Wochenbericht vom , Infektionsimmunologie

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1 Wochenbericht vom , Infektionsimmunologie Nils Volkening Ziel der Untersuchung ist die quantitative Angabe der nachgewiesenen Antikörper gegen z.b. CMV, HSV, VZV, jeweils als IgG und IgM Antikörper, im Serum oder Liquor. Antikörper sind Eiweißstoffe, die unter Anregung von Antigenen im Makroorganismus gebildet werden. Sie wirken hochgradig spezifisch auf das Antigen, was ihre Erzeugung ausgelöst hat. Die Antikörper sind ganz überwiegend in der Gammafraktion der Serumglobuline enthalten. Diese Proteine werden in die folgenden Immunglobulinklassen unterteilt : γg ( IgG), macht den Hauptteil der Gammaglobulinfraktion aus ; mindestens 80% aller gegen Bakterien, Viren und Toxine gerichteten Antikörper gehören zu dieser Klasse, die im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen - plazentagängig ist ; das Neugeborene ist daher hauptsächlich durch IgG-Antikörper geschützt. IgG Antikörper sind in der Lage das Komplementsystem zu aktivieren. Es tritt nach einem Antigenreiz später auf als IgM (s. u.), verweilt aber gewöhnlich sehr viel länger. γm ( IgM), macht etwa 5-10% der Serumantikörper aus, IgM Antikörper können ebenfalls das Komplementsystem aktivieren; IgM - Bildung setzt nach einem Antigen- Reiz rasch ein, jedoch sind IgM - Antikörper nur relativ kurze Zeit nachweisbar. Erforderliches Zubehör: Verschiedene ELISA Teste ( Enzym Link Immuno Sorbit Assay ) Vorbereitungen: Es wird in der EDV oder in den Karteikästen nachgesehen, ob dieser Patient schon bekannt ist und wie die jeweiligen Vorwerte aussahen. Danach wird entschieden, wie viele Verdünnungen angesetzt werden müssen. Bestückung der Vorverdünnungsplatten. Am Anfang und Ende wird ein Röhrchen für die Referenz gestellt. Dazwischen die Probenverdünnungen und ihre Weiterverdünnungen. 20µl Serum werden in 400µl Probenpuffer gegeben und auf einem Schüttler gemischt. Ansatz für IgG Vorverdünnung für Kontrollen und Proben: 1:21, z.b. 400µl Probenpuffer blau plus 20µl Kontrolle oder Untersuchungsprobe. Am Anfang und am Ende jeder Serie steht eine P/N Kontrolle, dazwischen werden die Untersuchungsproben positioniert. Dieser Ansatz wird in der Mikrotiterplatte 1:11 weiterverdünnt. D.h. in der Platte werden 200µl Probenpuffer weiß vorgelegt und 20µl aus der 1:21 Verdünnung hinzugefügt. Dieser Ansatz muß immer parallel in dem mit Antigen beschichteten Riegel und in dem mit Kontrollantigen beschichteten erfolgen. Es ergibt sich eine Endverdünnung von 1:231. Diese wird bei der Berechnung der Methode durch die BES zugrunde gelegt. Sind höhere Titer (ab ca 1:12000) zu erwarten, kann die 1:21 Verdünnung in 10er Schritten weiterverdünnt werden, z.b. 180µl plus 20µl. Das von der Software errechnete Ergebnis muß dann mit 10 bzw 100 mµltipliziert werden. Sollen Liquorproben untersucht werden wird statt der 1:21 Vorverdünnung eine Verdünnung von 1:2 eingesetzt. Das Ergebnis muß dann durch 11 dividiert werden.

