Regulation of Ectodomain Shedding

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1 DISS. ETH No Regulation of Ectodomain Shedding of the LI Cell Adhesion Molecule A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGYZÜRICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by MONIKAHEIZ eidg. dipl. Apothekerin born Citizen of Maur ZH and Glarus accepted on the recommendation of Prof. Dr. P.A. Schubiger,examiner Prof. Dr. E. Sterchi, co-examiner Dr. Ilse Novak-Hofer, co-examiner 2004

2 Summary Ectodomain shedding of tumor-associated proteins can contribute to tumor progression, and the soluble forms of thesemolecules are potential serum tumor markers for diagnosis and therapy monitoring. The LI cell adhesion molecule (LI) can serve in its cell-bound form as a target for radioimmunodiagnosis and therapy of LI expressing tumors. A soluble form of LI was found in the serum of patients with advanced ovarian and endometrial tumors, and Stimulationof cell migration by soluble LI may contribute to metastatic spread in these malignancies. To analyze if LI ectodomain shedding occurs in renal Carcinoma cells and if it is regulated by physiological factors that are relevant in the renal system, we selected Ll-positive renal Carcinoma cells with functional c-met and c-ret reeeptors that responded to the respective growth factors hepatocyte growth factor (HGF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in terms of proliferation and scattering. We showed that HGF, a growth factor that increases invasiveness of renal carcinomas, stimulated LI sheddingfrom the cell surface. In contrast, release of LI was inhibited by GDNF. We found that disruptionof actin assembly by cytochalasin D reduced basal shed ding of LI, indicatingthat associations with the cytoskeleton are involved in LI re lease. To investigate the role of LI cytoskeletal interactions in LI shedding, mutations in cytoskeletal attachment sites were introduced into the LI cytoplasmic part, and ectodomainshedding of LI was analyzed in transiently transfected 293T cells. A mu tant lacking the intracellular domain (Lltrun) showed increased basal LI shedding, indicating regulatory motifs for LI release in the cytoplasmic domain. Deletion of the neuron-speeifie exon 27 (L1E27), a binding site for the ezrin linker protein and a motif for LI endocytosis, did not affect LI shedding. In contrast, in a mutant with an exchangeof tyrosine 1229 to histidine (L1YH) and thus deleted in ankyrin binding, basal shedding was reduced. Mutation of the KGGK sequence to ESCE (L1ESCE), which abolishes interaction of LI with actin stress fibers, also led to reduced shedding. These results indicatethat LI associations with the cytoskeleton regulate ectodomain shedding of LI. HGF was found to stimulate release of LI in all cytoplasmic domain mutants, and co-transfection of a dominant negative form of the small GTPase Rac reduced LI shedding independent of the LI intracellular part. It is thus possible that HGF and Rac share a common pathway leading to LI shedding. In contrast to other reports in the literature we could not find effects of recombi- IV

3 nantly expressed and afnnity-purified soluble LI on cellular functionssuch as attach ment, proliferation, and LI shedding in renal Carcinoma cells. Ectodomain shedding of LI in renal Carcinoma cells may lead to enhanced cell detachmentand migration. Our results indicate that basal shedding of LI is regulated by intracellular motifs that provide associations of LI with the cytoskeleton. HGFstimulated shedding is independent of the LI cytoplasmic domain, indicating that HGF regulates LI release by an alternative pathway. V

