VZV-IgM-ELA Test PKS medac. Deutsch 101-PKS-VPD/010512

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1 VZVIgMELA Test PKS medac Deutsch 101PKSVPD/010512

2 HERSTELLER medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg VERTRIEB medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ BESTELLADRESSE Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ PKSVPD/010512

3 VZVIgMELA Test PKS medac Enzymimmunoassay mit PipettierKontrollSystem zur Bestimmung von IgMAntikörpern gegen das VarizellaZosterVirus (VZV) in Serum KatalogNr.: 101PKS ZUR IN VITRO DIAGNOSTIK EINFÜHRUNG Das VarizellaZosterVirus (VZV) gehört zur Familie der Herpesviridae. Es besteht aus einem doppelsträngigen DNAGenom, dem Nukleokapsid, dem Tegument und der Virushülle. Primärinfektionen (Varizellen) erfolgen in der Regel im Kindesalter. Bei immunkompetenten Patienten ist die Symptomatik in der Regel moderat. Bei Immunsupprimierten kann die Infektion zu ernsthaften Komplikationen (ZNSSymptomatik, Pneumonien, sekundäre bakterielle Infektionen) führen. Die Seroprävalenz bei erwachsenen Personen liegt bei etwa 95%. Typisch für VZV ist, dass sie nach einer Primärinfektion lebenslang in den sensorischen Nervenganglien des Dorsalstammes persistieren und eine latente Infektion der neuronalen Zellen verursachen. Durch endogene Reaktivierung des Virus kann es daher zur Ausprägung des Sekundärkrankheitsbildes Herpes Zoster kommen. Varizellen können durch Impfungen verhindert werden. Die auf dem Markt befindlichen Impfstoffe sind hinsichtlich der Prävention hocheffizient. Die Diagnose der Varizellen und des Zoster erfolgt in der Regel durch das typische klinische Bild. Bei atypischen Krankheitsverläufen oder in der Schwangerschaft sind labordiagnostische Untersuchungen essentiell. VZVAntikörperbestimmungen dienen primär der Klärung der Immunität oder des Impferfolgs, sind aber auch zur Bestätigung bei Verdacht auf Varizellen bzw. Zoster sinnvoll. Der Nachweis einer VZVspezifischen intrathekalen Antikörpersynthese im Rahmen der Serum LiquorDiagnostik ist Bestandteil der differentialdiagnostischen Abklärung akuter Infektionen wie auch chronischer Erkrankungen mit ZNSBeteiligung. Ein positiver VZVIgMBefund spricht für eine Primärinfektion, kann aber auch Ausdruck einer endogenen Reaktivierung des latent persistierenden VZV sein. Ein VZVIgMBefund muss stets im Zusammenhang mit VZVIgG und IgA und in Verbindung mit der klinischen Symptomatik interpretiert werden. Der VZVIgMELA Test PKS medac detektiert IgMAntikörper im Serum, die gegen VZV gerichtet sind. Der Test ist schnell und einfach durchzuführen. Die Verwendung des µcapture und ELAPrinzips ermöglicht eine hochspezifische und sensitive diagnostische Aussage. 101PKSVPD/

4 TESTPRINZIP Mit AntiHumanIgM beschichtete Mikrotiterplatte. Die IgMFraktion aus dem Patientenserum wird auf der Mikrotiterplatte gebunden. Die antivzvigmantikörper binden das Peroxidasekonjugierte VZVIgMELA (AG = Antigen, P = Peroxidase). Inkubation mit TMBSubstrat (*). Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure. Die Auswertung erfolgt photometrisch. Testvorteile Keine unspezifischen Reaktionen und falsch positiven Ergebnisse durch Rheumafaktoren. Keine Blockade der IgMAntikörper durch hohe IgGTiter. Durch das PipettierKontrollSystem kann jeder einzelne Pipettierschritt durch Farbumschlag visuell überprüft werden. Die brechbaren Mikrotiterstreifen gewährleisten eine optimale Testauslastung. Automatisierbar auf offenen ELISAGerätesystemen. 101PKSVPD/

