C i attomol Anti-Phospholipid-IgG/M Lineassay 1 Testkit zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern
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- Annika Gerstle
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1 C i attomol Anti-Phospholipid-IgG/M Lineassay 1 Testkit zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern REF Bestimmungen GEBRAUCHSANWEISUNG 1. VERWENDUNGSZWECK Der Anti-Phospholipid LINA 1 ist ein manuell abzuarbeitender Streifentest zur qualitativen Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern gegen Phospholipide und lipidbindende Proteine folgender 4 Antigene in humanem Serum, welche bei der Differentialdiagnose des Anti-Phospholipid-Syndroms (APS) in Betracht kommen: ß2-GP I Cardiolipin Phosphatidylinositol Phosphatidylserin 2. ANWENDUNGSHINTERGRUND Das APS [1] ist eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen, mit Prädisposition des weiblichen Geschlechts. Typische klinische Symptome sind arterielle und venöse Thrombosen (Gefäßverstopfung), Thrombozytophenie (Verringerung der Blutplättchenzahl) und habituelle Aborte [2]. Beim Anti-Phospholipid-Syndrom finden sich spezifische Antikörper gegen verschiedene Phospholipide (Cardiolipin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol) und lipidbindende Proteine (ß2-GP I) [3]. Durch diese sogenannten Anti-Phospholipid-Antikörper kommt es zu einer vermehrten Gerinnbarkeit (Hyperkoagulabilität) des Blutes und folglich zu einem vermehrten Vorkommen von Thrombosen [4] REF 1145
2 3. TESTPRINZIP Auf dem Teststreifen (A) befinden sich ein Funktionskontrollfeld und 4 Testfelder. Jedes Testfeld ist mit einem hoch gereinigten immobilisierten Antigen (B) beschichtet. Dieses wird während des ersten Inkubationsschrittes durch in der Probe vorhandene spezifische Primärantikörper (C) gebunden. Nicht gebundenes Probenmaterial wird durch den ersten Waschschritt entfernt. Die nun immobilisierten humanen Primärantikörper werden während des zweiten Inkubationsschrittes spezifisch durch anti-human-igg- (oder -IgM-) Sekundärantikörper (D) gebunden, welche mit dem Enzym Peroxidase (E) konjugiert sind. Ungebundene Konjugatmoleküle werden durch den zweiten Waschschritt entfernt. Die Peroxidase setzt im dritten Inkubationsschritt enzymatisch die farblose Substratlösung (F) in ein dunkles, violettes Präzipitat (G) um. Dieses Präzipitat bindet auf Grund seines hydrophoben Charakters am Ort seiner Entstehung den hydrophoben Teststreifen. Diese Reaktion wird durch einen dritten Waschschritt gestoppt. Nachdem die Streifen getrocknet sind, werden sie auf der Archivmatrix fixiert und mittels Interpretationsschablone evaluiert. Es sollte ein Scanbild der beklebten Matrix zur Archivierung erstellt werden, da die Färbung der Streifen verblasst. A - Teststreifen B - Antigen C - Primärantikörper D - Sekundärantikörper E - Peroxidase F - Substrat (löslich) G - Produkt (präzipitierend) Abb. 1 Schema Funktionsweise REF 1145
3 4. PACKUNGSINHALT Tab. 1 Testkitbestandteile REF Bestandteil Menge Erläuterung t 240 Test strips 20 Stk. 372 Buffer 1x 110 ml 227 G-HRP 21x 1,2 ml 245 M-HRP 21x 1,2 ml 75 Substrate 11 ml Der Testkit enthält weiterhin: 1x Gebrauchsanweisung (je Gebinde) 1 Röhrchen (eingeschweißt) mit 20 Teststreifen, 4 Antigene gebrauchsfertig Puffer 1x, farbloser Phosphatpuffer, konserviert, weißer Verschluss gebrauchsfertig IgG-Konjugat 21x (anti-human, peroxidasekonjugiert), rötlich gefärbt, konserviert, roter Verschluss 21-fach konzentriert IgM-Konjugat 21x (anti-human, peroxidasekonjugiert), grünlich gefärbt, konserviert, grüner Verschluss 21-fach konzentriert Tetramethylbenzidin (TMB), farblos, blauer Verschluss gebrauchsfertig 1x Archivmatrix (Anti-Phospholipid LINA 1- Version ) 1x Interpretationsschablone (lotspezifisch) 2x Inkubationswannen 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Lagerung des Testkits bei, entsprechend des äußeren Etikettes. Einzelne Bestandteile können eine längere Haltbarkeit aufweisen (siehe Etikett). Nach Anbruch ist der Testkit noch 1 Monat haltbar. Das Substrat (REF 75) lichtgeschützt aufbewahren. 6. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE ARBEITSMITTEL, die nicht mitgeliefert werden Einkanal-Mikropipette 1000 µl verstellbare Einkanal-Mikropipette µl entsprechende Pipettenspitzen destilliertes oder entionisiertes Wasser (mind. Aqua dest.) Bechergläser Messzylinder Wippschüttler Pinzette Klebestift/ Klebeband zum Fixieren der Teststreifen auf der Archivmatrix handelsüblicher Flachbettscanner REF 1145
