PerfectBlue 'Semi-Dry' Electro Blotter / PerfectBlue 'Semi-Dry'-Elektroblotter

Transkript

1 Instruction manual / Bedienungsanleitung PerfectBlue 'Semi-Dry' Electro Blotter / PerfectBlue 'Semi-Dry'-Elektroblotter Sedec S & Sedec M v0314_e+d Creating the future together.

2

3 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter CONTENTS WARRANTY 2 PACKAGING LIST 2 SAFETY PRECAUTIONS 2 SYSTEM OVERVIEW 3 Technical properties 3 GENERAL INSTRUCTIONS 3 Materials required 3 Assembling the gel sandwich 4 Transfer of more than one gel 4 Transfer buffers and transfer times 5 Current settings 5 Factors that affect transfer efficiency 5 Cleaning 5 RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFERS 6 Summary of appropriate transfer conditions 6 Transfer buffers 6 TROUBLESHOOTING 8 TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATION 10 PerfectBlue Semi-Dry Electroblotter 10 Power Supplies 10 Blotting membranes 10 LITERATURE 11 Semi-Dry blotting 11 Electroblotting of proteins 11 Electroblotting of nucleic acids 11 PEQLAB_v0314_E 1

4 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter WARRANTY PEQLAB guarantees that the semi-dry electro blotting system you have received has been thoroughly tested and meets its published specification. However, immediately upon arrival, please check carefully that the shipment is complete and has not been damaged in transit. For missing parts or to report any kind of damage, please contact PEQLAB (see 'TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATIONS'). Please retain all packaging materials until the delivery has been completely checked since this will speed up the return of goods if required and reduce environmental impact. Any form of returns, replacements or credit notes must be agreed in advance by PEQLAB. For the complete range of PerfectBlue electrophoresis and blotting systems, PEQLAB guarantees a warranty period of 36 months if the products have been used solely according to the instruction manual, unless a different warranty has been offered in writing. After the warranty period has expired, PEQLAB can offer repairs. No liability is accepted for loss or damage arising from incorrect use. PEQLAB's liability is limited to the repair or replacement of the unit or refund of the purchase price, at PEQLAB's discretion. PEQLAB is not liable for any consequential damages. PEQLAB reserves the right to alter the technical specifications of the PerfectBlue electrophoresis or blotting systems without prior notice. This will enable us to implement developments as soon as they arise. PACKAGING LIST Unless requested otherwise, the following items are included in shipment for the models Sedec S and Sedec M: one base with platinum-plated titanium anode one safety lid with stainless steel cathode one pair of power cords three screwing knobs for lid fixation one instruction manual SAFETY PRECAUTIONS Please read this Instruction Manual carefully before using the blotting system. Only use a CE marked DC power supply. Always disconnect the system from the power supply before removing the safety lid. Always disconnect the system from the power supply when it is not in use or before moving it. Running conditions for this unit should not exceed the maximum operating voltage or current. Do not use the system if any part is broken. Connect the stainless steel electrode plate of the lid with the negative pole of the power source only. It will corrode otherwise. PEQLAB_v0314_E 2

5 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter SYSTEM OVERVIEW PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotting Systems offer rapid transfer of proteins or nucleic acids from polyacrylamide or agarose gels to membranes. Solid and highly conductive electrode plates made of platinum-plated titanium (anode) or stainless steel (cathode) allow transfer at low voltages without external cooling systems. In addition, they provide an exceptional uniformity of the electrical field and by doing so transfer results of highest quality. The semi-dry Blotter Sedec S has a transfer area of 10 x 10 cm and fits the typical mini gel format. The model Sedec M offers a large transfer area of 20 x 20 cm for the simultaneous transfer of several gels or for the transfer of large gels. Because of its weight, the solid safety lid assures maximal and even electrical contact between electrode plates and blotting sandwich. Its safe fixation is realized fast and comfortably by using three handy and smooth-running screwing knobs. For Semi-Dry Electro Blotting systems Sedec S and Sedec M, the anode plate (positively charged electrode) is located in the base while the cathode plate (negatively charged electrode) is located inside the safety lid. Therefore negatively charged target molecules (usually proteins or nucleic acids) will get transferred top down. Technical properties PerfectBlue Cat. No. Transfer area Buffer volume Current typ. transfer time Sedec S x 10 cm approx. 50 ml* ma min Sedec M x 20 cm approx ml* ma min * for soaking blotting papers and membranes GENERAL INSTRUCTIONS Materials required To begin, prepare buffers, blotting papers and membranes needed for electro blot transfer. Cut filter paper and transfer membrane to match the size of the gel and saturate several sheets of filter paper in transfer buffer(s). Filter paper must be thoroughly saturated with transfer buffer. In general, three sheets of filter paper are used on each side of the stack. The transfer membrane preparation will depend on the type of membrane used. Refer to manufacturer s instructions for this information. In some cases, it is recommended that the gel is soaked in transfer buffer before blotting. Refer to a standard protocol for your specific technique to determine if this is necessary. You will find additional information below 'RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFER' and 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMATION'. PEQLAB_v0314_E 3