5 PACKUNGSINHALT KAT. NR.: 101PKS 1. MTP Mikrotiterplatte: 12 Teststreifen à 8 Vertiefungen (bedruckt mit VZM, mit Halterahmen und Trockenmittelpappe im Aluminiumbeutel vakuumverschweißt), brechbar, Rundboden, beschichtet mit Ziege AntiHumanIgMAntikörpern, BSA und phindikator, gebrauchsfertig. 2. CONTROL Negative Kontrolle: 1 Fläschchen à 1,5 ml, humanes Serum, gebrauchsfertig, enthält BSA, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 3. CONTROL + Positive Kontrolle: 1 Fläschchen à 1,5 ml, humanes Serum, gebrauchsfertig, enthält FKS, BSA, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 4. WB Waschpuffer: 1 Flasche à 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, enthält ProClin TM VIRDIL Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche à 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, gebrauchsfertig, enthält ProClin TM ANTIGENDIL Antigenverdünnungspuffer: 1 Fläschchen à 14 ml Tris/NaCl/Tween, gebrauchsfertig, enthält ProClin TM ANTIGEN VZVIgMELA (Enzyme Labelled Antigen): 4 Fläschchen à 3,0 ml, lyophilisiert, enthält FKS. 8. TMB TMBSubstrat: 1 Fläschchen à 10 ml, gebrauchsfertig. 9. STOP Stopplösung: 2 Fläschchen à 11 ml, 0,5 M Schwefelsäure (H 2 SO 4 ), gebrauchsfertig. 101PKSVPD/

6 1. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Material/Reagenz Zustand Lagerung Haltbarkeit Testkit ungeöffnet C bis Verfalldatum Mikrotiterplatte geöffnet C 6 Wochen im Beutel mit Trockenmittelpappe Kontrollen geöffnet C 6 Wochen Waschpuffer verdünnt C 6 Wochen Probenverdünnungspuffer geöffnet C 6 Wochen Antigenverdünnungspuffer geöffnet C 6 Wochen VZVIgMELA gebrauchsfertig C 7 Tage < 18 C * 6 Wochen TMBSubstrat geöffnet C 6 Wochen Stopplösung geöffnet C bis Verfalldatum * Aliquotieren und nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren. Die Reagenzien sind nach Ablauf des angegebenen Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. 2. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 2.1. Aqua ad iniectabilia (H 2 O bidest.). Die Verwendung von entionisiertem Wasser kann zu Störungen im Testsystem führen Mikroliterpipetten für entsprechende Volumina Saubere Glas oder Kunststoffgefäße zum Verdünnen von Waschpuffer und Proben Geeignete Vorrichtung zum Waschen der Mikrotiterplatte (z. B. Multistepper oder ELISAWaschgerät) Inkubator für 37 C MikrotiterplattenPhotometer mit Filtern für 450 nm und nm. 3. ANSETZEN DER REAGENZIEN Alle Kitkomponenten müssen vor Testansatz auf Raumtemperatur gebracht werden. Ermitteln Sie die Anzahl der benötigten Mikrotitervertiefungen. 101PKSVPD/

