Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 b 1176 i C

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1 Attomol GmbH Schulweg 6, OT Lipten Bronkow Germany fon fax web Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 b 1176 i C Bedienungsanleitung BA Anti-Phospholipid-LINA 3 CE DE V4 1. Einführung Der Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 ist ein Testkit zur qualitativen Bestimmung von IgG- oder IgM- Antikörpern gegen folgende 9 Antigene in humanem Serum, welche die für die Diagnose des Anti- Phospholipid-Syndroms (APS) in Betracht kommen. Annexin V ß2-GP I Cardiolipin Phosphatidsäure Phosphatidylethanolamin Phosphatidylglycerol Phosphatidylinositol Phosphatidylserin Prothrombin Das APS [1] ist eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen, mit Prädisposition des weiblichen Geschlechts. Typische klinische Symptome sind arterielle und venöse Thrombosen (Gefäßverstopfung), Thrombozytophenie (Verringerung der Blutplättchenzahl) und habituelle Aborte [2]. Beim Anti-Phospholipid-Syndrom finden sich spezifische Antikörper gegen verschiedene Phospholipide (Cardiolipin, Phosphatidsäure, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol) und lipidbindende Proteine (ß2-GP I, Annexin V, Prothrombin) [3,5,6] Durch diese so genannten Anti-Phospholipid-Antikörper kommt es zu einer vermehrten Gerinnbarkeit (Hyperkoagulabilität) des Blutes und folglich zu einem vermehrten Vorkommen von Thrombosen [4]. 1

2 2. Allgemeine Hinweise Dieser Reagenziensatz ist zum in-vitro-gebrauch bestimmt und muss von geschultem Laborpersonal in einem entsprechend eingerichteten Labor durchgeführt werden! Als Probenmaterial ausschließlich humanes Serum verwenden! Beim Umgang mit den Komponenten des Testkits und mit den Patientenproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung beim Umgang mit potentiell infektiösem Material und gefährlichen Chemikalien zu beachten! Insbesondere sind folgende Regeln einzuhalten: Nicht essen, trinken oder rauchen! Nie mit dem Mund pipettieren! Handschuhe zur Vermeidung von Kontakt mit den Reagenzien und Seren tragen! Sicherheitshinweise zu den einzelnen Testkomponenten beachten! Die Arbeitsanweisung muss strikt befolgt und jegliche Zeitverschiebung vermieden werden! Die angegebenen Lagerungstemperaturen der Einzelkomponenten des Testkits sind einzuhalten! Die Testreifen sind mittels Schere von der Schutztasche zu trennen und mittels Pinzette zu handhaben (nicht mit der ungeschützten Hand berühren)! Das Mischen von Testkitkomponenten verschiedener Chargen ist nicht erlaubt! Dies gilt auch für die Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller zur Komplettierung eines geöffneten Testkits! Der Testkit oder seine geöffneten Reagenzien sind nur innerhalb der angegebenen Haltbarkeitsfristen zu verwenden! Tubes mit geringen Flüssigkeitsmengen vor dem Gebrauch kurz zentrifugieren!wir empfehlen, mittels laborinterner Kontrollseren eigene Qualitätskontrollen durch-zuführen (s.a. Eichordnung, Bundesgesetzblatt I, S. 1657, 1988 sowie Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, Dt. Ärzteblatt 98, Heft 42, S. A , 2001). 2

3 3. Inhalt Tab.1 - Testkitkomponenten Komponente REF Details t Teststreifen Teststreifen 9 Antigene Puffer 10x ml Pufferkonzentrat Weiße Kappe Anti-IgG-POD 21x 244 1,2 ml Konzentrat Rote Kappe Anti-IgM-POD 21x 245 1,2 ml Konzentrat Grüne Kappe Substrat ml TMB Blaue Kappe Der Testkit enthält weiterhin: 1x Archivmatrix 1x Interpretationsschablone 2x Inkubationswannen Das Verfallsdatum des kompletten Reagenziensatzes ist auf dem äußeren Etikett des Testkits angegeben. Die Verfallsdaten der Einzelreagenzien können ggf. darüber hinausgehen und sind auf den jeweiligen Reagenzien vermerkt. 4. Benötigte Arbeitsmittel Einkanal-Mikropipette 1000 µl Verstellbare Einkanal-Mikropipette µl entsprechende Pipettenspitzen Wippschüttler Meßzylinder Bechergläser destilliertes oder entionisiertes Wasser Schere Pinzette Klebestift zum fixieren der Teststreifen auf der Archivmatrix Fineliner oder Permanentmarker zum beschriften der Archivmatrix handelsüblicher Flachbettscanner 3