2 Ansatz für IgM Vorverdünnung für Kontrollen und Proben: 1:21 (s. o.) Am Anfang jeder Serie steht eine negative Kontrolle (P/N), an zweiter und an letzter Stelle eine positive Kontrolle (P/P),dazwischen werden die Untersuchungsproben positioniert. Die l :21 verdünnten Proben -nicht die Kontrollen!- werden 1:2 mit RF- Absorbens 15 min inkubiert. Für den Screening-Test kann die IgG Verdünnung verwendet werden, (200µl Verdünnung plus 200µl RF- Absorbens). Soll der IgM Gehalt der Probe austitriert werden, muss ein eigenes Röhrchen mit 400µl 1:21 Verdünnung plus 400µl Absorbens angesetzt werden. Daraus kann nach der Inkubation eine Verdünnungsreihe in 2erSchritten vorgenommen werden. Je nach vermuteter Titerhöhe bis zu 8 Röhrchen mit 400µl blauem Probenpuffer befüllen und aus der inkubierten Probe 400µl überpipettieren. Ebenfalls muß für Liquorproben ein eigenes IgM Röhrchen in der Verdünnung 1:21 hergestellt werden, da sich die 1:2 Verdünnung des IgG Röhrchens nicht für den IgM Ansatz eignet. Von den vorverdünnten Kontrollen und den absorbierten Proben werden jeweils 150µl in die mit Antigen beschichteten und in die mit Kontrollantigen beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatten pipettiert. P/N Kontrolle: Positiv für IgG; Negativ für IgM P/P Kontrolle: Positiv für IgG; Positiv für IgM Test Prinzip von IgG ELISA Die Mikrotiter - Platte ist mit einem spezifischen Antigen beschichtet. Menschlicher Antiköper, der nur mit diesem Antigen reagiert und im zugegebenen Serum enthalten ist.. Inkubation bei 37 C für 60 min. In dieser Zeit lagern sich die Antikörper an die Antigene. 3mal waschen, damit die restlichen nicht gebundenen Antikörper zu keinerlei falschen Ergebnissen führen.

3 Antihuman Antikörper an den ein Enzym gekoppelt ist, lagert sich an den bereits gebundenen Human - Antikörper. Antigen Antikörper - Komplex. Inkubation bei 37 C für 60 min. In dieser Zeit lagern sich die Antihuman - Antikörper an die Human Antikörper. 3mal waschen, damit die restlichen nicht gebundenen Antihuman - Antikörper zu keinerlei falschen Ergebnissen führen. Chromogen, reagiert farbig mit dem Enzym. Antigen Antikörper Antihuman Antikörper - Komplex mit Chromogen - Anlagerung unter Bildung eines Farbkomplexes. Inkubation bei 25 C - 18 C für 30 min. Während dieser Zeit bildet das Chromogen und das Enzym einen Farblack aus. Zugabe einer Stopplösung. Sie unterbindet die weitere Farbbildung zwischen Enzym und Chromogen. Photometrische Messung innerhalb einer Stunde bei 450nm. Die Extinktion ist proportional zur Menge der Antikörper im Serum.

4 Test Prinzip von IgM ELISA Die Mikrotiter - Platte ist mit einem spezifischen Antigen beschichtet. Menschlicher Antiköper, der nur mit diesem Antigen reagiert und eventuell im Serum enthalten ist.. Inkubation bei 37 C für 60 min. In dieser Zeit lagern sich die Antikörper an die Antigene. 3mal waschen, damit die restlichen nicht gebundenen Antihuman - Antikörper zu keinerlei falschen Ergebnissen führen. Antihuman - Antikörper an den ein Enzym gekoppelt ist, lagert sich an den bereits gebunden Human - Antikörper. Antigen Antikörper - Komplex. Inkubation bei 37 C für 60 min. In dieser Zeit lagern sich die Antihuman - Antikörper an die Human - Antikörper.

5 3mal waschen, damit die restlichen nicht gebundenen Antihuman - Antikörper zu keinerlei falschen Ergebnissen führen. Antigen Antikörper Antihuman - Antikörper Komplex mit Chromogen - Anlagerung unter Bildung eines Farbkomplexes. Chromogen, reagiert farbig mit dem Enzym. Inkubation bei 25 C - 20 C für 30 min. Während dieser Zeit bildet das Chromogen und das Enzym einen Farblack aus. Zugabe einer Stopplösung, Sie unterbindet die weitere Farbbildung zwischen Enzym und Chromogen. Auswertung von CMV IgG und IgM Elisa IgG Elisa IgM Elisa Probe Rohwert Ergebnis Rohwert Ergebnis Interpretation 1 1, ,119 0,05 Dieser Patient hatte eine CMV Erkrankung hinter sich. 2 2,033 0, Photometrische Messung innerhalb einer Stunde bei 450nm. Die Extinktion ist proportional zur Menge der Antikörper im Serum. 0,420 0,304 Dieser Patient hatte schon eine CMV Infektion und hat sich erneut infiziert.