7 3.1. Mikrotiterplatte Der Aluminiumbeutel muß nach jeder Entnahme zusammen mit der Trockenmittelpappe wieder fest verschlossen werden. Lagerung und Haltbarkeit der nicht verwendeten Mikrotitervertiefungen siehe unter 1. Hinweis: Die Mikrotitervertiefungen weisen einen leicht grünlichen Farbton auf. Ggf. auftretende grünlichbraune Flecken in den Vertiefungen sind produktionsbedingt und stören den Test nicht Waschpuffer 1 Teil Waschpuffer (10x) wird mit 9 Teilen Aqua ad iniectabilia angesetzt (z. B. 50 ml Waschpuffer (10x) mit 450 ml Aqua ad iniectabilia). Für acht Vertiefungen werden 10 ml Waschpuffer benötigt. Evtl. im Waschpuffer (10x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen VZVIgMELA Das Lyophilisat wird 60 min vor Gebrauch mit jeweils 3,0 ml Antigenverdünnungspuffer aufgelöst. Die verschlossenen Fläschchen werden leicht geschwenkt, so dass auch am Verschluß haftende Partikel in Lösung gebracht werden. Nach dem Auflösen ist das VZVIgMELA rot gefärbt und gebrauchsfertig. Das gebrauchsfertige ELA ist 7 Tage bei 2 8 C bzw. 6 Wochen bei < 18 C lagerfähig (s. 1.). Die testspezifischen Reagenzien (Mikrotiterplatte, Kontrollen, VZV IgMELA, Antigenverdünnungspuffer) sind nicht mit denen anderer Chargen zu mischen. Im Gegensatz dazu sind Probenverdünnungspuffer, Waschpuffer, TMBSubstrat und Stopplösung für alle virologischen Tests von medac grundsätzlich austauschbar. Reagenzien anderer Hersteller sind generell nicht einzusetzen. Nur bei exakter Einhaltung der Arbeitsvorschrift werden valide und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. 101PKSVPD/

8 4. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 4.1. Der Test ist geeignet zur Untersuchung von Serum. Die Patientenproben können für 7 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung sollte bei 20 C erfolgen. Mehrmaliges Auftauen und Wiedereinfrieren der Proben ist zu vermeiden Eine Vorbehandlung der Seren, wie z. B. Inaktivierung, ist nicht erforderlich, sie sollten jedoch nicht mikrobiell kontaminiert und frei von Humanerythrocyten sein Die Seren werden 1:100 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt. Zur TiterBestimmung können die Proben beliebig weiterverdünnt werden. 5.A. ARBEITSVORSCHRIFT 5.1. Die Verpackung der Mikrotiterplatte am ZIPVerschluß öffnen und die erforderliche Anzahl Mikrotitervertiefungen entnehmen (s. 3.1.). Die Mikrotitervertiefungen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vorgewaschen werden Die Vertiefung A1 bleibt frei für die Ermittlung des Leerwertes (s. 6.A.). Jeweils 50 μl der Proben sowie in Doppelbestimmung negative Kontrolle und positive Kontrolle in die Vertiefungen der Platte pipettieren. Nach dem Pipettieren der Proben (phneutrale bzw. basische Flüssigkeiten) kommt es zu einer Blau/Grünfärbung. Erfolgt in einer Vertiefung kein Farbumschlag, so ist dies ein Hinweis darauf, dass keine Probe bzw. keine Kontrolle pipettiert wurde. Ggf. kann die Platte bis zur weiteren Bearbeitung für maximal 30 min bei RT gelagert werden Die Mikrotitervertiefungen 60 min (± 5 min) bei 37 C (± 1 C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Auflösen des VZVIgMELA (s. 3.3.) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen dreimal mit jeweils 200 μl Waschpuffer waschen. Darauf achten, dass alle Vertiefungen beim Waschen gefüllt werden. Nach Beendigung des Waschvorganges Mikrotitervertiefungen auf Filterpapier ausklopfen. Nicht austrocknen lassen! Umgehend weiterverwenden! 101PKSVPD/

