Deutschen Gesellschaft für Immungenetik

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1 Infus Ther Transfus Med 2002;29: Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immungenetik Frankfurt/M., September 2001 Abstracts Gast Herausgeber C. Seidl, Frankfurt/M. G. Holzberger, Kassel Basel Freiburg Paris London New York New Delhi Bangkok Singapore Tokyo Sydney

2 Contents Inhalt DGI Best Abstract Scientific Award Opening Lecture: HLA Matching in Hematopoietic Stem Cell Transplantation Plenary Sessions V1 HLA and Transplantation V2 Gene Regulation and Autoimmunity V3 Immunotherapy V4 HLA/NK and Non-Classical HLA Molecules Technicians-Workshop: Molecular Typing Techniques, Antibody Screening, Cross-Match Lectures A1 Transplantation A2 Autoimmunity, Gene Regulation A3 Genetics, Anthropology A4 Immunotherapy, Non-Classical HLA Molecules Poster Session Infus Ther Transfus Med 2002;29:77 96 Abstracts

3 DGI Best Abstract Scientific Award 2001 Linkage disequilibrium between a base pair echange in exon 8 of the 21-hydroxylase B gene (318Gln 318Stop) with HLA-B and HLA-DR E. Keller, I. Zöbisch, E. Kleinschmidt, S. Scholz, R. Zahn, E.D. Albert Labor für Immungenetik, Kinder-& Kinderpoliklinik, LMU München, Germany We performed mutation analysis by SSO and RFLP in 258 families with at least 1 index patient with 21OHD and we will focus here on one of the 12 most frequent 21OHB mutations tested: 318Gln 318Stop, exon 8, codon 318. In one family, where the index patient is homozygous for a 21OHB deletion and where by definition both parents must be heterozygous, we found that the mother is compound heterozygous for a 21OHB deletion on one haplotype and both a 318Stop mutation (318A) and a normal B sequence in Codon 318 (318B) on the other haplotype. This indicates the presence of a 21OHB gene duplication with one gene carrying a mutation and one gene carrying a normal sequence in Codon 318. This assumption is also compatible with the fact that the mother is healthy. In the RFLP analysis the mother shows a normal double dose of the 3.7kb 21OHB fragment in spite of the fact that she carries a heterozygous 21OHB deletion. Among the 258 families tested, we have found 9 families in which one of the healthy parents carries on the haplotype not inherited to the index patient two 21OHB genes, one with the mutation in codon 318 (318A) and one with a normal codon 318 (318B). In five cases we found the haplotype HLA-B*50-DRB1*07-21OHB318A-21OHB318B, in one case HLA- B*50-DRB1*X-210HB318A-21OHB318B. Among the index patients we have identified 19 patients with the 318 Stop mutation, but there was not a single haplotype which also carried the normal 318B sequence. Of 21 haplotypes with a 318Stop mutation 5 are B*50 positive, 2 of them are B*50-DRB1*07 positive. 8/21 haplotypes are DRB1*07 positive. In our healthy unrelated control panel 6 individuals carry a 318 Stop mutation, at least three with an additional normal 318B on the same haplotype. All six individuals are HLA-B*50 positive, three of them HLA- B*50-DR7. From these results we conclude that there are two different haplotypes: 1) one carries two 21OHB genes, one with a 318stop mutation, the other with a normal 318B sequence so that the enzyme activity is not reduced. Here a fairly strong linkage disequilibrium exists with HLA-B*50 and DRB1*07. and 2) one haplotype with one 21OHB gene carrying a 318stop mutation, leading to a lack of enzyme activity. This haplotype is also associated with B*50 and DRB1*07. These results are interesting because of the implications on a prenatal diagnosis and because of the evolutionary relationship suggested by the common linkage disequilibrium between these two different haplotypes. Opening lecture HLA matching in hematopoietic stem cell transplantation J.A. Hansen, E.W. Petersdorf, P.J. Martin, A. Woolfry, C. Anasetti Fred Hutchinson Cancer Research Center and the University of Washington, Seattle, WA, USA HLA matching has been a primary strategy for optimizing results of hematopoietic cell transplantation (HCT) for more than 30 years. Disparity for HLA can effect transplant