4 Zusammenfassung Die Abspaltung der Ektodomänevon tumor-assoziiertenproteinen kann zur Progres sion des Tumors beitragen, und der abgegebene, extrazelluläre Teil des Proteins kann als potentieller Serum-Marker für die Tumordiagnose und das Therapie-Monitoring di enen. Das LI Zelladhäsionsmolekül (LI) wird in seiner zellgebundenen Form für die Radioirnmundiagnostik und -therapie von LI exprimierenden Tumorenbenutzt. Eine lösliche Form von LI wurde im Serum von Patienten mit fortgeschrittenen Eierstockund Gebärmutterkrebsgefunden, wobei die beobachtete Stimulation der Zellmigration durch lösliches LI zur Metastasierung in diesen Tumoren beitragen könnte. Um zu analysieren, ob LI von Nierenkarzinom-Zellen abgespalten wird und ob dieser Vorgang von physiologischen Faktoren reguliert wird, welche im Nierensystem relevant sind, haben wir Ll-positiveNierenkarzinom-Zelllinenmit funktionalenc-met und c-ret Rezeptoren ausgewählt. Bei diesen Zellen rufen die entsprechenden Wachstumsfaktoren hepatocytegrowth factor (HGF) und glial cell line-derived neurotrophicfactor (GDNF) Proliferation und Scatteringhervor. Wir konnten zeigen, dass HGF, ein Wachstums faktor der die Agressivität von Nierenkarzinomen erhöht, die Abgabevon LI von der Zelloberfläche stimuliert. In Kontrast dazu inhibierte GDNF die Abspaltungder LI Ektodomäne. Wir fanden, dass die Zerstörung des Actin-Zytoskelettsdurch Cytochalasin D die Abgabe von LI von der Zelloberfiäche reduzierte. Dies weist darauf hin, dass die As soziation von LI mit dem Zytoskelett und in die extrazelluläre Abspaltungvon LI in Zusammenhang stehen. Um die Rolle der Interaktionen von LI mit dem Zytoskelett und der Abspaltung der Ektodomänezu untersuchen, wurden in den Bindungsstellen für das Zytoskelett im intrazellulären Teil von LI Mutationen eingeführt. Die Abspal tung von LI wurde in transient transferierten 293T Zellen untersucht. Eine Mutante ohne zytoplasmatischen Teil (Lltrun) zeigte einer Erhöhung der basalen Abgabe von LI, was auf regulatorischemotive für die LI Abspaltungim zytoplasmatischen Teil hin weist. Deletion des neuronspezifischenexon 27 (L1E27), welches die Bindungsstellefür das Linkerprotein Ezrin und ein Motif für die Intemalisierung von LI ist, hatte keine Auswirkungen auf die Abspaltung der Ektodomäne. Im Kontrast dazu war die Ab gabe von LI in der Tyrosin 1229 zu Histidin (L1YH) Mutante,welche die Bindung Ankyrin von verhindert,reduziert. Die Mutation der KGGK Sequenzzu ESCE (L1ESCE), welche eine Interaktion von LI mit Actin-Stressfasem verhindert, führte ebenfalls zu einer reduzierter Abgabe von LI. Diese Resultate zeigen, dass die Assoziationen von LI mit dem Zytoskelettdie Abspaltungder Ektodomänevon LI regulieren. VI

5 HGF stimulierte die Abgabe von LI in allen zytoplasmatischen Mutanten, und Co-Transfektion mit einer dominant negativen Form der GTPase Rac reduziertedie Abspaltung von LI unabhänging vom intrazellulären Teil von LI. Es scheint deshalb möglich, dass HGF und Rac über einen gemeinsamen Signalweg die Abgabe von LI beeinflussen. Im Kontrast zu anderen Berichten aus der Literatur konnten wir keinen Effekt von rekombinant exprimiertem und affinitäts-gereinigtem, löslichem LI auf zelluläre Funktionenwie Bindung, Proliferation oder Abgabe von LI in Nierenkarzinomzellen finden. Die Abspaltung der LI Ektodomäne in Nierenkarzinomzellen kann zu erhöhter Zellablösung und Migration führen. Unsere Resultate deuten an, dass die basale Ab gabe von LI durchintrazelluläre Motife reguliert wird, welche Assoziationen von LI mit dem Zytoskelettermöglichen. Die Stimulation der Abgabedurch HGF is unabhängig vom zytoplasmatischen Teil von LI, was darauf hinweist, dass HGF die Abspaltung von LI durch einen anderen Mechanismus hervorruft. VII