LD BioScreen. Low Density Biochip Schnelltest-Systeme. Offenes System für Sandwich-Immunoassays. LD BioScreen

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1 LD BioScreen Low Density Biochip Schnelltest-Systeme Offenes System für Sandwich-Immunoassays LD BioScreen Die Alternative zur Mikrotiterplatte Für Assays im Forschungslabor Sie sparen Material, Zeit und Geld. BioTeZ Berlin-Buch GmbH Robert-Rössle-Str. 10 D Berlin Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) Internet: Nur für wissenschaftliche Zwecke. Nicht für die humanmedizinische Diagnostik.

2 Einführung Unter der Bezeichnung LD BioScreen ist eine Technologie auf der Basis von Low Density Biochips zusammengefasst, die Anwendern eine unkomplizierte und rasche Durchführung verschiedenartiger Immuno- bzw. DNA-Assays in miniaturisiertem Maßstab ermöglicht. Mit der Miniaturisierung ist gleichzeitig eine Verkürzung der Analysenzeiten und eine deutliche Einsparung bei Materialien und Reagenzien verbunden. Hauptanwendungsgebiete sind Antikörpertitrationen und Analysen von PCR- Produkten sowie kompetitive und Sandwich-Immunoassays. Darüber hinaus können auch multiple Assays auf Low Density Biochips durchgeführt werden. Die Einzelkits sind in Abhängigkeit vom Assaytyp unterschiedlich umfangreich zusammengesetzt und enthalten eine Reihe notwendiger Komponenten, um mit eigenem Probenmaterial, Antikörpern, Immunkonjugaten bzw. Nachweiskonjugaten Assays abarbeiten zu können. Je nach Art des Assays enthalten die Kits Basis-LD Biochips oder Streptavidin-LD Biochips. Im Unterschied zu den alternativen Medium und High Density Chips lassen sich LD Biochip Assays auch in manueller Arbeitsweise durchführen. Dafür benötigt man lediglich eine Mikropipette oder Mikromultipette, eine Spritzflasche (zum Waschen) sowie unsere preiswerte MultiCam (ein optisches Messsystem mit Digitalkamera). Soll das Chip-Ergebnis nicht nur rein visuell ausgewertet werden, steht entsprechende Software zur Verfügung. Für die LD BioScreen Plattform existiert darüber hinaus ein speziell dafür entwickeltes Gerätesystem. Hierzu zählen Spotter, Washer/Aspirator, Biochip-Halter, Inkubationskammer, Applikationskammer sowie ein Laser- Fluorimeter mit Auswertesoftware. Dieses Gerätesystem stellt eine erhebliche Erleichterung dar und kann wahlweise in unterschiedlichem Umfang einsetzt werden. 2

3 LD BioScreen: Sandwich-Immunoassay auf dem LD Biochip Low Density Biochip A B C D E F G H Der LD Biochip besteht aus Kunststoff und hat die Abmaße eines Objektträgers. Unter dem Logo befindet sich ein Feld für Beschriftungen. Die 32 Spots sind in 4 Spalten (1-4) und 8 Reihen (A-H) angeordnet und entsprechen einem Ausschnitt einer 384-well Mikrotiterplatte. Der Low Density Biochip ist so konzipiert worden, dass darauf Assays wie bisher auf Mikrotiterplatten ausgeführt werden können. Im Vergleich zum Mikrotiterplatten-Assay werden auf dem Low Density Biochip statt der üblichen µl/well nur 2 4 µl/spot an Substanzlösung eingesetzt ein Spotvolumen, was sich auch manuell noch handhaben lässt Optisches Auswertegerät Das Ergebnis des Immuno- oder DNA-Assays auf dem LD Biochip wird mit einem optischen Auswertegerät (Digitalkamera) dokumentiert und in Form eines BMP-files ausgegeben. Ein zusätzliches Auswerteprogramm setzt die Spotfärbungen in numerische Meßsignale um, sogenannte Relative Pixel Units (RPU). Laser Fluorimeter Mit dem Laser Fluorimeter LF 401 der Fa. IOM, Berlin, können LD Biochip Assays mit Fluoreszenz-Detektion gemessen werden. Hierzu gehört eine entsprechende Auswertesoftware. Die Fluoreszenz Färbung der Spots wird in numerischer Form als Relative Light Units (RLU) ausgegeben. 3