4 5. Testprinzip Der Anti-Phospholipid-IgG/M-LINA 3 ist ein Streifentest zur qualitativen Bestimmung von IgG- und/oder IgM- Antikörpern gegen Phospholipide und lipidbindende Proteine in humanem Serum. Jeder Kit enthält 20 nummerierte Teststreifen, welche jeweils mit einem Funktionskontrollfeld und 9 Testfeldern versehen sind. Auf jedem Testfeld befindet sich je ein hoch gereinigtes Antigen (siehe Abb. 2). A - Teststreifen B - Antigen C - Primärantikörper D - Sekundärantikörper E - Peroxidase F - Substrat (löslich) G - Produkt (präzipitierend) Abb.1 Schema Funktionsweise Auf dem Teststreifen (A) immobilisierte Antigene (B) werden während des ersten Inkubationsschrittes durch in der Probe vorhandene spezifische Primärantikörper (C) gebunden. Nicht gebundenes Probenmaterial wird durch den ersten Waschschritt entfernt. Die nun immobilisierten humanen Primärantikörper werden während des zweiten Inkubationsschrittes spezifisch durch anti-human-igg (oder -IgM) Sekundärantikörper (D) gebunden, welche mit dem Enzym Peroxidase (E) konjugiert sind. Ungebundene Konjugatmoleküle werden durch den zweiten Waschschritt entfernt. Die Peroxidase setzt im dritten Inkubationsschritt enzymatisch die farblose Substratlösung (F) in ein dunkles, violettes Präzipitat (G) um. Dieses Präzipitat bindet auf Grund seines hydrophoben Charakters am Ort seiner Entstehung den hydrophoben Teststreifen. Diese Reaktion wird durch einen dritten Waschschritt gestoppt. Nachdem die Streifen getrocknet sind, werden sie auf der Archivmatrix fixiert und mittels der Interpretationsschablone evaluiert. Es sollte ein Scanbild der beklebten Matrix zur Archivierung erstellt werden, da die Färbung der Streifen altert. 4

5 6. Durchführung Vorbereitungen Entwicklungsreagenzien auf Raumtemperatur bringen und vor Gebrauch vortexen (schütteln)! Puffer 10x mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 1x-Konzentration verdünnen (1 Teil Puffer 10x + 9 Teile Wasser). Vor dem Verdünnen des Pufferkonzentrats müssen alle Salzkristalle gelöst sein. Wenn nötig, zum Lösen der Salzkristalle kurz erwärmen. Für jeden zu entwickelnden Teststreifen werden 5 ml Puffer 1x benötigt. Die auf diese Weise verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Die Testreifen sind in einem verschweißten Aluminiumbeutel verpackt. Zum Gebrauch diesen auftrennen und die benötigte Streifenanzahl mittels Schere entlang der aufgedruckten Linie von der Schutztasche abtrennen! Restliche Teststreifen mit der Schutztasche in den mitgelieferten Druckverschlussbeutel zurücklegen und verschließen (Teststreifen im Druckverschlussbeutel mindestens 30 Tage haltbar)! Alle anderen Testkomponenten sind gebrauchsfertig und bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Substrat lichtgeschützt aufbewahren. Testdurchführung Siehe Tabelle nächste Seite. Die Reihenfolge der Pipettierschritte und deren Durchführung im Zeittakt sind einzuhalten! Die Inkubation der Teststreifen findet in den 2 mitgelieferten Inkubationswannen statt! Sämtliche Reaktionsschritte finden auf einem Wippschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (ca Zyklen/Minute) statt. Zeitbedarf Entwicklung von 20 Teststreifen: ca. 120 min Tab.2 - Ablaufprotokoll Pos Beschreibung 1 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x und 10 µl Probe (Verdünnung 1:101) 2 Einlegen der Teststreifen mit Reaktionsseite nach unten 3 Inkubation für 30 min 4 Waschen mit 1 ml Puffer 1x für 5 min 5 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x und 50 µl Konjugatkonzentrat (Verdünnung 1:21) 6 Inkubation für 15 min 7 Waschen mit 1 ml Puffer 1x für 5 min 8 Pipettieren von 0,5 ml Substrat 9 Inkubation für 10 min 10 Waschen mit 1 ml Puffer 1x für 2 min 11 Absaugen des Substrats und Entsorgung gemäß lokaler Abfallbestimmungen. 12 Teststreifen auf die Archivmatrix kleben, 30 min trocknen lassen und anschließend mittels Schablone Färbungen interpretieren. Scannen der Streifen zur Archivierung. 5