9 5.6. VZVIgMELA (rot gefärbt) in alle Vertiefungen (außer A1) pipettieren. Beim manuellen Abarbeiten des Tests werden 50 μl ELA pro Vertiefung pipettiert. Bitte beachten: Beim Arbeiten mit automatisierten Gerätesystemen ist auf Grund der höheren Verdunstung in den Inkubationskammern die Zugabe von 60 μl ELA pro Vertiefung zu programmieren. Die grundsätzliche Eignung des Tests für die automatisierte Abarbeitung konnte im Rahmen der Validierung gezeigt werden. Dennoch empfehlen wir, die Kompatibilität mit dem zum Einsatz kommenden Gerätesystem zu verifizieren Erneut 60 min ( 5 min) bei 37 C (± 1 C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen erneut waschen (s. 5.5.) μl TMBSubstrat in jede Vertiefung (auch A1) pipettieren und 30 min ( 2 min) bei 37 C ( 1 C) im Dunkeln inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt). Positive Proben erscheinen blau gefärbt Durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung (auch A1) wird die Reaktion gestoppt. Es erfolgt ein Farbumschlag von blau nach gelb. Mikrotitervertiefungen vor photometrischer Messung von unten abwischen und darauf achten, dass keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind. Die Messung ist innerhalb von 15 min nach dem Stoppen durchzuführen. 101PKSVPD/

10 5.B. TABELLE ZUR ARBEITSVORSCHRIFT Negative Kontrolle Positive Kontrolle Probe Leerwert (A1) Negative Kontrolle 50 μl Positive Kontrolle 50 μl Probe 50 μl 60 min bei 37 C inkubieren, 3x mit 200 μl Waschpuffer waschen VZVIgMELA 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) 60 min bei 37 C inkubieren, 3x mit 200 μl Waschpuffer waschen TMBSubstrat 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 30 min bei 37 C im Dunkeln inkubieren Stopplösung 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Photometrische Auswertung bei 450 nm (Ref nm) *) manuelle/automatisierte Abarbeitung (s. 5.6.) 6.A. TESTBEURTEILUNG (VALIDITÄT) Die photometrische Auswertung erfolgt bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge nm). Die OD des Leerwertes (Vertiefung A1) wird von allen ODWerten subtrahiert. Der ODMittelwert der negativen Kontrolle muss < 0,150 betragen. Der ODMittelwert der positiven Kontrolle muss > 0,600 betragen. Cutoff = ODMittelwert der negativen Kontrolle + 0,140 Grenzbereich = Cutoff ± 10 % Sind die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, muss der Test wiederholt werden. 101PKSVPD/

11 6.B. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE/GRENZEN DER METHODE Proben mit ODWerten unterhalb des Grenzbereiches werden als NEGATIV bewertet. Proben mit ODWerten innerhalb des Grenzbereiches werden als GRENZWERTIG bewertet. Diese Werte sollten kontrolliert werden, indem nach 14 Tagen eine zusätzliche Patientenprobe entnommen wird, die zusammen mit der ersten Probe auf eine Titerbewegung untersucht wird. Proben mit ODWerten oberhalb des Grenzbereiches werden als POSITIV bewertet. Die Testergebnisse sollten stets im Zusammenhang mit dem klinischen Bild der Patienten sowie den VZVIgG, den VZVIgA Ergebnissen und ggf. weiteren diagnostischen Parametern interpretiert werden. Bei Verdacht auf eine VZVPrimärinfektion während der Schwangerschaft und negativem VZVIgMErgebnis ist eine weiterführende Diagnostik, z.b. PCR, erforderlich. Kreuzreaktivitäten, die durch Antikörper gegen andere Herpesviren sowie durch ANA und heterophile Antikörper hervorgerufen werden, können in Einzelfällen nicht ausgeschlossen werden. Ein Einfluß sehr stark erhöhter Lipidwerte auf die gemessenen Ergebnisse kann nicht ausgeschlossen werden. Hohe Hämoglobinkonzentrationen beeinflussen die Testergebnisse nicht. 101PKSVPD/