6 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter Assembling the gel sandwich The models SEDEC S and SEDEC M Semidry Electro Blotters are configured with the anode on the bottom and the cathode on the top. When assembling the gel sandwich, be sure to place the gel on top of the membrane, as negatively charged molecules will transfer in downward direction. 1. Stack three pieces of cut, presoaked blotting papers (3 mm) in the center of the base of the blotting system without any air bubbles in between. 2. Put a prepared blotting membrane of same size on top of the blotting paper stack. 3. Place the gel on top of the membrane. Remove any air bubbles between gel and membrane but avoid moving the gel once it got in contact with the membrane. 4. A pipette or test tube may be used to roll bubbles out of layers. 5. Finally stack another three pieces of presoaked blotting papers on top. 6. Wipe away any drips on the bottom plate prior to closing the lid - these may cause a short circuit allowing the current to bypass the stack and will cause poor transfer results. Sometimes it might even damage the electrode plates. 7. After the gel sandwich is assembled, the safety lid containing the cathode plate can get closed. 8. Fix the lid using the screwing knobs. The weight of the lid is enough to provide good contact and therefore excessive tightening is NOT required. If the lid is over tightened this may damage the gel, and force buffer out of the filter pads. Once the lid has been placed on top of the transfer sandwich it should not be moved. Any movement could create a smeary transfer, because transfer begins as soon as the membrane is in contact with the gel. 9. Please connect the banana plugs of the blotter to an appropriate power supply using the pair of power cords delivered. The power cords are color coded for the proper orientation of current. Start the transfer by defining the operating conditions (see 'RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFERS'). Transfer of more than one gel Up to four mini gels may be placed side-by-side for simultaneous transfer in the SEDEC M. If transferring more than one gel per apparatus, make sure that the gel sandwiches are the same thickness. Otherwise, the smaller of the two gel sandwiches may not make good contact with the top plate, and transfer will not occur. PEQLAB_v0314_E 4

7 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter Transfer buffers and transfer times Buffers for semidry electric blotting must be low in ionic strength to avoid overheating. See 'Summary of appropriate transfer conditions' for some recommended buffers and running conditions. PEQLAB recommends running blots at constant current settings. Transfer times will vary, depending on the molecule's size, and percentage of the gel and to some extent, the transfer buffer. In general, small molecules transfer faster than larger ones. If transfer times are too long, small proteins (<15 kda) might even pass the membrane if the pore size of the membrane is too large. A study by Tovey & Baldo (1987) showed that protein transfer was generally complete in 1-1/2 to 2 hours. Beyond that point, the buffer becomes depleted, so transferring for additional time will not improve efficiency. For an initial definition of transfer settings see 'RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFER' also. Current settings Semi-dry blots should be performed at low voltage (around 10 V), preferential at constant current settings in order to avoid overheating and fluctuating power readings. For calculating the correct current setting, first determine the area of the gel(s), and then multiply that by the appropriate value for milliamps. In electrophoretic blotting, calculations are made in terms of current density. Proteins are blotted in a range of ma/cm 2 and nucleic acids in the range of ma/cm 2. When transferring a sequencing-sized gel, a setting of about 0.8 ma/cm 2 is appropriate. For example, using one 10 x 10 cm mini gel, the gel area is 10 x 10 = 100 cm 2. If you choose a current setting of 2 ma per cm 2, you would set constant current at 100 cm 2 x 2 = 200 ma. If you transfer more than one gel, add together the areas of the gels. Read your power supply s instructions to assure that the power supply will work at a voltage lower than 10 V. These voltages often occur in semidry blotting. Contact the manufacturer regarding the unit s performance under high current, low voltage conditions if you have any questions. You will find a list of PEQLAB's Power Supplies below 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMATION'. Factors that affect transfer efficiency While general conditions can be described which will result in successful transfer of most molecules, it should be noted that optimal transfer conditions will vary based on the characteristics of the molecule you are working with. Some factors that affect transfer rate and efficiency include molecule size, charge, gel thickness and percentage, and hydrophobicity. The reference list at the end of this booklet provides useful information on how to choose optimal transfer conditions for a specific molecule. If transfer conditions should be optimized, it is useful to stain the gel as well as the membrane using a general staining method (e. g. Coomassie blue or silver staining of protein gels and Ponceau red for proteins on membranes) and to compare the results with an identical gel which has not been blotted. Cleaning The interior of the basis and the lid of the blotter should get cleaned carefully after each use in order to remove any precipitates. Please use paper towels soaked with distilled water for that purpose. Each part should air dry completely before storage. Do not use ethanol or other organic solvents to clean acrylic products, because organic solvents cause acrylic to 'craze' or crack! PEQLAB_v0314_E 5

8 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFERS Summary of appropriate transfer conditions Membrane Transfer buffer Electrical conditions Proteins from polyacrylamide gels Nitrocellulose or PVDF 3 Puffer System or Towbin Buffer constant current 0.8 to 3 ma per cm 2 gel size max. 10 to 14 Volt DNA/RNA from agarose gels Nylon 0.5x- to 1x TBE or 1x TAE or NAQ constant current 0.5 to 3 ma per cm 2 gel size max. 10 to 14 Volt Transfer time 30 minutes to 2 hours 30 minutes to 2 hours Transfer buffers 3 Buffer System (Kyhse-Anderson, 1984) Using this system the transfer will involve an isotachophoretic process, where the proteins are mobilized between a leading ion and a trailing ion. Anode buffer II neutralizes excess protons generated on the surface of the anode plate. Anode buffer I contains Tris at the same ph as anode buffer II, but at a reduced concentration of 25 mm. The cathode buffer contains 6-aminocaproic acid, which serves as the trailing ion during transfer and is depleted from the cathode buffer as it migrates through the gel toward the anode. Blot-assembly: 1. stack 3 blotting papers soaked in anode buffer II inside the center of the blotter's base 2. put 3 blotting papers soaked in anode buffer I on top of the stack 3. put the blotting membrane on top, equilibrated in anode buffer I 4. place the gel on top, shortly (1 min) incubated in cathode buffer 5. finally, stack 3 blotting papers soaked in cathode buffer on top Cathode buffer: 25 mm Tris-HCL, 40 mm 6-aminocaproic acid, 20% (v/v) Methanol, ph 9.4 Anode buffer I: 25 mm Tris-HCl, 20% (v/v) Methanol, ph 10.4 Anode buffer II: 300 mm Tris-HCl, 20% (v/v) Methanol, ph 10.4 Towbin Buffer (Towbin et al., 1979) The most commonly used buffer for protein blotting from polyacrylamide gels is Towbin buffer. However for difficult applications (e. g. transfer of large proteins, extended transfer times) the 3 Buffer System described above will be superior. 1x Towbin buffer: 25 mm Tris-Base, 192 mm Glycine, 20 % (v/v) Methanol, ph 8.3 PEQLAB_v0314_E 6

