Prof. Dr. Peter C. Dartsch

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1 - 1 - Dartsch Scientific GmbH Oskar-von-Miller-Str. 10 D Schongau RINGANA Kosmetik GmbH Schloss Hartberg Herrengasse 1 A-8230 Hartberg Dartsch Scientific GmbH Institut für zellbiologische Testsysteme Oskar-von-Miller-Straße 10 D Schongau Fon +49 (0) Fax +49 (0) info@dartsch-scientific.com Internet 4. Oktober 2011 Testbericht und Fachinformation für Angehörige von Heilberufen Tierversuchsfreie zellbiologische Untersuchungen zu antioxidativen Wirkeffekten von Zusammenfassung Mit tierversuchsfreien zellbiologischen Testmethoden wurde auf seine förderlichen Wirkeffekte untersucht. Die Testergebnisse zeigen, dass die synergetische Wirkstoffkombination in RINGANA CAPS move die schädigende Wirkung von endogen gebildeten Radikalen, wie sie beispielsweise im Gewebe und in Gelenken bei Entzündungs- oder komplizierten Wundheilungsprozessen auftreten können, dosisabhängig nahezu vollständig reduziert. Dadurch können Gelenkprobleme in vivo, welche auf Entzündungsprozessen basieren, verbessert werden. steigert zudem die Stoffwechselaktivität von kultivierten Knorpelzellen des Menschen im relevanten Konzentrationsbereich um ca. 35%. Daraus kann in vivo eine vermehrte Bildung von Kollagen und extrazellulärer Matrix resultieren, welche die Beweglichkeit der Gelenke verbessert und Gelenkschmerzen reduziert. Die Einnahme von kann anhand der Versuchsergebnisse bestens bei Gelenkproblemen empfohlen werden und zur Förderung des allgemeinen Wohlbefindens beitragen. Schongau, den 4. Oktober 2011 Prof. Dr. Peter C. Dartsch

2 - 2-1 Produktauslobung: Die konzentrierte, ausgewogene Nahrungsergänzung zur Unterstützung der Regeneration von Gelenken und Knorpeln. Durch Bewegungsmangel, Nikotin, Alkohol, falsche Ernährung und mangelhafte Versorgung mit wichtigen Vitaminen und Mineralstoffen werden die Knochen schneller porös und die Gelenke unbeweglich. In den CAPS move steckt ein wahres Kraftpaket an hocheffizienten Essenzen, die dem Körper wieder auf die Sprünge helfen! 35 exklusive Ingredienzien - darunter der besonders wirksame Weihrauchextrakt - sorgen für eine Stärkung der Knochen und Gelenke und unterstützen diese bei Bewegung und Sport. Gemeinsam mit dem wertvollen antioxidativen Basiskomplex ist diese einzigartige Rezeptur ein wahres Wellnessprogramm für Gelenke und Knorpel! Inhaltsstoffe: 35 wertvolle Wirkstoffe, u.a. Weihrauchextrakt, Mangosteen-, Papaya und Yuccawurzel-Extrakte, Teufelskrallenextrakt sowie ein spezieller Basiskomplex, welcher in erster Linie aus Polyphenolen verschiedener Pflanzenextrakte besteht. Polyphenole sind bioaktive aromatische Verbindungen, die in Pflanzen als Farbstoffe, Geschmackstoffe oder Gerbstoffe vorkommen. Sie wirken stark antioxidativ, d.h. sie sind in der Lage, freie reaktive Sauerstoffradikale wie sie beispielsweise bei oxidativem Stress vorkommen zu neutralisieren und so unschädlich zu machen. 2 Fragestellungen der durchgeführten Untersuchungen Kann endogene und lokal im Gewebe gebildete überschüssige Sauerstoffradikale inaktivieren? Ein solcher Radikalüberschuss direkt im Gewebe kann bei Entzündungsprozessen (z.b. Arthritis) oder komplizierten Wundheilungen durch die aus dem Blut eingewanderten neutrophilen Granulozyten als entzündungsvermittelnde Zellen hervorgerufen werden.