12 7. LEISTUNGSMERKMALE Die nachfolgenden Leistungsmerkmale wurden von uns im Rahmen der diagnostischen Evaluierung ermittelt. 7.A. SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT Im Rahmen der diagnostischen Erprobung wurden 150 Proben im Vergleich zur diagnostischen Bewertung aus dem Labor Frau Prof. Enders und Kollegen, Stuttgart, gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden NeunFelderTafel dargestellt: VZVIgMELA Test PKS medac Bewertung Prof. Enders negativ grenzwertig positiv negativ grenzwertig positiv 1* 0 45 *Probe eines Patienten mit gesicherter frischer VZVInfektion Sensitivität = 90,0 % Spezifität = 99,0 % Übereinstimmung: 96,0 % 7.B. PRÄZISION Probe IntraassayVarianz InterassayVarianz MW OD S VK (%) n Probe MW OD S VK (%) n NK 0,048 0,003 6,3 22 NK 0,094 0,017 18,1 11 GW 0,556 0,021 3,8 22 GW 0,621 0,045 7,2 11 PK 0,995 0,029 2,9 22 PK 1,083 0,051 4,7 11 Nr. 1 0,081 0,004 4,9 22 Nr. 6 0,104 0,014 13,5 11 Nr. 2 0,309 0,018 5,8 22 Nr. 7 0,370 0,030 8,1 11 Nr. 3 0,406 0,019 4,7 22 Nr. 8 0,567 0,033 5,8 11 Nr. 4 0,767 0,039 5,1 22 Nr. 9 0,889 0,058 6,5 11 Nr. 5 1,426 0,087 6,1 22 Nr. 10 1,542 0,062 4,0 11 NK = negative Kontrolle; GW = schwach positive Kontrolle (nicht im Kit enthalten); PK = positive Kontrolle 101PKSVPD/

13 ALLGEMEINE HANDHABUNGSHINWEISE Reagenzienflaschen und deren Verschlüsse nicht vertauschen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Sofort nach Gebrauch die Reagenzflaschen wieder fest verschliessen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach Gebrauch sind die Reagenzien sofort wieder, entsprechend den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen, zu lagern, um die angegebene Haltbarkeit zu gewährleisten. Um Verwechslungen mit Reagenzien anderer Testsysteme oder Chargen zu vermeiden, sollten alle Kitkomponenten einer Testpackung nach dem Gebrauch zusammen in der Originalpackung gelagert werden (siehe auch 3.). SICHERHEITSHINWEISE Die national verbindlichen Arbeitsschutzvorschriften sind zu beachten. Die Reagenzien humanen Ursprungs wurden auf HBsAg, AntiHIV 1/2 und AntiHCV untersucht und für nicht reaktiv befunden. Dennoch sollten diese Reagenzien, wie auch jene, die Bestandteile tierischer Herkunft enthalten (siehe Packungsinhalt), als potentiell infektiös behandelt werden, um das Risiko einer Ansteckung zu vermeiden. ENTSORGUNGSHINWEISE Die in diesem Produkt enthaltenen Chemikalien und Zubereitungen sowie die bei der Anwendung dieses Produktes anfallenden Reste sind in der Regel Abfälle, die einer ordnungsgemäßen Entsorgung zugeführt werden müssen. Die Entsorgung solcher Abfälle unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde oder Abfallentsorgungsunternehmen informieren über die Entsorgungsmöglichkeiten. Ausgabedatum: PKSVPD/

14 LITERATUR de Ory, F. et al.: European seroepidemiology network 2; Standardisation of assays for seroepidemiology of varicella zoster virus. J. Clin. Virol. 36, (2006) Gross, G., Doerr, H. W. (Hrsg.): Herpes Zoster. Monogr. Virol. Vol. 26, 1319, Karger Basel (2006) Heininger, U., Seward, J.F.: Varicella. Lancet 368, (2006) Mertens, Th., Haller, O., Klenk, H.D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten , Urban & Fischer Verlag (2004) Sauerbrei, A., Wutzler, P.: Herpes simplex and varicella zoster virus infections during pregnancy: Current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 2: Varicellazoster virus infections. J. Clin. Microbiol. 44 (9), (2006) Wutzler, P., Färber, J., Wagenpfeil, S. Bisanz, H., Tischer, A.: Seroprevalence of varicellazoster virus in the German population. Vaccine 21, (2002) 101PKSVPD/