9 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter NAQ Northern Transfer Buffer (Trnovsky, 1992) For transfer of RNA from agarose gels. With its high buffering capacity and low ionic strength, this buffer is more efficient than TAE, TBE or MOPS. 50x stock solution: 0.2 M Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 50 mm Sodium acetate 5 mm EDTA ph 7.0 NAQ Southern Transfer Buffer For transferring DNA from agarose gels. 50x stock solution 1M Ethanolamine-glycine buffer, ph 11 NAQ Transfer Buffer For transferring nucleic acids from agarose gels. 10x stock solution: 0.8 M Tris-Base 1.18 M Boric acid 24 mm EDTA ph 8.3 TAE (Tris-Acetate-EDTA) Buffer For transferring nucleic acids from agarose gels. 1x working solution: 40 mm Tris-Acetate, 1 mm EDTA 50x stock solution: 242 g Tris-Base 57.1 ml Glacial acetic acid 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) Adjust volume to 1L using distilled H 2 O. TBE (Tris-Borate-EDTA) Buffer: For transferring nucleic acids from agarose gels. 0.5 x working solution: 45 mm Tris-Borate, 1 mm EDTA 5x stock solution 54 g Tris-Base 27.5 g Boric acid 20 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) ad 1 l using H 2 O PEQLAB_v0314_E 7

10 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter TROUBLESHOOTING Problem Cause Solution Transfer efficiency is poor Current is too low Power supply is inappropriate for semidry transfer Transfer time too short Transfer sandwich was assembled in the wrong order The ph of the transfer buffer is too close to the isoelectric point of the protein Too much methanol in the transfer buffer High percentage gels restrict transfer Puddles of buffer were present on the anode allowing the current to bypass the stack The filter paper was too dry The semidry transfer should be performed at constant current. Current density should be between 0.5 and 3 ma/cm 2 of stack surface area. Many power supplies will shut off or blow a fuse when run at the conditions required for semidry transfer. Semidry transfer requires low voltage (often less than 10 V) and high current. Check with the manufacturer of the power supply to determine whether it is appropriate for semidry transfer. Appropriate Power Supplies from PEQLAB are listed below 'TECHNICAL SUP- PORT & ORDERING INFORMATION'. Increase transfer time. The Sedec Semi-dry blotters are configured with the anode on the bottom, and cathode on top. This means a downward transfer is being performed. Follow the instructions carefully when assembling the transfer sandwich. Try a more acidic or basic transfer buffer. Reducing methanol can help elute proteins from the gel, but can reduce binding to nitrocellulose membranes. Higher percentage acrylamide or cross linker can restrict elution of proteins. Use the lowest percentage acrylamide possible to separate your proteins. Always clean up the lower plate before closing the lid of the transfer apparatus. Do not squeeze the stack excessively as this also creates puddles that the current can pass through. Filter paper should be saturated with transfer buffer before adding them to the sandwich. PEQLAB_v0314_E 8

11 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter Problem Cause Solution Smeared or swirled transfer and missing bands Brown coloration of membrane or cracking of gel after transfer Air spaces are interfering with contact between the gel and the membrane Electrophoretic conditions were incorrect or not ideal Transferring at too high a current/temperature Membrane was not thoroughly wetted Roll a test tube or pipette over the gel (make sure it is clean) before putting the rest of the filter paper on the sandwich. Transfer will not occur where the gel is not in contact with the membrane. Running conditions, sample preparation, percentage acrylamide, and many other variables can affect the migration and resolution of proteins. Please review your electrophoresis conditions. Running at constant voltage can cause power fluctuations that will cause overheating. A buffer that has not been made correctly or that has too high in ionic strength can also burn a gel by overheating. A cracked and dry gel often is an indicator of overheating. Always pre-wet the membrane according to the manufacturer s instructions. White spots indicate dry areas of the membrane. Nitrocellulose membranes Insufficient binding of proteins to the membrane PVDF-Membranes Smeared or swirled transfer and missing bands Over-transfer through the membrane Not enough methanol in transfer buffer SDS is preventing binding Membrane was dried out before it was added to the transfer sandwich Alcohol was not used to prewet the membrane Use 0.2 μm pore size nitrocellulose instead of 0.45 μm, or use PVDF with a higher binding capacity. Nitrocellulose binds proteins best when 20 % methanol is used in the transfer buffer. This is especially important for small proteins (<20 kda). Eliminate SDS in the transfer buffer. Membrane should be completely gray and slightly translucent when added to the sandwich. If it has dried out, rewet in methanol and equilibrate in transfer buffer. PVDF is hydrophobic and requires a short soak in methanol prior to transfer. PEQLAB_v0314_E 9

12 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATION For technical questions and more detailed information on PEQLAB s products please visit to find the respective contact person. PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter Item Description Cat. No. Sedec S complete system for gels 10 x 10 cm Sedec M complete system for gels 20 x 20 cm Power Supplies Especially models EV261, EV202 und EV231 are recommended for electro blotting. Do not hesitate to contact us for advice on which Power Supply is most suitable for your application. Item Ports max. Voltage (V) max. Current (ma) Power (W) Cat. No. EV EV222 1) E E V 2) EV EV245 1) EV EV231 1) EV EV265 1) E E V 2) EV EV202 1) EV EV261 1) EV EV215 1) EV EV232 1) EV EV233 1) EV EV262 1) 1) Not available for customers in the US. 2) For a 110 V US version please replace '230V' with '110V' in the ordering number. Blotting membranes 1) Item Pore size Amount Cat. No. Nitrocellulose membrane 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Nylon membrane 0.45 μm 0.30 x 3.0 m PVDF membrane 0.20 μm 0.30 x 3.0 m PVDF membrane 0.20 μm 0.26 x 3.3 m ) Not available for customers in the US. PEQLAB_v0314_E 10