3 - 3 - Kann den Energiestoffwechsel von kultivierten humanen Knorpelzellen stimulieren und so zumindest teilweise durch die vermehrte Synthese von Kollagen und extrazellulärer Matrix einen Knorpelverlust und die damit verbundenen Schmerzen und Unbeweglichkeit der Gelenke ausgleichen? Bei Arthrose kommt es durch Verschleiß, Alterung, Fehl- oder Nichtgebrauch zu einer Verstärkung der natürlichen Abnutzung. Durch den allmählichen Verlust des Knorpels, der beim Erwachsenen nicht mehr erneuerbar ist, können so dauerhaft Entzündungen und Schmerzen entstehen. 3 Dosierung und Blutflüssigkeitskonzentration Um in den hier durchgeführten tierversuchsfreien zellbiologischen Untersuchungen die Testkonzentration von abschätzen zu können, wurde von den folgenden Überlegungen ausgegangen: Die empfohlene Tagesdosierung für RINGANA CAPS move beträgt während der ersten 1 bis 3 Monate der Einnahme 6 Kapseln täglich (entsprechend 2,4 g); die Erhaltungsdosis bei Langzeiteinnahme 3 Kapseln täglich (entsprechend 1,2 g). Diese Tagesdosis verteilt sich bei einer angenommenen vollständigen Wirkstoffresorption in ca. 6 Litern Blut. Davon entfallen 3,3 Liter auf die Blutflüssigkeit; das restliche Volumen beinhaltet die korpuskulären Bestandteile wie Blutkörperchen etc. Somit verteilen sich 2,4 g (bzw. 1,2 g) Wirkstoffe auf 3,3 Litern Blutflüssigkeit, was einer Blutflüssigkeitskonzentration im ersten Einnahmequartal von 0,75 mg/ml oder 750 µg/ml entspricht. Die am stärksten konzentrierte wässrige Stammlösung/Wirkstoffsuspension wurde mit einer Konzentration von 100 mg/ml durch Mörsern hergestellt und dann entsprechend weiter verdünnt. Die Untersuchungen wurden im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 5 bzw. 10 mg/ml durchgeführt. Dabei bezeichnet die Konzentration 0 die unbehandelte Kontrolle ohne Wirkstoff. 4 Antioxidative Wirkung bei einem lokalen Überschuss körpereigener (endogener) Sauerstoffradikale Hintergrund: Ohne Sauerstoff können wir nicht leben, aber Sauerstoff in Form von hochreaktiven freien Sauerstoffradikalen (ROS = reactive oxygen species) kann pathophysiologische Veränderungen bewirken und auch den vorzeitigen Alterungsprozess fördern. Freie Radikale werden als natürliche Stoffwechselprodukte permanent in unserem Körper produziert und erfüllen grundsätzlich lebenswichtige Aufgaben. Umweltbelastungen, Ernährungsmängel, körperlicher oder seelischer Stress, aber auch Medikamente, Verletzungen