6 3 0, ,204 0,920 Dieser Patient hat zum aller ersten Mal in seinem Leben eine CMV Erkrankung Durchführung der Routine auf dem Hepatitis-Platz Als erstes wird der Axsym 1mal vorgespült. Anschließend wird das HCV Kit aus dem Kühlschrank geholt und die Patientenseren vom Vortag werden noch einmal zentrifugiert. Die Reagenzien - Packs werden ins Gerät gestellt. Bei den Kontrollseren wird auf die Menge geachtet und gegebenenfalls erneuert, danach werden sie auch ins Gerät gestellt. Nun werden über Anforderung und Kontrollen alle Hepatitis Kontrollen, außer HCV, eingegeben. Nach der Kontrolle, ob alles eingegeben ist, wird das Gerät gestartet. In der Zwischenzeit kann man schon von der Annahme die neuen Proben holen. Die Seren werden nach dem Abgleichen mit den Begleitscheinen zentrifugiert. Die Begleitscheine werden gestempelt, die Nummer wird auf dem HCV Zettel vermerkt. Auf die kleinen Klebezettel der Begleitscheine werden die Nummern geschrieben und auf einem Extraröhrchen geklebt. Diese Röhrchen werden zum Aufbewahren der Seren benutzt. Die zentrifugierten Röhrchen werden anschließend mit der laufenden Nummer versehen, hierfür gibt es vorgedruckte Klebezettel, die neben dem Stempelautomaten liegen. Jetzt kann die Hepatitis Anforderung in dem Axsym über Anforderung und Patienten eingegeben werden. Hep1: HBs AG und Core Hep2: HBs AG, Core, HBe AG, HAV IgM Hep3: AUSAB, anti Habe, Core IgM Bei Anforderung auf: Hepatitisserologie: Hep2 anwählen, Hep. A, B, C: Hep2 + HAVAB anwählen, Hep. B, C: Hep2 anwählen und HAVAB IgM deaktivieren. Danach kann man nun die Anforderungsliste ausdrucken. Auf der Anforderungsliste steht mit welchem Probencontainer angefangen werden soll. Die Röhrchen werden nach der Reihenfolge in diesen Container gestellt. Wenn nur Serum vorhanden ist, muß dieses in einen Adapter mit Probenbecher umgefüllt werden, dabei ist darauf zu achten, dass der Barcode gut lesbar ist, und nicht durch andere Zettel verdeckt wird. Bei den normalen Probenröhrchen ist darauf zu achten, dass man den Inhalt gut sehen kann, weil der Axsym mit optischen Sensoren die Höhe des Serums misst. Nach dem die Kontrollen fertig sind und sie über Ergebnisse ausgedruckt sind, kann man die Container hineinstellen und starten. Vorher sollte man noch einmal den Bestand der Reagenzien kontrollieren. Nach der Testdurchführung kann man über Patienten und Ergebnisse die Ergebnisse ausdrucken lassen und anschließend freigeben. Auswertung Ist nur der Core positiv, muß die Nr. am Axsym neu eingegeben werden und auf Hep3 untersucht werden, d.h. bei pos. Anti HBC müssen anti HBs, anti - HBe und Core IgM noch angeschlossen werden, um den Infektionsstatus zu erkennen. Ist neben dem anti HBc auch das HBs AG positiv, müssen nur anti - HBs und Core IgM nachuntersucht werden. Bei positiven HBs AG kann kein anti - HBs vorhanden sein und HBs AG muß noch mal 1:100 gemessen werden. Bestätigungstest Ein HBs AG Test wird nur gemacht, wenn im letzten ½ - 1 Jahr von diesem Patienten kein Test gelaufen ist. Für die Titerbestimmung werden beide Werte vom

7 Axsym (unverdünnt und 1:100) in eine Liste eingetragen und anhand dieser Liste wird die Titerstufe für die Bestimmung im Behring ermittelt.

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