13 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter LITERATURE Semi-Dry blotting Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986) in: Dunn, J.J. (ed.) Electrophoresis 86 VCH Weinheim, pp These authors compare results using different transfer buffers (Towbin buffer vs. the three buffer system). Khyse-Anderson, J. (1984) Electroblotting of multiple gels. A simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Methods 10: This paper describes a the semidry blotter with a 3 buffer system which is effective for transfer of proteins. Electroblotting of proteins Castora, Frank J. (1989) Western Blotting of Proteins, Clinical Biotechnology 1: This review article on Western Blotting gives a good overview of factors such as transfer buffers, types of membranes, and postmembrane stains. Although written for standard tank blotting, much of this is applicable also to semidry blotting. Dunbar, B.S., Ed. (1994) Protein Blotting: A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England. A great guide to blotting techniques, including visualization, immunological techniques, and sequence analysis. Eckerskorn, Christoph and Lottspeich, Friedrich (1993) Structural characterization of blotting membranes and the influence of membrane parameters for electroblotting and subsequent amino acid sequence analysis of proteins, Electrophoresis 14: A useful reference if you plan to do protein sequencing of samples transferred samples. LeGendre, Nancy (1990) Immobilon-P Transfer Membrane: Applications and Utility in Protein Biochemical Analysis, BioTechniques suppl to vol 9: This references deals specifically with transfer conditions using Immobilon-P type membranes. Tovey, E.R. and B.A. Baldo (1987) Comparison of semidry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis 8: This paper discusses quantitative yields of proteins of different molecular weights using different transfer conditions. Towbin J, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: Electroblotting of nucleic acids Trnovsky, Jan (1992) Semidry Electroblotting of DNA and RNA from Agarose and Polyacrylamide Gels, BioTechniques 13: PEQLAB_v0314_E 11

14 Instruction Manual PerfectBlue Semi-Dry Electro Blotter NOTES PEQLAB_v0314_E 12

15 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter INHALT GARANTIE 14 LIEFERUMFANG 14 SICHERHEITSHINWEISE 14 SYSTEMÜBERBLICK 15 Technische Merkmale 15 ALLGEMEINE BEDIENUNGSHINWEISE 15 Benötigte Materialien 15 Aufbau des Gelsandwiches 16 Transfer mehrerer Gele 16 Transferpuffer und Transferzeiten 17 Spannung und Stromstärke 17 Weitere Faktoren, welche die Transfereffizienz beeinflussen 17 Reinigung 17 EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER 18 Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen 18 Transferpuffer 18 TROUBLESHOOTING 20 TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATIONEN 22 PerfectBlue Semi-Dry-Elektroblotter 22 Power Supplies 22 Blotting-Membranen 22 LITERATUR 23 Semi-Dry-Blotting 23 Elektroblotting von Proteinen 23 Blotting von Nukleinsäuren 23 PEQLAB_v0314_D 13

16 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter GARANTIE PEQLAB garantiert, dass das ausgelieferte System genauestens geprüft wurde und den geltenden Anforderungen entspricht. Bitte überprüfen Sie die Lieferung dennoch umgehend nach Erhalt auf Vollständigkeit und eventuelle Transportschäden. Sollte die Lieferung beschädigt oder fehlerhaft sein, wenden Sie sich bitte umgehend an den Technischen Service von PEQLAB oder Ihren PEQLAB-Außendienstmitarbeiter (siehe 'TECHNI- SCHER SERVICE & BESTELLINFORMATIONEN'). Durch die Aufbewahrung des Verpackungsmaterials bis zur vollständigen Prüfung der Lieferung wird die Umwelt geschont und eine evtl. Rückholung beschleunigt. Alle Rücksendungen, Austauschlieferungen und Gutschriften müssen zuvor von PEQLAB freigegeben werden. Auf sämtliche PerfectBlue Elektrophorese- und Blottingsysteme gewährt PEQLAB 36 Monate Garantie, sofern die Systeme ausschließlich der Bedienungsanleitung entsprechend verwendet wurden und keine anderslautende Vereinbarung besteht. Ansprüche auf Ersatz oder Reparatur, die aus einer fehlerhaften Verwendung entstanden sind, werden nicht erfüllt. Die PEQLAB GmbH verpflichtet sich zur Reparatur oder dem Ersatz des Gerätes bzw. der Rückerstattung des Kaufpreises nach ihren Bedingungen. PEQ- LAB haftet nicht für Folgeschäden, die aus der Verwendung des Systems entstanden sind. Nach Ablauf der Garantiezeit können defekte PerfectBlue Elelektrophorese- oder Blotting-Systeme durch PEQLAB kostengünstig repariert werden. Um Neuentwicklungen zeitnah einführen zu können, behält es sich PEQLAB vor, technische Details ohne Vorankündigung zu ändern. LIEFERUMFANG Sofern nicht anders vereinbart bzw. auf dem Lieferschein angegeben, enthält der Lieferumfang der Modelle SEDEC S und SEDEC M folgende Komponenten: eine Basis mit platinumhüllter Titan-Anodenplatte einen Sicherheitsdeckel mit rostfreier Stahl-Kathodenplatte zwei Anschlusskabel drei Schraubknöpfe zum Fixieren des Deckels eine Bedienungsanleitung SICHERHEITSHINWEISE Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgfältig durch, bevor Sie das System in Betrieb nehmen. Verwenden Sie zur Stromversorgung eine CE-konforme Gleichstrom-Spannungsquelle. Trennen Sie das System von der Stromversorgung, bevor Sie den Sicherheitsdeckel entfernen. Trennen Sie das System bei Nichtbenutzung stets von der Stromversorgung. Die für das System definierte maximale Stromstärke und Spannung darf nicht überschritten werden. Sollten Stromkabel oder andere Teile beschädigt sein, darf das System nicht verwendet werden. Verbinden Sie die Edelstahl-Elektrodenplatte ausschließlich mit der Kathode (negativer Pol) der Spannungsquelle, weil sie ansonsten korrodiert. PEQLAB_v0314_D 14