4 - 4 - und Entzündungen können zu einer unkontrollierten Überproduktion freier Radikale führen. Die Selbstregulation durch den Körper ist gestört. Übersteigt die Aufnahme oder Bildung freier Radikale deren körpereigene Entgiftung, so spricht man von oxidativem Stress. Die schnell und aggressiv wirkenden freien Radikale stören und zerstören wichtige Funktionen und Strukturen im Körper; sie können oxidative Veränderungen verursachen und damit Schädigungen und Fehlfunktionen aller wichtigen Biomoleküle wie Nukleinsäuren (DNA und RNA), Proteine, Lipide und Kohlenhydrate. Versuchsdurchführung: Humane Promyelozyten (Zelllinie HL60, ECACC ) wurden als permanente Zelllinie in Routinekultur durch sechstägige Behandlung mit Dimethylsulfoxid zu sog. funktionalen Neutrophilen differenziert. Dies sind Zellen, welche die Eigenschaften von phagozytierenden und entzündungsvermittelnden Zellen (neutrophile Granulozyten) im Blut besitzen. Nach Stimulation bilden diese Zellen in einem sog. oxidativen oder respiratorischen Burst Superoxidanion-Radikale, welche das Gewebe lokal zerstören können. Ein solcher Burst stellt nach der Einwanderung dieser Zellen aus dem Blut ins betroffenene Gewebe einen Teilaspekt des komplexen Entzündungsprozesses dar und kann durch die weitere Gewebezerstörung diesen Prozess dauerhaft in Gang halten. Die funktionalen Neutrophilen wurden durch Zugabe eines Phorbolesters (Phorbol-12- myristat-13-acetat; Sigma-Chemie, Taufkirchen) dazu angeregt, Superoxidanion-Radikale zu bilden. Die Radikale führen zu einer Spaltung des ebenfalls dem Versuchsansatz zugesetzten Tetrazoliumfarbstoffes WST-1. Dabei ist die Menge der gebildeten Sauerstoffradikale direkt proportional zur Farbstoffspaltung, d.h. je mehr reaktive Radikale vorhanden sind, desto stärker ist die Farbstoffspaltung und damit auch die Änderung der optischen Dichte. Werden die von den Zellen gebildeten Radikale durch den Wirkstoff inaktiviert, so verändert sich die optische Dichte weniger stark. Es wurde die optische Dichte als Differenzmessung OD = nm kontinuierlich aufgezeichnet und nach linearer Regression der erhaltenen Kurvenzüge in Form der Steigung in mod/min ausgewertet. Die erhaltenen Ergebnisse wurden dann als Relativwerte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dargestellt und gegen die Konzentration aufgetragen. Eine schematische Darstellung der Vorgehensweise ist zum besseren Verständnis in Abb. 1 dargestellt. Ergebnis: inaktivierte die endogen gebildeten Sauerstoffradikale in einer dosisabhängigen Weise bis zur nahezu vollständigen Neutralisierung bei der maximalen Testkonzentration von 5 mg/ml ( Abb. 2). Bereits ab einer Konzentration von 0,25 mg/ml und damit deutlich unterhalb der theoretisch berechneten Blutflüssigkeitskonzentration wurde eine statistisch signifikante Inaktivierung der endogen gebildeten Radikale erzielt. Im Bereich der berechneten Blutflüssigkeitskonzentration betrug die Wirksamkit zur Inaktivierung etwa 65% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. In einem weiteren Serie von Experimenten mit den funktionalen Neutrophilen wurde auch die Stoffwechselaktivität der Zellen untersucht und dem Potenzial zur Inaktivierung der Radikale gegenüber ge-

5 - 5 - stellt. Dabei zeigte sich, dass die Wirkstoffe von die Bildung der Radikale durch diese entzündungsvermittelnden Zellen zu etwa 90 bis 95% hemmen (Abb. 3). Funktionaler neutrophiler Granulozyt, welcher durch chemische Differenzierung aus einer Zellkultur mit Promyelozyten (Zelllinie HL60) erhalten wird. Stimulation durch einen Phorbolester Bildung von Superoxidanion-Radikalen durch einen oxidativen oder respiratorischen Burst Wirkstoffe, welche endogen gebildete Radikale entgiften Spaltung des roten Farbstoffes unter Bildung einer gelben wasserlöslichen Verbindung Kontinuierliche Messung der optischen Dichte als Differenzmessung nm Abb. 1: Schematische Darstellung zur Differenzierung von Promyelozyten zu funktionalen Neutrophilen, welche bei der Entstehung von entzündlichen Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Nähere Erläuterungen im Text.

6 - 6 - Optische Dichte nm in OD 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Kontrolle 0,25 mg/ml 1 mg/ml 5 mg/ml Inaktivierung endogener Radikale vs. Kontrolle in % vollständige Inaktivierung BF 0, Reaktionszeit in min 0 0 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 Testkonzentration in mg/ml Abb. 2: Dosisabhängige Inaktivierung von endogenen Sauerstoffradikalen durch RINGA- NA CAPS move. Auf der linken Seite ist repräsentativ ein Teil der direkten absoluten Messwerte in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration aufgetragen und auf der rechten Seite die prozentuale Inaktivierung der Radikale im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus jeweils drei Messungen. BF = Berechnete Konzentration in der Blutflüssigkeit nach vollständiger Resorption. Inaktivierung der Radikale.. (einzelne Anteile in %) vollständige Inaktivierung der Radikale 0 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 Testkonzentration in mg/ml Neutralisierung freier Radikale Hemmung der Radikalbildung Abb. 3: Nachweis, dass es durch die Wirkstoffe in in erster Linie zu einer Hemmung der Radikalbildung durch die entzündungsvermittelnden Zellen (funktionale Neutrophile) kommt (gelbe Säulen).