outcome by increasing the risk of graft rejection, graft-versus-host disease (GVHD) and transplant-related mortality (TRM). In the early days, knowledge of the genetic composition of HLA was rudimentary and a great deal of research was directed to identifying cell-surface antigens and functional phenotype as revealed by the activation of T cells in mixed lymphocyte culture (MLC). It was eventually determined that HLA identity between siblings could be established by a combination of testing with alloantisera and showing nonreactivity in MLC, but the definition of an HLA match outside the family has remained problematic until recently. Conventional typing by serology and in vitro assays for proliferative and cytolytic responses have not been adequate for detecting all functionally relevant HLA determinants. The introduction of DNA-based typing methods over the last 10 years has profoundly improved the resolution and accuracy. This greater power however has also introduced considerable ambiguity about the definition of a match especially when selecting an unrelated donor (URD). There is currently considerable variation and confusion about appropriate standards for matching. There is one application of serological testing that remains an essential component of the pretransplant donor-recipient evaluation. Patients can be sensitized by pregnancy or transfusions and generate alloantibody reacting with HLA antigens. Previous studies have shown that the risk of graft failure is greatly increased when the patient s serum tests positive with cells from the donor (3). This finding establishes the lymphocyte crossmatch as a necessary assay for confirming donor compatibility for HCT. We have analyzed the effect of allele mismatching for HLA-A, B, C, DRB1 and DQB1 in 300 patients with chronic myeloid leukemia (CML) transplanted from an URD. The overall incidence of graft rejection was 5.6%. The incidence of rejection was 2% when patient and donor were fully matched for HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles. No rejection was seen in transplants where the donor was incompatible for a class II DR or DQ allele. When the donor was incompatible for two or more class I alleles there was a significant increased the risk of rejection (incidence, 20%). GVHD and mortality were significantly reduced by complete donor-recipient matching for HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles, and both GVHD and mortality were increased in the presence of allele mismatching for 2 or more loci. The probability of acute GVHD was significantly increased in recipients mismatched for a single DRB1 or DQB1 allele, but not in recipients incompatible for a single class I allele. The strongest risk of acute GVHD was associated with mismatching for both class I and class II alleles. Similarly, survival was most severely effected by mismatching for at least one class I and one class II allele. There was no significant decrease in survival for patients incompatible for a single class I allele or a single class II allele, but survival was decreased in patients incompatible for two or more class I alleles. The availability of large numbers of HLA typed volunteers worldwide provides opportunity for improving the degree of matching for increasing numbers of patients. HLA and Transplantation V1.1 Haploidentical stem cell transplantation in childhood ALL T. Klingebiel, P. Lang, M. Schurnm, P. Bader, P.G. Schlegel, M. Eyrich, J. Greil, K. Sykora, I. Schmid, D. Nietharnmer, R. Handgretinger University Children s Hospitals of Frankfurt, Tübingen, Hannover; v. Hauner sches Kinderspital, München, Germany; St. Jude s Children Hospital, Memphis, TN, USA Positively selected HLA-disparate CD34+ progenitor cells were isolated from the peripheral blood of related donors by the MACS technique (Mi1tenyi Biotech, Germany) and transplanted to 20 children with ALL from 8/1985 to 8/ were not in remission at the time of transplant, 5 were in 1st (high risk only), 6 in 2nd and 3 >2nd remission. 