4 7. WICHTIGE HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Reagenziensatz ist zum In-vitro-Gebrauch bestimmt und muss von geschultem Laborpersonal in einem entsprechend eingerichteten Labor durchgeführt werden! Die Testdurchführung erfolgt vollständig bei Raumtemperatur. Als Probenmaterial ausschließlich humanes Serum verwenden! Beim Umgang mit den Komponenten des Testkits und mit den Patientenproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung beim Umgang mit potentiell infektiösem Material und gefährlichen Chemikalien zu beachten! Insbesondere sind folgende Regeln einzuhalten: Nicht essen, trinken oder rauchen! Nie mit dem Mund pipettieren! Handschuhe zur Vermeidung von Kontakt mit den Reagenzien und Seren tragen! Sicherheitshinweise zu den einzelnen Testkomponenten beachten! Die Arbeitsanweisung muss strikt befolgt und jegliche Zeitverschiebung vermieden werden! Die angegebenen Lagerungstemperaturen der Einzelkomponenten des Testkits sind einzuhalten! Die Teststreifen vorsichtig nur mittels Pinzette aus dem Röhrchen entnehmen (nicht mit der ungeschützten Hand berühren)! Das Mischen von Testkitkomponenten verschiedener Chargen ist nicht erlaubt! Dies gilt auch für die Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller zur Komplettierung eines geöffneten Testkits! Der Testkit oder seine geöffneten Reagenzien sind nur innerhalb der angegebenen Haltbarkeitsfristen zu verwenden! Tubes mit geringen Flüssigkeitsmengen vor dem Gebrauch kurz zentrifugieren! Wir empfehlen, mittels laborinterner Kontrollseren eigene Qualitätskontrollen durchzuführen (s. a. Eichordnung, Bundesgesetzblatt I, S. 1657, 1988 sowie Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, Dt. Ärzteblatt 98, Heft 42, S. A , 2001). Die Entsorgung der verwendeten Materialien erfolgt nach länderspezifischen Richtlinien. 8. DURCHFÜHRUNG Probenvorbereitung Pro Bestimmung einer Patientenprobe werden 10 µl Serum benötigt (Verdünnung 1:101). Blutproben sind aseptisch nach den geltenden Verfahren zu gewinnen und nach deren Gerinnung zur Serumgewinnung umgehend zu zentrifugieren. Der Einsatz hitzeinaktivierter, mikrobiell kontaminierter, hämolytischer und/ oder lipämischer Serumproben sollte vermieden werden. Serumproben können bis zu ihrer Verwendung gekühlt bei für bis zu 5 Tage, sollten bei längerer Aufbewahrung aber bei -20 C gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Testvorbereitung Alle im Testkit enthaltenen Materialien auf Raumtemperatur bringen. Reagenzien vor Gebrauch homogenisieren, Schaumbildung vermeiden! Die Teststreifen sind in einem eingeschweißten Röhrchen verpackt. Zum Gebrauch beides öffnen und die benötigte Streifenanzahl mittels Pinzette aus dem Röhrchen entnehmen (Achtung! Das Röhrchen ist nicht komplett verschlossen.). Anschließend Röhrchen fest verschließen! REF 1145
5 Testdurchführung Siehe Tab. 2 Ablaufprotokoll (alle Arbeitsschritte finden bei Raumtemperatur statt). Die Reihenfolge der Pipettierschritte und die Inkubationszeiten sind genau einzuhalten! Die Inkubation der Teststreifen findet in den mitgelieferten Inkubationswannen statt. Es ist darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen unter den Teststreifen befinden. Alle Inkubationszeiten sind genau einzuhalten! Sämtliche Inkubations- und Waschschritte finden auf einem Wippschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (ca Zyklen/Minute) statt. Beim Entfernen der Inkubationslösungen Verschleppungen derselben in andere Vertiefungen vermeiden! Zeitbedarf für 20 Teststreifen: ca. 70 min Tab. 2 Ablaufprotokoll Schritt Beschreibung 1 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x (REF 372) und 10 µl Probe je Kavität einer Inkubationswanne 2 Einlegen der Teststreifen (REF 240) mit Reaktionsseite nach unten! 3 Inkubation für 30 min 4 Probenverdünnung vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen 5 Waschen mit 1 ml Puffer 1x (REF 372) für 5 min 6 Pipettieren von 1 ml Puffer 1x (REF 372) und 50 µl IgG-Konjugat 21x (REF 244) oder IgM-Konjugat 21x (REF 245) (Verdünnung 1:21) 7 Inkubation für 15 min 8 Konjugatverdünnung vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen 9 Waschen mit 1 ml Puffer 1x (REF 372) für 5 min 10 Pipettieren von 0,5 ml Substrat (REF 75) 11 Inkubation für 10 min 12 Substrat vollständig aus den Vertiefungen absaugen, oder vorsichtig abgießen und gemäß lokaler Abfallbestimmungen entsorgen 13 Waschen mit 1 ml Aqua dest. für 2 min 14 Teststreifen kurz trocknen und anschließend auf die Archivmatrix kleben (Reaktionsflächen nicht überkleben!) und einscannen REF 1145