17 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter SYSTEMÜBERBLICK PerfectBlue Semi-Dry Elektroblotter ermöglichen den schnellen Transfer von Proteinen oder Nukleinsäuren aus Polyacrylamid- oder Agarosegelen auf geeignete Membranen. Solide Plattenelektroden aus platinumhülltem Titan (Anode) oder und rostfreiem Edelstahl (Kathode) mit vergoldeten Steckkontakten erlauben aufgrund ihrer hohen elektrischen Leitfähigkeit den effektiven, schnellen und gleichmäßigen Transfer der Zielmoleküle. Während der Semi-Dry Blotter Sedec S mit einer Transferfläche von 10 x 10 cm dem typischen Minigelformat entspricht, erlaubt der Sedec M mit der großen Transferfläche von 20 x 20 cm das gleichzeitige Blotten mehrere Minigele oder das Blotten besonders großer Gele. Der solide Sicherheitsdeckel gewährleistet aufgrund seines Gewichts einen maximalen und gleichmäßigen elektrischen Kontakt zum Blot-Aufbau. Seine sichere Fixierung erfolgt schnell und einfach mit drei handlichen und leichtgängigen Schraubknöpfen. Bei den Semi-Dry Elektroblotter Sedec S und Sedec M befindet sich die Anodenplatte (positive Elektrode) in der Basis und die Kathodenplatte (negative Elektrode) im Deckel, so dass negativ geladenen Zielmoleküle (Proteine und Nukleinsäuren) von oben nach unten wandern werden. Technische Merkmale PerfectBlue Bestell-Nr. Transferfläche Puffervolumen Stromstärke typ. Transferzeit Sedec S x 10 cm ca. 50 ml* ma min Sedec M x 20 cm ca. 200 ml* ma min * zum Tränken der Filterpapiere und Membranen ALLGEMEINE BEDIENUNGSHINWEISE Benötigte Materialien Vor dem Beginn sollten die für den Transfer benötigten Puffer, Filterpapiere und die Transfermembran vorbereitet werden. Filterpapiere und Transfermembran werden auf Gelgröße zugeschnitten und in Transferpuffer äquilibriert/getränkt. Im Allgemeinen werden jeweils 3 Schichten Filterpapier über und unter der Membran bzw. dem Gel gestapelt. Die Vorbereitung der Transfermembran ist abhängig von der verwendeten Art der Membran. Halten Sie sich hierbei an die Anweisungen des Herstellers. In einigen Fällen wird empfohlen, auch das Gel vor dem Blotten in Transferpuffer zu äquilibrieren. Folgen Sie dabei den Anweisungen Ihres Standardprotokolls. Weitere Angaben finden Sie unter 'EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER' und unter 'TECHNISCHER SERVICE & BESTELLIN- FORMATIONEN'. PEQLAB_v0314_D 15

18 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter Aufbau des Gelsandwiches Bei den Semi-Dry Elektroblotter Sedec S und Sedec M befindet sich die Anode (positive Elektrode) in der Basis und die Kathode (negative Elektrode) im Deckel. Achten Sie also darauf, das Gel beim Zusammensetzen des 'Gelsandwiches' über der Membran zu platzieren, da die i. d. R. negativ geladenen Zielmoleküle (Proteine und Nukleinsäuren) von oben nach unten wandern werden! 1. Stapeln Sie 3 Lagen der Gelgröße entsprechend zugeschnittene und mit Transferpuffer getränkte Filterpapiere (3 mm) luftblasenfrei im Zentrum der Blotter-Basis. 2. Legen Sie eine gleichgroße in Transferpuffer äquilibrierte Membran auf die Filterpapiere. 3. Platzieren Sie das Gel luftblasenfrei auf der Membran, möglichst ohne es darauf zu verschieben. 4. Um evtl. eingeschlossene Luftblasen zu entfernen, kann die Membran zuvor noch mit Transferpuffer bedeckt und das Gel vorsichtig z. B. mit einer Pipette auf der Membran glattgestrichen werden. 5. Abschließend werden nochmals 3 mit Transferpuffer getränkte Filterpapiere oben aufgelegt. 6. Überschüssiger Transferpuffer sollte von der Bodenplatte entfernt werden, damit es zu keinem Kurzschluss durch eine sich evtl. bildende Puffersäule nach Aufsetzen des Deckels und Anlegen der Spannung kommt. Der Strom würde dadurch am Gelsandwich vorbeifließen, wodurch die Transferleistung deutlich herabgesetzt würde. Im Extremfall kann ein solcher Kurzschluss außerdem zur Schädigung der Plattenelektroden führen. 7. Ist der Gelsandwich komplett zusammengesetzt, kann der Sicherheitsdeckel mit Kathodenplatte aufgesetzt werden. 8. Fixieren Sie den Deckel durch leichtes Anziehen der 3 Schraubknöpfe. Das Gewicht des Deckels ist für einen guten Kontakt zwischen den Elektrodenplatten und dem Gelsandwich ausreichend. Wird der deckel durch übermäßiges Anziehen der Schraubknöpfe zu stark auf den Gelsandwich gedrückt, kann dieser beschädigt werden und Puffer aus den Filterpapieren gepresst werden. 9. Verbinden Sie nun die Steckkontakte des Blotters entsprechend der Farbkodierung mit den mitgelieferten Anschlusskabeln mit einer geeigneten Spannungsquelle (CE-konformer Gleichstrom-Power- Supply) und legen Sie geeignete elektrische Bedingungen fest (siehe hierzu: 'EMPFOHLENE TRANS- FERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER/Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen'). Transfer mehrerer Gele Im PerfectBlue Semi-Dry Elektroblotter Sedec M können bis zu vier Minigele gleichzeitig nebeneinander geblottet werden. Dabei müssen alle Gelsandwiches gleich dick sein, da dünnere Stapel keinen guten Kontakt zu den Elektroden haben und deshalb dort ein schlechterer Transfer stattfinden wird. PEQLAB_v0314_D 16