13 donor/recipient pairs were HLA three-loci mismatch, 4 two-loci and 3 one-locus mismatch. The purity of the CD34+ stem cell graft after MACS-sorting was 98 99%, the mean number of transplanted CD34+ cells was /kg (range /kg). The mean number of infused mature donor T-lymphocytes was /kg (range /kg). The mean time to reach >1,000/µl neutrophiles was 11.7 days. Conditioning was done in 11 patients busulfan based, in 8 patients TBI based and in 1 patient after a rejection of an unrelated graft non myeloablative. Due to the low T -cell number, only a short term (3 pts) or no prophylaxis (17 pts) for graftversus-host disease (GvHD) even in the three-loci mismatch situation was necessary. GVHD (grade <3) was seen in only 2 patients. Donor T- lymphocyte donation was performed in 8/20 patients for the prevention of relapse in patients who were considered to be at high risk for relapse, or in patients who showed an increased mixed chimerism upon serial PCR analysis. Primary engraftment was seen in 18 patients. Non-engraftment Abstracts Infus Ther Transfus Med 2002;29:

4 or rejection occurred in 1 patient each. In both patients, a successful second transplant was performed with highly purified CD34 + cells from the same donor, in both patients the second transplant resulted in complete and sustained hematopoietic reconstitution. Since the B- lymphocyte contamination of the isolated CD34 + cells was as low as 0.2%, no EBV-associated lymphoproliferative syndrome was observed. 7 of the 20 (35%) patients are alive and 6 are disease-free after a median follow-up of 6 months (range 1 53 months). The main cause of death was relapse (8/20 patients); 5 children died of transplant-related causes (VOD 1, infection 4). Four of these 5 children were not in remission when transplanted. The overall survival is 0.28 (SE 0.10), whereas the patient in remission had a probability of survival of 0.42 (SE 0.14) in contrast to patients in non-remission which all died. Our data suggest that the transplantation of megadose of haploidentical CD34+ cells is a realistic therapeutic option for patients with ALL who otherwise have no suitable donor. However, for refractory patients this treatment modality should not be used, whereas patients with high-risk at 1st or 2nd remission have the same probability to be cured as with other donors. Gene Regulation and Autoimmunity Multiple genetic risk factors predipose to type 1 diabetes mellitus: The role of endogenous retroviruses and the nuclear vitamin D receptor K. Badenhoop 1, K. Bieda 1,2, M.A. Pani 1, C. Seidl 3, B. Van der Auwera 4, R.R. Toenjes 2 1 Dept. of Medicine I, 3 Dept. of Immunohematology, University Hospital Frankfurt/M., 2 Paul-Ehrlich-Institut Langen, Gerrmany; 4 Diabetes Research Center, Vrije Universiteit Brussel, Brussel, Belgium Susceptibility to type 1 diabetes (IDDM) is inherited and controlled by several gene loci. The strongest impact comes from the HLA region on chromosome 6p. HLA-DQ genes are the main factors predisposing to IDDM. During evolution, endogenous retroviral long terminal repeats (LTR) have been integrated at several sites within this region and we identified the integration of one LTR (DQ-LTR13) located 1.3 kb upstream of HLA DQB1 as an additional risk factor. We analyzed the transmission of DQ-LTR13 in 204 German and 81 Belgian families with a patient suffering from type 1 diabetes mellitus. Transmission distortion test (TDT) analysis of 1140 HLA DQA1/B1 haplotypes showed that DQ- LTR13 on HLA DQB1*0302 haplotypes was preferentially transmitted to patients (80%; p < 10 6 ). DQ-LTR13 is missing on most DQB1*0201 haplotypes, and those DQ-LTR13-negative haplotypes were also preferentially transmitted to patients (70%; P < ). Thus, the presence of this endogenous retroviral LTR on HLA DQB1*0302 and its absence on DQB1*0201 mark two haplotypes conferring independent susceptibility to type 1 diabetes. Other gene loci were also investigated for a possible genetic interaction with HLA DQ, in particular the vitamin D receptor (VDR) alleles. To further elucidate the role of VDR alleles in type 1 diabetes susceptibility we conditioned 152 German diabetes families for age of onset, maternal vs. paternal