4 Sandwich-ELISA Beispiel: IgE-Sandwich-ELISA auf einem Streptavidin LD Biochip Aufbau: Streptavidin-LD Biochip bio-capture-antikörper IgE + Signal-Antikörper-POD TMB Voraussetzung: Vorhandensein des biotinylierten Capture-Antikörpers und des POD-markierten Signal-Antikörpers Kit-Bestandteile: BioTeZ-Basis-LD Biochip präzipitierendes Farbsubstrat Tetramethylbenzidin (TMB), ready-to-use Minimal notwendige Laborausstattung: Vortex-Mixer, Mikropipette oder Mikromultipette für 1 10 µl, Feuchtkammer für Objektträger, optische Auswerteeinheit mit Software Versuchsdurchführung 1 Basis-LD Biochip Beschichtung mit biotinyliertem Capture-Antikörper: 4-fach Bestimmungen bio-anti-human IgE Verdünnung in PBS / 0.1% BSA 50 µg/ml alle Spots 4 µl / Spot Inkubation: 4h / Raumtemperatur, in Feuchtkammer Reaktion mit IgE / Signal-Antikörper-POD Gemisch: Verdünnung in PBS / 0.33% Casein Antigen IgE als Standard 0 / 3.13 / 6.25 / 12.5 / 25 / 100 / 200 ng/ml Signal-AK anti-human IgE-POD 1.5 µg AK/ml Gemisch alle IgE-Verdünnungsstufen jeweils mit Signal-AK 1:1 mischen Reihe A-H, Spalte µl/spot Inkubation: 2 h / Raumtemperatur, in Feuchtkammer, dunkel Nachweis-Reaktion: Messung: Auswertung: präzipitierendes TMB, ready to use 4 µl / Spot Inkubation: 15 min. / Raumtemperatur, in Feuchtkammer, dunkel nass (ohne abzusaugen) mit optischer Auswerteeinheit Datenerfassung mit Software 4

5 Ergebnis: Messwerte: Angaben in RPU Reihe: IgE (ng/ml) Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3 Spalte 4 Mittelwert A B C D E F G H RPU: Relative Pixel Units IgE-Sandwich ELISA: Standard Kurve RPU ,0 3,1 6,3 12, IgE (ng/ml) Zusammenfassung: Die untere Nachweisgrenze liegt bei ca. 10ng IgE/ml. 5

6 Sandwich-FIA (Fluoreszenz Immunoassay) Beispiel: IgE-Sandwich-FIA auf einem Streptavidin LD Biochip Aufbau: Streptavidin-LD Biochip bio-capture-antikörper IgE + Signal-Antikörper-Cy5 TMB Voraussetzung: Vorhandensein des biotinylierten Capture-Antikörpers und des Cy5-markierten Signal-Antikörpers sowie eines Laser-Fluorimeters Kit-Bestandteile: BioTeZ-Streptavidin-LD Biochip Minimal notwendige Laborausstattung: Vortex-Mixer, Mikropipette oder Mikromultipette für 1 10 µl, Feuchtkammer für Objektträger, Laser-Fluorimeter LF 401 [Fa. IOM, Berlin] Versuchsdurchführung 1 Streptavidin-LD Biochip Beschichtung mit biotinyliertem Capture-Antikörper: 4-fach Bestimmungen bio-antihuman IgE Verdünnung in PBS / 0.1% RSA 30 µg/ml alle Spots 4 µl / Spot Inkubation 4 h / Raumtemperatur in Feuchtkammer Reaktion mit IgE / Signal-Antikörper-Cy5 Gemisch: Verdünnung in PBS / 0.33% Casein Antigen IgE als Standard 0 / 25 / 50 / 100 / 200 / 400 / 800 / 1600 ng/ml Signal-AK anti-human IgE Cy5 10 µg AK/ ml Gemisch alle IgE-Verdünnungsstufen jeweils mit Signal-AK 1:1 mischen Reihe A-H, Spalte µl/spot Inkubation 2 h / Raumtemperatur, in Feuchtkammer, dunkel Messung: Auswertung: Laser-Fluorimeter Datenerfassung mit Software 6