19 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter Transferpuffer und Transferzeiten Transferpuffer zur Verwendung in Semi-Dry Elektroblottern dürfen nur niedrige Ionenstärke haben, da das System sonst überhitzt. Unter 'EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER' finden Sie geeignete Transferpuffer und Bedingungen für einen erfolgreichen Transfer. Die Transferzeit hängt von der Größe des Zielmoleküls und der Beschaffenheit des Gels ab, aus welchem es transferiert werden soll. Im Allgemeinen werden kleinere Moleküle schneller transferiert als größere. Zu lange Transferzeiten können zum 'Überblotten', d. h. dem Durchdringen der Membran, vor allem kleiner Proteine (<15 kda) führen, insbesondere wenn die Porengröße der Membran dies unterstützt. Die maximale Dauer eines Semi-Dry-Blots liegt bei ca. 2 h. In der Regel sind nach dieser Zeit die Ionen des Transferpuffers erschöpft, wodurch ein weiteres Blotten keinen weiteren Transfer bewirken kann (Tovey & Baldo, 1987). Spannung und Stromstärke Semi-Dry-Blots sollten bei niedrigen Spannungen (um 10 V), besser aber bei konstanter (begrenzender) Stromstärke durchgeführt werden, um eine Überhitzung des Systems zu vermeiden. Zur Berechnung der richtigen Stromstärke ist die Fläche des Gels ausschlaggebend. Proteine werden in einem Bereich von 0.8 bis 3.0 ma/cm 2 geblottet, Nukleinsäuren mit 0.5 bis 3.0 ma/cm 2. Je größer das Gel, desto eher sollte ein Wert im jeweils unteren Bereich gewählt werden. Beispielrechnung: Für ein 10 x 10 cm großes Minigel beträgt die Gelfläche 10 x 10 = 100 cm 2. Wählt man eine konstante Stromstärke von 2 ma/cm 2 ergibt sich eine Stromstärke von = 200 ma. Sollen mehrere Gele gleichzeitig transferiert werden, addiert man die Gelflächen aller Gele und multipliziert sie mit der entsprechenden Ampèrezahl. Einige Power Supplies haben Probleme, sehr niedrige Voltzahlen aufrecht zu halten. Lesen Sie in der Bedienungsanleitung nach, ob der Power Supply bei Werten unter 10 V arbeiten kann, da diese beim Semi-Dry-Blotting häufig auftreten. Kontaktieren Sie den Hersteller Ihres Power Supplies, wenn Sie Fragen zu den Anwendungs- und Einstellmöglichkeiten Ihres Gerätes haben. Eine Auflistung der PEQLAB erhältlichen Power Supplies, welche für das Semi-Dry-Blotten geeignet sind finden Sie unter 'TECHNI- SCHER SERVICE & BESTELLINFORMATIONEN'. Weitere Faktoren, welche die Transfereffizienz beeinflussen Optimale Transferbedingungen hängen auch von Größe, Art, Hydrophobizität und Ladung des Zielmoleküls sowie der Beschaffenheit des Gels ab. Die am Ende dieser Anleitung aufgeführte Literatur gibt dazu nützliche Informationen. Um Transfereffizienzen zu optimieren, empfiehlt es sich, sowohl das Gel als auch die Membran im Anschluss einer allgemeinen Färbemethode zu unterziehen (für Proteine z. B. Coomassie- oder Silber- Färbung des Gels und Ponceau-Rot-Färbung der Membran) und mit einem identischen, nicht-geblotteten Gel zu vergleichen. Reinigung Das Innere der Blotter-Basis und des Deckels, vor allem die Elektrodenplatten, müssen nach jeder Benutzung gründlich gereinigt werden, um Salzrückstande zu entfernen. Verwenden Sie dazu bitte mit destilliertem Wasser angefeuchtete Tücher. Lassen sie das System anschließend in offenem Zustand vollständig an der Luft trocknen. Zur Reinigung von Acrylglas dürfen weder Ethanol noch sonstige organische Lösungsmittel verwendet werden, da sonst Risse und Sprünge im Material entstehen können! PEQLAB_v0314_D 17

20 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen Membran Transferpuffer elektr. Bedingungen Proteine aus Polyacrylamidgelen Nitrozellulose oder PVDF 3-Puffer-System oder Towbin-Puffer konstante Stromstärke 0.8 bis 3 ma pro cm 2 Gelfläche max. 10 bis 14 Volt DNA/RNA aus Agarosegelen Nylon 0.5x- bis 1x TBE oder 1x TAE oder NAQ konstante Stromstärke 0.5 bis 3 ma pro cm 2 Gelfläche max. 10 bis 14 Volt Transferzeit 30 Minuten bis 2 Stunden 30 Minuten bis max. 2 Stunden Transferpuffer 3-Puffer-System (Kyhse-Anderson, 1984) Hier findet der Protein-Transfer in Form einer Isotachophorese statt, bei der die Proteine zwischen einem Leit-Ion und einem Folge-Ion wandern. Anodenpuffer II neutralisiert überschüssige Protonen, welche auf der Anodenoberfläche entstehen. Anodenpuffer I enthält eine deutlich geringere Tris-Konzentration als Anodenpuffer II bei gleichem ph. Der Kathodenpuffer schließlich stellt das Leit-Ion in Form von Capronsäure zur Verfügung. Das Ergebnis sind vollständige, homogene Transfers und scharfe Banden. Blot-Aufbau: 1. Legen Sie 3 mit Anoden-Puffer II getränkte Filterpapiere auf die Anode in der Blotter-Basis. 2. Legen Sie darauf 3 mit Anoden-Puffer I getränkte Filterpapiere. 3. Legen Sie darauf die mit Anoden-Puffer I äquilibrierte Blotting-Membran. 4. Platzieren Sie darauf das kurz (ca. 1 min) in Kathoden-Puffer inkubierte Gel. 5. Legen Sie abschließend 3 mit Kathoden-Puffer getränkte Filterpapiere auf. Kathoden-Puffer: 25 mm Tris-HCL, 40 mm 6-Aminocapron(Aminohexan)-Säure, 20% (v/v) Methanol, ph 9.4 Anoden-Puffer I: 25 mm Tris-HCl, 20% (v/v) Methanol, ph 10.4 Anoden Puffer II: 300 mm Tris-HCl, 20% (v/v) Methanol, ph 10.4 Towbin Puffer (Towbin et al., 1979) Dieser weitverbreitete Protein-Transferpuffer eignet sich für die meisten Standardanwendungen. Sind allerdings lange Blotting-Zeiten für den vollständigen Transfer des Zielmoleküls nötig (große Proteine) kann es aufgrund der geringen Puffermengen, welche beim Semi-Dry-Blotting eingesetzt werden, zu einer vorzeitigen Depletion der Ionen und somit zum Stillstand des Elektrotransfers kommen. In solchen Fällen ist das '3-Puffer-System' (siehe oben) zu bevorzugen. 1x Towbin-Puffer: 25 mm Tris, 192 mm Glycin, 20 % (v/v) Methanol, ph 8.3 PEQLAB_v0314_D 18