transmission, gender of patient and extended HLA-DR/DQ haplotypes with high, medium and low risk. The B allele was preferentially transmitted to male patients (TDT: p = 0.05). Conditioning for HLA revealed a significant transmission disequilibrium for the F allele (TDT: p < 0.05) and for the T allele (TDT: p < 0.05) in the HLA medium risk group. Transmission of the FokI polymorphism significantly differed between the HLA high risk and the combined HLA medium and low risk group (p = 0.03). These results provide a model on how several factors such as the presence of LTRs or VDR variants can interact with the HLA immune response genes in order to make an individual susceptible to the development of β-cell failure. Immunotherapy V3.1 Identifizierung tumorassoziierter T-Zellepitope für die spezifische Immuntherapie von Tumorerkrankungen M. Schirle 1,2, T. Weinschenk 1, F. Obermayr 1, C. Gouttefangeas 1, H-G. Rammensee 1, S. Stevanovic 1 1 Institut für Zellbiologie, Abteilung Immunologie, Universität Tübingen, Auf der Morgenstelle 15, Tübingen; 2 aktuelle Adresse: Institut für Zellbiologie, Abteilung Molekularbiologie, Universität Tübingen, Auf der Morgenstelle 15, Tübingen, Deutschland Ziel einer spezifischen Immuntherapie bei Tumorerkrankungen ist die Induktion einer dauerhaften T-Zellantwort gegen MHC Klasse-I- und Klasse-II-restringierte Tumorantigene. Dabei sind zwei grundsätzliche Vorgehensweisen möglich: einerseits Vakzinierungen mit (gentechnisch modifizierten) Tumorzellen, Tumorlysaten oder Hybridzellen aus Tumorzellen und dendritischen Zellen, andererseits antigenspezifische Vakzinierungen wie z. B. Peptid-, Protein- oder DNA-Vakzinierungen. Dabei bieten nur antigenspezifische Strategien die Möglichkeit einer systematischen Analyse der vakzininduzierten Immunität bei einer klinischen Antwort und einer gezielten Optimierung der Vakzinierungsansatzes aufgrund empirischer Befunde. Die Peptidvakzinierung zeichnet sich wiederum gegenüber anderen antigenspezifischen Ansätzen durch die vergleichsweise einfache und billige Synthese der eingesetzten Substanzen und deren genaue Charakterisierbarkeit aus. Im Gegensatz zu wenigen Modellsystemen wie z.b. dem Melanom stehen jedoch für viele Tumorspezies bisher nur eine sehr begrenzte Anzahl bekannter T-Zellepitope für eine spezifische Immuntherapie zur Verfügung. Andererseits haben bisherige Untersuchungen gezeigt, dass eine Immunisierung mit nur einem Epitop zwar zunächst zu einer effizienten T-Zellantwort führen kann, langfristig jedoch der Verlust der Immunogenizität des Tumors durch Herabregulierung des betreffenden tumorassoziierten Proteins bzw. des präsentierenden HLA-Moleküls begünstigt wird. Ein erfolgreiches Peptidvakzin sollte daher eine möglichst große Zahl von Epitopen aus verschiedenen tumorassoziierten Proteinen sowie mit unterschiedlicher HLA Klasse-I- und Klasse-II-Restriktion umfassen. Die Identifizierung neuer tumorassoziierter Epitope bildet hierfür die Grundlage. Die klassischen, auf präexistierenden T-Zellen basierenden Ansätze zur Identifizierung tumorassoziierter T-Zellepitope werden in zunehmendem Maße durch komplementäre bioanalytische Methoden ergänzt, die wir für HLA-Klasse-I-präsentierte Epitope in dem sogenannten XPRESIDENT- Ansatz (Expression profiling, analysis of peptide presentation by HLA molecules, and identification of new tumor epitopes by T cell screening) vereinigt haben: Die vergleichende Expressionsanalyse von Tumorgewebe und gesundem Gewebe mittels DNA-Chips erlaubt die Identifizierung von tumorspezifisch (über-)exprimierten Genen auch ohne Kenntnis des entsprechenden Proteins und seiner Funktion. Ergänzend erlaubt die TaqMan -Technologie eine quantitative mrna-analyse auf Einzelzellbasis nach Laser-gestützter Mikrodissektion. Mit der Massenspektrometrie steht auf der anderen Seite eine Methode zur Verfügung, die eine hochsensitiven Analyse des HLA-Peptidrepertoires des Tumorgewebes ermöglicht. Die weitere Kombination mit allelspezifischen Epitopvorhersagen erlaubt zudem eine gezielte Identifizierung von HLA-Liganden aus Proteinen, für die zuvor ein tumorspezifisches Expressionsmuster nachgewiesen werden konnte. Schließlich erfolgt mittels RT-PCR von IFNγ-mRNA der Nachweis spezifischer T-Zellen im Blut der Patienten, die die neu charakterisierten tumorassoziierten Epitope spezifisch erkennen. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht damit eine individuelle Vakzinierungsstrategie, bei der das eingesetzte Peptidvakzin auf den jeweiligen Patienten optimal zugeschnitten werden kann. 80 Infus Ther Transfus Med 2002;29:77 96 Abstracts