7 Ergebnis: Messwerte: Angaben in RLU Reihe: IgE Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3 Spalte 4 Mittelwert (ng/ml) (B) B -Bo A B C D E F G H RLU: Relative Light Units B: Bindungswerte in RLU B-Bo: Bindungswert in RLU abzüglich des Bindungswertes bei IgE = IgE-Sandwich-FIA: Standardkurve B-Bo (RLU) IgE (ng/ml) Zusammenfassung: Die untere Nachweisgrenze liegt bei ca. 75 ng IgE/ml 7

8 Multi Parameter Sandwich ELISA (Sample Profiling) Beispiel: Gleichzeitiger Nachweis von 6 verschiedenen Proteinen in Proben (Serum etc.) Voraussetzung: Vorhandensein von Antikörperpaaren Für jedes Antigen 1 biotinylierter Capture-Antikörper und 1 POD Signal-Antikörper Aufbau: Streptavidin LD Biochip bio-capture-antikörper Probe + POD-markierte Signal- Antikörper TMB Kit-Bestandteile: 10 BioTeZ Streptavidin LD Biochips Präzipitierendes TMB Substrat (Tetramethylbenzidin), ready-to-use Minimal notwendige Laborausstattung: Vortex-Mixer, Mikropipette oder Mikromultipette für 1 10 µl, Kammer für Objektträger, optische Auswerteeinheit mit Software LD Biochip Belegung: Streptavidin LD Biochip mit vorgespotteten Capture-Antikörpern: Reihe Spalte 1 4 biotinylierte Capture-Antikörper A Negativkontrolle 40 µg/ml B Positivkontrolle 0.8 µg/ml C Biotin-Anti-IFN-y 40 µg/ml D Biotin-Anti-TNF-α 40 µg/ml E Biotin-Anti-IgE 40 µg/ml F Biotin-Anti-IL3 40 µg/ml G Biotin-Anti-IL4 40µg/ml H Biotin-Anti-CRP 40 µg/ml 8

9 Versuchsdurchführung 1 Streptavidin LD Biochip Beschichten mit biotinylierten Capture-Antikörpern: 4-fach Bestimmungen biotinylierter Capture-Antikörper (siehe LD Biochip Belegung) 4 µl/spot Inkubation: über Nacht / 4 C, in Feuchtkammer Reaktion mit Antigen / POD Signal-Antikörper Gemisch: A) Antigene (in PBS/ 0.5 % Casein): Puffer - 20 µl IFNg 700 ng/ml 20 µl TNFa 700 ng/ml 20 µl IgE 700 ng/ml 20 µl IL3 700 ng/ml 20 µl IL4 700 ng/ml 20 µl CRP 700 ng/ml 20 µl Mischen aller Antigene Gesamtvolumen: 140 µl B) Signal-Antikörper POD Konjugate (in PBS/ 0.5 % Casein): POD Konjugat als Kontrolle 0.4 µg/ml 20 µl anti-ifng-pod 3.5 µg/ml 20 µl anti-tnfa-pod 2.2 µg/ml 20 µl anti-ige-pod 4.0 µg/ml 20 µl anti-il3-pod 12.0 µg/ml 20 µl anti-il4-pod 40.0 µg/ml 20 µl anti-crp-pod 65.0 µg/ml 20 µl Mischen aller POD Konjugate Gesamtvolumen: 140 µl 100 µl Antigene (A) mit 100 µl POD Konjugate (B) mischen 4 µl Mischung auf alle Spots, Inkubation: 30 min/ Raumtemperatur, in Feuchtkammer (dunkel) Nachweis: Auswertung: präzipitierendes TMB, ready to use 4 µl / Spot Inkubation: 15 min. / Raumtemperatur, in Feuchtkammer (dunkel) nass (ohne abzusaugen), mit optischer Auswerteeinheit Datenerfassung mit BioTeZ Software Ergebnis: Reihe A B C D E F G H Neg. Pos. Kontr. Kontr. IFN-y TNF-α IgE IL3 IL4 CRP Spalte Messwerte in RPU (Relative Pixel Units): Mittelwert C.V. (%)

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