21 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter NAQ Northern Transferpuffer (Trnovsky, 1992) Ideal für den Transfer von RNA aus Agarosegelen. Durch die hohe Pufferkapazität bei gleichzeitig geringer Ionenstärke ist dieser Puffer besser geeignet als TAE, TBE oder MOPS. 50x Stammlösung: 0.2 M Morpholinopropanesulfonsäure (MOPS) 50 mm Natriumacetat 5 mm EDTA ph 7.0 NAQ Southern Transferpuffer Für den Transfer von DNA aus Agarosegelen. 50x Stammlösung 1M Ethanolamin-Glycin Puffer, ph 11 NAQ Transferpuffer Für den Transfer von Nukleinsäuren aus Agarosegelen. 10x Stammlösung: 0.8 M Tris 1.18 M Borat 24 mm EDTA ph 8.3 TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer Für den Transfer von Nukleinsäuren aus Agarosegelen. 1x Arbeitslösung: 40 mm Tris-Acetat, 1 mm EDTA 50x Stammlösung: 242 g Tris 57.1 ml Eisessig 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) mit H 2 O auf 1 l auffüllen TBE (Tris-Borat-EDTA) Puffer: Für den Transfer von Nukleinsäuren aus Agarosegelen. 0.5 x Arbeitslösung: 45 mm Tris-Borat, 1 mm EDTA 5x Stammlösung 54 g Tris 27.5 g Borsäure 20 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) mit H 2 O auf 1 l auffüllen PEQLAB_v0314_D 19

22 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter TROUBLESHOOTING Problem Ursache Lösung geringe Transfereffizienz Stromstärke ist zu niedrig Der verwendete Power Supply ist für Semi-Dry Blotting ungeeignet Transferzeit zu kurz Transfersandwich wurde in falscher Abfolge zusammengesetzt Der ph-wert des Transferpuffers liegt zu nahe am isoelektrischen Punkt des Proteins Zuviel Methanol im Transferpuffer Hochprozentige Gele verhindern einen Transfer der Moleküle Befinden sich Tropfen oder größere Puffermengen auf der Anode, kann der Strom am Gelsandwich vorbei von der Kathode zur Anode fließen. Das Filterpapier war zu trocken. Semi-Dry-Transfers sollten bei konstanter Stromstärke durchgeführt werden. Die Stromstärke sollte zwischen 0.5 und 3.0 ma pro cm 2 Gelfläche liegen. Viele Power Supplies sind für die Bedingungen beim Semi-Dry-Blotting nicht ausgelegt und schalten sich ab. Beim Semi-Dry-Blotting treten niedrige Spannungen (oft unter 10 V) und hohe Stromstärken auf. Prüfen Sie in der Anleitung Ihres Power Supplies, ob dieser für solche Bedingungen geeignet ist. Geeignete Power Supplies finden Sie unter 'TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATIONEN'. Verlängern Sie die Transferzeit. Bei den Sedec Elektroblotter befindet sich die Anode in der Basis, die Kathode im Deckel. Somit erfolgt der Transfer 'von oben nach unten'. Halten Sie sich beim Zusammenbau des Gelsandwiches genau an die Anweisung. Verringern oder erhöhen Sie den ph-wert des Transfer-Puffers entsprechend. Reduzieren der Methanolmenge unterstützt die Elution der Proteine aus dem Gel, kann jedoch deren Bindung an Nitrozellulosemembranen verschlechtern. Höherprozentiges Acrylamid- oder Crosslinker können die Elution der Proteine aus den Gelen verhindern. Verwenden Sie für die Auftrennung der Proteine ein möglichst niedrig-konzentriertes Gel. Trocknen Sie die untere Elektrodenplatte immer sorgfältig, bevor Sie den Deckel aufsetzen. Drücken Sie nicht zu fest auf den Stapel, um ein Ausquetschen von Puffer aus den Filterpapieren zu vermeiden. Die Filterpapiere sollten immer ganz mit Transferpuffer gesättigt sein, bevor sie in den Gelsandwich gestapelt werden. PEQLAB_v0314_D 20