5 V3.2 Blutstammzelltransplantation bei Autoimmunerkrankungen A. Gratwohl 1, J. Passweg 1, A. Tyndall 2, im Namen des Internationalen Stammzellprojektes der EULAR (European League against Rheumatism) und der EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation) 1 Abteilung für Hämatologie, Departement Innere Medizin, Kantonsspital Basel; 2 Rheumatologische Abteilung, Felix-Platterspital Basel; Universitätskliniken Basel, Schweiz Theoretische Überlegungen, tierexperimentelle Daten und Fallberichte von Patienten mit Stammzelltransplantation wegen maligner Erkrankung aber gleichzeitiger Autoimmunkrankheit ließen seit längerem Vermuten, dass schwere Autoimmunkrankheiten durch eine hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) erfolgreich behandelt werden könnten beschlossen zwei europäische Gesellschaften, die EULAR (European League against Rheumatism) und die EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation), gemeinsam diese Frage anzugehen. Das Konzept basiert auf vier Hauptprinzipien: Patientenselektion, Mobilisierung, Konditionierung und Datenerfassung. Aus Toxizitätsgründen wurden mit Priorität die autologe HSZT sowie Standardverfahren bei Mobilisierung, Stammzellverarbeitung und Konditionierung vorgeschlagen. Rund 350 Patienten mit autologer HSZT wurden bisher von 80 Teams aus 22 Ländern erfasst. Es sind Patienten mit neurologischen (multiple Sklerose) (30%), rheumatologischen (systemische Sklerose, rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, systemischer Lupus Erythematodes und Vaskulitiden) (60%) sowie hämatologischen Autoimmunerkrankungen (5%). Periphere Stammzellen wurden in 85% der Patienten verwendet, Knochenmark wurde vorwiegend bei Kindern eingesetzt. Für die Mobilisierung wurde in 80% Cyclophosphamid und G-CSF/GM-CSF, in 20% G- CSF alleine eingesetzt. Unerwartet waren 3 Todesfälle während der Mobilisation, alles Patienten mit systemischer Sklerose. Als Konditionierung wurden mehrere Schemata verwendet, wobei abhängig von der Diagnose Unterschiede beobachtet wurden. Polychemotherapie BEAM wurde mehrheitlich bei Patienten mit multipler Sklerose eingesetzt, Cyclophosphamid ± ATG bei rheumatoider Arthritis. Vereinzelt wurde Cyclophosphamid mit TBI (± ATG) oder Myleran (± ATG) kombiniert oder wurde Melphalan eingesetzt. In einem Drittel wurden die Stammzellen unmanipuliert zurückgegeben, in zwei Dritteln entweder CD34-selektioniert oder T-Zell-depletiert. Die Resultate sind abhängig von der Grundkrankheit, ein einheitliches Muster lässt sich erkennen. Grundsätzlich sind HSZT bei Patienten mit schweren Autoimmunkrankheiten mit herkömmlichen Standardverfahren machbar. In allen Krankheitskategorien gibt es komplette dauerhafte Remissionen, vorübergehende Remissionen, fehlendes Ansprechen und Todesfälle. Keine der verwendeten Vorgehensweisen kristallisiert sich als überlegen heraus, die Frage der besten Konditionierung wie der Notwendigkeit einer T-/B-Zelldepletion bleibt offen. Im Detail untersucht wurden 41 Patienten mit systemischer Sklerose und 85 Patienten mit multipler Sklerose. Eindrückliche Besserungen wurden bei 70% der evaluierbaren Patienten mit systemischer Sklerose beobachtet: eine Verbesserung des Skin Score um >25% und eine Stabilisierung der Lungendiffusionskapazität. Umgekehrt war die Mortalität, vor allem anfänglich zu Studienbeginn und bei Risikopatienten, höher als bei anderen Erkrankungen (initial 17%, jetzt <10%). Bei 85 Patienten mit multipler Sklerose konnte in 20% eine Verbesserung des EDSS-Score um mindestens 1 Punkt festgestellt werden. Die Mortalität lag nach 3 Jahren um 10%, das progressionsfreie 