6 7. Auswertung Zu Bewertung der entwickelten Teststreifen wird diese auf der Archivmatrix fixiert und die mitgelieferte Interpretationsschablone daran angelegt (siehe Abb.2). Die einzelnen Reaktionsfelder auf den Teststreifen werden dann mit den Cut-Off-Feldern der Schablone verglichen. Validierung Die Funktionskontrollbande muss gefärbt sein. Ist dies nicht der Fall, kann keine Beurteilung der Patientenseren erfolgen. Befundung Testfeld > Cut-Off Parameter ist positiv Testfeld = Cut-Off Parameter ist grenzwertig Testfeld < Cut-Off Parameter ist negativ Abb.2 Teststreifenauswertung Für einen untersuchten Proband besteht Verdacht auf APS wenn: Im IgG und/oder IgM-Nachweis der Parameter anti-ß2-gp I-Antikörper positiv ist und/oder Im IgG und/oder IgM-Nachweis jeweils 3 beliebige Parameter positiv sind (IgG und IgM nicht kumulativ) Asymptomatische Probanden können positive Autoantikörperbefunde aufweisen. Besonders IgM-Antikörper treten wegen der Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen auch bei Gesunden auf. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen Befunde und Laborbefunde berücksichtigt werden. 6

7 8. Leistungsangaben Methodenvergleich Referenzmethode: ELSIA (IVD) n-zahl: 160, 119* Antikörper Analytische Sensitivtät IgG - IgM Analytische Spezifität IgG - IgM anti-cardiolipin* 89 % - 46 % 92 % % anti-phosphatidsäure 92,6 % - 92,6 % 100 % % anti-phosphatidylethanolamin 70 % - 95,2 % 98,6 % - 94,2 % anti-phosphatidylglycerol 84,6 % % 97,8 % % anti-phosphatidylinositol* 62 % % 100 % - 99 % anti-phosphatidylserin* 81 % - 68 % 76 % - 75 % anti-annexin V 82,4 % - 77,8 % 90,9 % - 95,4 % anti-ß2-gp I* 94 % - 88 % 90 % - 98 % anti-prothrombin 95,2 % % 100 % - 98,7 % Klinische Studie n-zahl: 160 (60 APS-Proben, 100 Kontrollproben) Leistung Wert Klinische Sensitivität 95 % Klinische Spezifität 93 % Positiver Prädiktiver Wert 33 % Negativer Prädiktiver Wert 99,8 % Präzision n-zahl: 10 Leistung Wert Vergleichspräzision 100 % Wiederholpräzision 100 % 7

8 9. Anhang Tab.3 - Verwendete Symbole Symbol h l v t b Erläuterung Hersteller Chargennummer Verfallsdatum Lagertemperatur Artikelnummer i In-vitro-Diagnostikum pn Inhalt ausreichend "n" Bestimmungen g Gebrauchsanweisung beachten! - negativ +/- grenzwertig + positiv ++ stark positiv Literatur [1] Lim W.: Antiphospholipid antibody syndrome. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009: [2] Dirk Roggenbuck, Karl Egerer, Philipp von Landenberg, Rico Hiemann, Eugen Feist, Gerd-Rüdiger Burmester, Thomas Dörner: Anti-Phospholipid antibody profiling Time for a new technical approach? Elsevier, Autoimmunity Reviews 11 (2012) [3] Faricelli R, Esposito S, Toniato E, Flacco M, Conti P, Martinotti S, Robuffo I.: A new diagnostic approach to better identify antiphospholipid syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol Apr-Jun;21(2): [4] Gibson GE, Su WP, Pittelkow MR.: Antiphospholipid syndrome and the skin. J Am Acad Dermatol Jun;36(6 Pt 1): [5] Jacob H.Rand, Xiao-Xuan Wu, Robert Lapinski, Waander L. van Heerde, Chris P. Reutelingsperger, Pojen P. Chen, Thomas L. Ortel: Detection of antibody-mediated reduction of annexin A5 anticoagulant activity in plasmas of patients with the antiphsopholipid syndrome. Blood, 1 November 2004, volume 104, number 9. [6] Monica Galli, Davide Luciano, Guido Bertolini, Tiziano Barbui: Anti-ß2-glycoprotein I, antiprothrombin antibodies, and the risk of thrombosis in the antiphospholipid syndrome. Blood, 15 October 2003, volume 102, number 8. 8

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