl Konjugat (21-fach) in Inkubationsrinne pipettieren min Inkubation auf dem Wippschüttler. 9. Inkubationswanne dekantieren (entlang der Rinnenachse). 10. Waschen mit 1 ml Puffer (1-fach) für 5 min auf dem Wippschüttler ,5 ml Substrat in entsprechende Inkubationsrinnen pipettieren min Inkubation auf dem Wippschüttler. 13. Absaugen des Substrats und Entsorgung gemäß lokaler Abfallbestimmungen. 14. Waschen mit 1 ml Puffer (1-fach) für 2 min auf dem Wippschüttler. 15. Teststreifen aus der Inkubationswanne entnehmen und mit der Reaktionsseite nach oben auf die Archivmatrix kleben. Dann 30 min trocknen lassen und anschließend Färbungen mittels Schablone interpretieren. 9

12 7. Auswertung Zur Bewertung der entwickelten Teststreifen wird diese auf der Archivmatrix fixiert und die mitgelieferte Interpretationsschablone daran angelegt (siehe Abb.2). Die einzelnen Reaktionsfelder auf den Teststreifen werden dann mit den Cut-Off-Feldern der Schablone verglichen. Validierung Die Funktionskontrollbande muss gefärbt sein. Ist dies nicht der Fall, kann keine Beurteilung der Patientenseren erfolgen. Positiv Testfeld > Cut-Off Grenzwertig Testfeld = Cut-Off Negativ Testfeld < Cut-Off Asymptomatische Probanden können positive Autoantikörperbefunde aufweisen. Besonders IgM-Antikörper treten wegen der Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen auch bei Gesunden auf. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen Befunde und Laborbefunde berücksichtigt werden. 10

13 8. Anhang 9 Tab.4 Verwendete Symbole Symbol Erläuterung h l v Hersteller Chargennummer verwendbar bis 2t 8 Lagerung zwischen 2 C und 8 C b i pn g - negativ +/- grenzwertig + positiv ++ stark positiv Artikelnummer In-vitro-Diagnostikum Inhalt ausreichend für <n> Bestimmungen Gebrauchsanweisung beachten 11

14 Notizen

15 10

16 Attomol GmbH Schulweg 6, OT Lipten Bronkow, Deutschland Tel: Fax:

Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 b 1176 i C

Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 b 1176 i C Attomol GmbH Schulweg 6, OT Lipten 03205 Bronkow Germany fon +49.35329.5906-0 fax +49.35329.5906-19 e-mail info@attomol.de web www.attomol.de Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 b 1176 i C Bedienungsanleitung

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