7 -7-5 Wirkung auf den Energiestoffwechsel von kultivierten Knorpelzellen des Menschen Hintergrund: Bei Arthrose kommt es durch Verschleiß, Alterung, Fehl- oder Nichtgebrauch zu einer Verstärkung der natürlichen Abnutzung. Durch den allmählichen Verlust des Knorpels, der beim Erwachsenen nicht mehr erneuerbar ist, können so dauerhaft Entzündungen und Schmerzen entstehen. Durch die Untersuchungen mit humanen primären Knorpelzellen sollte der Frage nachgegangen werden, ob den Energiestoffwechsel dieser Zellen stimulieren und so möglicherweise durch die vermehrte Synthese von Kollagen und extrazellulärer Matrix einen Knorpelverlust ausgleichen kann. Versuchsdurchführung: Isolierte Knorpelzellen des Menschen (Promocell GmbH, Heidelberg, Abb. 4) wurden in einer Dichte von Zellen/Vertiefung in 96-Loch-Platten ausgesät. Nach 3 Tagen, welche die Zellen zur Adhäsion und zur Normalisierung ihres Stoffwechsels brauchen, wurden sie durch die Zugabe von Phosphatpuffer mit 10 mm Glucose stimuliert und die verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen von RINGANA CAPS move zugesetzt. Der Energiestoffwechsel mit seinen verschiedenen Redoxprozessen führt dabei zu einer Spaltung und in der Folge zu einer Änderung der optischen Dichte des ebenfalls zum Ansatz zugegebenen Tetrazoliumfarbstoffes WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim). Dessen optische Dichte wurde als Differenzmessung OD = nm kontinuierlich für 180 min aufgezeichnet und nach linearer Regression der erhaltenen Kurvenzüge in Form der Steigung (30-90 min) in mod/min ausgewertet. Abb. 4: Knorpelzellen (Chondrozyten) des Menschen in Kultur. Auf der linken Seite ist eine Kultur einen Tag nach der Aussaat und auf der rechten Seite nach einer Woche abgebildet. Die rundlichen Strukturen sind Zellen, die sich gerade teilen. Olympus IX50 Inversmikroskop mit Olympus E-10 Digitalkamera. Phasenkontrast-Verfahren. Dartsch Scientific GmbH Oskar-von-Miller-Straße 10 D Schongau Geschäftsführer: Prof. Dr. rer. nat. Peter C. Dartsch Diplom-Biochemiker Amtsgericht München HRB Steuer-Nr. 119/124/10155 USt-IdNr. DE KSK Freudenstadt BLZ Kto-Nr

8 - 8 - Ergebnis: Wie aus Abb. 5 ersichtlich, bewirkte bereits bei der niedrigsten Testkonzentration von 0,1 mg/ml eine mehr als 35%ige Steigerung des Energiestoffwechsels der Knorpelzellen. Diese Stimulation blieb auf etwa diesem Niveau bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml und nahm dann langsam ab. Dennoch betrug die Stimulation bei der höchsten Testkonzentration von 5 mg/ml noch annähernd 20%. Dieses Ergebnis zeigt, dass im Konzentrationsbereich, welcher für die in vivo-situation relevant ist, den Stoffwechsel und damit die Aktivität von kultivierten Knorpelzellen stimuliert. Dies wiederum kann zu einer vermehrten Synthese von Kollagen und extrazellulärer Matrix in vivo führen. 50 Stimulation des Energiestoffwechsels.. vs. unbehandelte Kontrolle in % BF 0 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 Testkonzentration in mg/ml Abb. 5: Stimulation des Energiestoffwechsels von kultivierten Knorpelzellen des Menschen. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus jeweils drei Messungen. BF = Berechnete Konzentration in der Blutflüssigkeit nach vollständiger Resorption.