23 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter Problem Ursache Lösung Verschmierter oder verwirbelter Transfer sowie fehlende Banden Braunfärbung der Membran oder Reißen des Gels nach dem Transfer Luftblasen verhindern vollständigen Kontakt zwischen Gel und Membran Die elektrophoretischen Bedingungen waren nicht ideal Überhöhte Wärmeentwicklung Membran war nicht vollständig angefeuchtet Luftblasen zwischen Gel und Membran können mit einer Pipette vorsichtig herausgerollt werden, bevor die Filterpapiere obenauf gelegt werden. Dort wo sich Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran befinden, findet kein Transfer statt. Laufbedingungen, Probenvorbereitung, passende Acrylamidkonzentration des Gels und viele andere Variablen können die Laufeigenschaften und Auftrennungen der Moleküle beeinflussen. Überdenken Sie noch einmal alle Faktoren auch des dem Blot vorangegangen Experiments. Siehe Kapitel 'Spannung und Stromstärke'. Einstellen einer konstanten Spannung führt zu Stromschwankungen, die ein Überhitzen zur Folge haben können. Nicht korrekt angesetzte Puffer oder solche mit zu hoher Ionenstärke können das Gel ebenso 'verbrennen'. Ein gerissenes und ausgetrocknetes Gel ist oft ein Zeichen für Überhitzung. Die Membran muss immer den Herstellerangaben entsprechend äquilibriert und angefeuchtet werden. Weiße Flecken deuten auf trockene Stellen hin. Nitrozellulosemembranen Ungenügende Bindung der Proteine an die Membran PVDF-Membranen Verschmierter oder verwirbelter Transfer sowie fehlende Banden Protein wandert durch die Membran hindurch Zu wenig Methanol im Transferpuffer SDS verringert die Bindung Membran war vor dem Stapeln in den Gelsandwich bereits ausgetrocknet Membran wurde nicht in Methanol angefeuchtet Verwenden Sie Nitrozellulose mit einer Porengröße von 0.2 μm statt 0.45 μm oder verwenden Sie PVDF mit höherer Bindekapazität. Nitrozellulose hat die besten Bindeeigenschaften, wenn 20 % Methanol im Transferpuffer enthalten sind. Speziell für kleinere Proteine (<20 kda) ist die Verbesserung der Bindungseigenschaft durch Zugabe von Methanol von Bedeutung. Verwenden Sie Transferpuffer ohne SDS. Die Membran sollte komplett grau und leicht durchscheinend sein, wenn sie auf die Filterpapiere gelegt wird. Sollte sie bereits ausgetrocknet sein, muss sie mit Methanol wieder angefeuchtet und in Transferpuffer äquilibriert werden. PVDF ist hydrophob und erfordert eine kurze Äquilibrierung in Methanol vor dem Transfer. PEQLAB_v0314_D 21

24 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATIONEN Bei technischen Fragen kontaktieren Sie uns bitte unter +49 (0) oder per an Ausführliche Informationen zu unseren Produkten finden Sie in unserem aktuellen Produktkatalog, den wir Ihnen auf Wunsch gerne zusenden oder unter PerfectBlue Semi-Dry-Elektroblotter Artikel Beschreibung Bestell-Nr. Sedec S vollständiges System für Gele 10 x 10 cm Sedec M vollständiges System für Gele 20 x 20 cm Power Supplies Für das Blotten von Proteinen sind insbesondere die Modelle EV261, EV202 und EV231 geeignet. Bei Bedarf beraten wir Sie gerne ausführlich, welcher Power Supply für Ihre Anwendung geeignet ist. Artikel Anschlusspaare Max. Spannung (V) Stromstärke (ma) Leistung (W) Bestell-Nr. EV EV222 1) E E V 2) EV EV245 1) EV EV231 1) EV EV265 1) E E V 2) EV EV202 1) EV EV261 1) EV EV215 1) EV EV232 1) EV EV233 1) EV EV262 1) 1) Nicht verfügbar für Kunden in den USA. 2) Für eine 110V US-Variante ersetzen Sie bitte '230V' mit '110V' in der Bestell-Nummer. Blotting-Membranen 1) Artikel Porendurchmesser Menge Bestell-Nr. Nitrozellulose-Membran 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Rolle Nylon-Membran 0.45 μm 0.30 x 3.0 m Rolle PVDF-Membran 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Rolle PVDF-Membran 0.20 μm 0.26 x 3.3 m Rolle ) Nicht verfügbar für Kunden in den USA. PEQLAB_v0314_D 22

25 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter LITERATUR Semi-Dry-Blotting Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986) in: Dunn, J.J. (ed.) Electrophoresis 86 VCH Weinheim, pp Die Autoren vergleichen Ergebnisse bei der Verwendung unterschiedlicher Puffersysteme (Towbin Puffer vs. 3-Puffer-System). Khyse-Anderson, J. (1984) Electroblotting of multiple gels. A simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Methods 10: Diese Veröffentlichung beschreibt das Semi-Dry Blotting mit einem 3-Puffer-System, welches effizient Proteine transferieren kann. Elektroblotting von Proteinen Castora, Frank J. (1989) Western Blotting of Proteins, Clinical Biotechnology 1: Dieser Review über gibt einen guten Überblick über Transferpuffer, Membransorten und Färbemethoden. Obwohl dieser Artikel zum Thema 'Tank-Blotten' geschrieben wurde, sind viele Einzelheiten auch für das Semi-Dry-Blotting anwendbar. Dunbar, B.S., Ed. (1994) Protein Blotting: A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England. Eine ausgezeichnete Hilfestellung zum Thema Blotting-Techniken, Auswertung und Sichtbarmachung, immunologischen Techniken und Sequenzanalysen. Eckerskorn, Christoph and Lottspeich, Friedrich (1993) Structural characterization of blotting membranes and the influence of membrane parameters for electroblotting and subsequent amino acid sequence analysis of proteins, Electrophoresis 14: Eine hilfreiche Referenz, wenn die Proteine nach dem Blotten sequenziert werden sollen. LeGendre, Nancy (1990) Immobilon-P Transfer Membrane: Applications and Utility in Protein Biochemical Analysis, BioTechniques suppl to vol 9: Dieser Artikel gibt wertvolle Hinweise zu Transferbedingungen bei der Verwendung von Immobilon-P-artigen Membranen. Tovey, E.R. and B.A. Baldo (1987) Comparison of semidry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis 8: Hier wird die quantitative Ausbeute von Proteinen unterschiedlichen Molekulargewichts bei der Anwendung unterschiedlicher Transferbedingungen diskutiert. Towbin J, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: Blotting von Nukleinsäuren Trnovsky, Jan (1992) Semidry Electroblotting of DNA and RNA from Agarose and Polyacrylamide Gels, BioTechniques 13: PEQLAB_v0314_D 23

26 Bedienungsanleitung PerfectBlue TM 'Semi-Dry'-Elektroblotter NOTIZEN PEQLAB_v0314_D 24

27

28 D AT UK USA PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Freecall (D): , PEQLAB Biotechnologie GmbH, 6404 Polling, Tel: +43 (0) , PEQLAB Ltd., Southampton SO31 7ZN, Freephone (UK): , PEQLAB LLC, Wilmington, DE 19810, Toll-Free (US): , Creating the future together.