6 9. AUSWERTUNG Die auf der Archivmatrix fixierten trockenen Teststreifen können nur mit der mitgelieferten Interpretationsschablone ausgewertet werden (siehe Abb. 2). Die einzelnen Reaktionsfelder auf den Teststreifen werden dazu mit den Cut-Off-Feldern der Interpretationsschablone verglichen. Validierung Die Funktionskontrollbande muss gefärbt sein. Ist dies nicht der Fall, kann keine Beurteilung der Patientenseren erfolgen. Befundung Testfeld > Cut-Off Parameter ist positiv. Testfeld = Cut-Off Parameter ist grenzwertig. Testfeld < Cut-Off Parameter ist negativ. Abb. 2 Teststreifenauswertung Asymptomatische Probanden können positive Autoantikörperbefunde aufweisen. Besonders IgM-Antikörper treten wegen der Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen auch bei Gesunden auf. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen Befunde und Laborbefunde berücksichtigt werden. 10. PROBLEMBEHANDLUNG Nicht durchgängig gefärbte Testfelder eines Teststreifens lassen auf Luftblasen während der Testdurchführung schließen. Dies geschieht insbesondere dann, wenn der Teststreifen nicht in das erste Inkubationsmedium gelegt (s. Ablaufprotokoll), sondern das Inkubationsmedium auf den Teststreifen gegeben wurde. Der Teststreifen kann dennoch anhand der Färbung der Randbereiche ausgewertet werden REF 1145
7 11. LEISTUNGSMERKMALE Tab. 3 Methodenvergleich (Referenzmethode: ELSIA (IVD), n-zahl: 119) Parameter Analytische Sensitivität Analytische Spezifität IgG IgM IgG IgM anti-cardiolipin 89 % 46 % 92 % 100 % anti-phosphatidylinositol 62 % 100 % 100 % 99 % anti-phosphatidylserin 81 % 68 % 76 % 75 % anti-ß2-gp I 94 % 88 % 100 % 98 % Tab. 4 Präzision (n-zahl: 10) Leistung Wert Vergleichspräzision 100 % Wiederholpräzision 100 % 12. LITERATURANGABEN [1] Lim W.: Antiphospholipid antibody syndrome. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009: [2] Dirk Roggenbuck, Karl Egerer, Philipp von Landenberg, Rico Hiemann, Eugen Feist, Gerd-Rüdiger Burmester, Thomas Dörner: Anti-Phospholipid antibody profiling Time for a new technical approach? Elsevier, Autoimmunity Reviews 11 (2012) [3] Faricelli R, Esposito S, Toniato E, Flacco M, Conti P, Martinotti S, Robuffo I.: A new diagnostic approach to better identify antiphospholipid syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol Apr-Jun;21(2): [4] Gibson GE, Su WP, Pittelkow MR.: Antiphospholipid syndrome and the skin. J Am Acad Dermatol Jun;36(6 Pt 1): ANHANG 1 Tab. 5 Symbolerläuterungen Symbol Erläuterung h l v Hersteller Chargennummer verwendbar bis 2t 8 C Lagerung zwischen +2 C und +8 C b i pn g Bestellnummer In-vitro-Diagnostikum Inhalt ausreichend für <n> Bestimmungen Gebrauchsanweisung beachten - negativ +/- grenzwertig + positiv ++ stark positiv REF 1145
8 ANHANG 2 Wichtige inhaltliche Änderungen dieser Anleitung zur Vorversion 7 vom : Änderung Dokumententitel von «Bedienungsanleitung» in «Gebrauchsanweisung» Neugestaltung dieser Anleitung (Design, Aufbau) Terminologie näher an die Verordnung über IVD 2012/541 angelehnt generelle Formatierungen, Rechtschreibkorrektur Kapitel 4 - Tab. 1 neuer Artikel Puffer 1x, neue Artikelnummer für IgG-Konjugat 21x (nun REF 227), Tabelle harmonisiert (englische Kurzbezeichnung, Erläuterung aktualisiert), Einfügen der Versionsbezeichnung für die Archivmatrix, Einfügen Bemerkung «(lotspezifisch)» bei Interpretationsschablone Kapitel 6 - (vormals Kapitel 4) aktualisiert (Streichungen) Kapitel 8 - Probenvorbereitung eingefügt, Puffer 10x gestrichen, Ablaufprotokoll ergänzt um Absaugschritte, letzter Waschschritt mit Aqua dest., Testdauer aktualisiert (Inkubationszeiten nicht geändert!) Kapitel 9 - Auswertung mittels Interpretationsschablone obligatorisch, neues Design Schablone (Abb. 2) Kapitel 10 - neuer Punkt: «PROBLEMBEHANDLUNG» Kapitel 11 - neuer Punkt: «LEISTUNGSMERKMALE» REF 1145
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