3-Jahresüberleben bei 74 ± 12%. Diese Daten zeigen, dass eine autologe HSZT bei Patienten mit schweren Autoimmunerkrankungen den Krankheitsverlauf ändern und eindrückliche Stabilisierungen erzielen kann. Offen ist, ob die HSZT im Vergleich mit bisherigen Therapien einen Langzeitüberlebensvorteil bringen kann. Dies muss in prospektiv randomisierten Studien geprüft werden. Für Patienten mit systemischer Sklerose ist eine solche Studie ( eröffnet, für Patienten mit multipler Sklerose in Vorbereitung. Wenn immer möglich, sollten geeignete Patienten in diese Studien aufgenommen werden. V3.3 Cellular immunotherapy clinical relevance and potential pitfalls H.-G. Klingemann RUSH Medical College, 1653 West Congress Parkway, Chicago, IL, USA Infusion of immune active cells is a promising emerging treatment option for cancer patients. The power of immune cells in controlling malignant cell growth is impressively demonstrated by the ability of allogeneic T lymphocytes to re-induce remissions after stem cell transplantation. This immunological effect has been termed graft versus tumor effect and occurs after allogeneic but not after autologous stem cell transplantation. In designing immunotherapies for cancer patients one has to consider why the immune system of the patient has allowed the malignant clone to grow out of control in the first place. Among other abnormalities, immune cells from cancer patients are paralyzed by cytokines ( tumorkines ) produced by the malignant cells. Moreover, most cancer cells express defective HLA molecules thus preventing lymphocytes from recognizing them and engaging with them. It is therefore expected that immunotherapy will be more successful when allogeneic rather than autologous cells are used. The same principle of tolerance toward autologous malignant cells may apply for NK cells, except that NK cells recognize cells as foreign that do not express intact self HLA. Recently dendritic cells (DC), known to be effective antigen presenting cells, have been developed for tumor vaccination. DC can be obtained from CD34+ progenitor cells or blood monocytes. The most effective way of providing/pulsing DC with tumor antigens is still debated. In a recent study in which specific T-cells against EBV epitopes were generated, raised the concern that antigen epitopes on target cells can undergo mutations which cause malignant cells to escape recognition by T-cells. Moreover, the question if autologous T-cells, even when the antigen presentation is optimized, can recognize and engage with malignant cells and clonally expand remains to be answered. It appears that there is great variation with regard to response to tumor vaccination ranging from no response at all 30 40% complete or partial responses. To get around the concern of anergic autologous T-lymphocytes in patients, efforts are underway to ex vivo expand T-lymphocytes from HLA identical donors. This technology has show to be effective in the prophylaxis and treatment of EBV infections. However, ex vivo expansion of T-cells can be expensive, labor intensive and restricted to highly specialized laboratory facilities. Natural killer cells and their cytokine activated form, activated NK (ANK) cells are of significant interest in cancer treatment. ANK should not be confused with LAK cells, which are IL-2 expanded blood cells representing <10% ANK cells (90% are polyclonal T-cells). Studies by our group have shown that autologous NK cells are often unable to lyse the patient s cancer, although they may kill K562 cells. Early studies indicate that allogeneic NK cells can do a better job. Recently the clonal NK-92 cell line has entered first clinical trials in Germany and the US. NK-92 cells are broadly cytolytic because they lack most of the killer cell inhibitory receptors. This cell line can easily be expanded under GMP conditions. The group of Wels in Frankfurt has introduced single chain Fv genes into NK-92 which recognize tumor antigens, making it a highly targeted cellular product that can even kill cancer cells that have been resistant to the wildtype NK-92 cells. Immunotherapy with expanded and manipulated human cells represent a new exciting treatment option that should be particularly useful in patients with minimal disease and in conjunction with other cancer treatment strategies. Abstracts Infus Ther Transfus Med 2002;29:

6 HLA/NK and Non-Classical HLA Molecules V4.1 Polymorphism of the MHC class I related MICA gene (MIC A & MIC B) Z. Yao 1, A. Volgger 1, R. Zahn 1, W. Helmberg 2, E. Keller 1, S. Scholz 1, K. Witter 1, E.D. Albert 1 1 Labor für Immungenetik, Kinder- und Kinderpoliklinik der LMU München, München, Deutschland, 2 National Center For Biotechnology Information, Bldg 38A, NIH, Bethesda, MD, USA The MICA locus codes for a stress inducible surface glycoprotein which is expressed in gastrointestinal epithelium and some epithelial tumors. The MICA molecules are in contrast to regular class I molecules not associated with β 2-microglobuline, and they do not appear to bind specific peptides. The MICA molecule binds with the natural killer receptor NKG2D and co-stimulates some β T-cells as well as antigen specific CD8 β T-cells. The restricted tissue distribution and the inducibility by cytomegalovirus has raised the speculation that MICA gene products could be involved in graft-versus-host disease. For this reason, we have developed techniques for the detection of polymorphisms in exons 2, 3, 4 and 5 as well as in the introns. The triplet repeat polymorphism in exon 5 was analysed using fragment analysis, detecting five different alleles. This exon 5 polymorphism was tested also in over 200 patients with JCA, and no specific association was detected. The exons 2, 3 and 4 were separately sequenced and alleles were established using family segregation. There was an unexpectedly high degree of polymorphism in exons 2, 3 and 4, and the vast majority of the polymorphic positions is non-synonymous. This is particularly true for all 13 polymorphic positions in exon 3. Using the sequence data base for MICA alleles assembled by Steven Marsh, we were able to include the MICA exons 2, 3, 4 and 5 polymorphism in the Helmberg Score Computer Analysis Program. Since the length polymorphism of exon 5 creates difficulties for heterozygous sequencing, we have investigated the polymorphisms of the introns with the aim to identify polymorphic positions which would allow a separation of haplotypes, which in turn made sequencing for exon 5 in the hemicygote situation possible. Investigation of the relationship between the exon 5 polymorphism and that of exons 2, 3 and 4, we were able to show that each of the exon 5 alleles is found together with several different exon 2, 3, 4 sequences. Linkage disequilibrium studies have shown a very strong linkage disequilibrium with the neighboring HLA B locus with some indication that the MICA polymorphism appears to be more ancient or less quickly evolving than HLA B. The fact that the vast majority of the polymorphic positions found in MICA exons 2, 3 and 4 are non-synonymous indicates to us that there must be some function associated with the MICA polymorphism. Interestingly, very recently it has been shown by Steinle et al. that allelic differences for MICA are associated with strong differences in binding between MICA and the natural killer cell receptor NKG2D. V4.2 NK-Zell-Rezeptoren: Funktion in natürlicher und adaptiver Immunität M. Uhrberg Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika, Heinrich Heine Universität Düsseldorf, Moorenstr. 5, Düsseldorf, Deutschland NK-Zell-Repertoire und Alloreaktivität Die Expression von MHC-Klasse-I-Genen schützt körpereigene Zellen vor dem Angriff durch Natürliche Killer (NK)-Zellen. Entartete Zellen, die ihre HLA-Klasse-I-Expression verlieren und dadurch der Erkennung durch das adaptive Immunsystem entgehen können, werden so sensitiv für NK-Zellen. Die molekulare Basis für diese tumorspezifische Zytotoxizität sind Rezeptoren auf den NK-Zellen, die spezifisch für bestimmte HLA-Klasse-I-Produkte sind. Diese NK-Zell-Rezeptoren (NKR) vermitteln inhibitorische Signale an die NK-Zelle und gehören zwei strukturell unterschiedlichen Familien an: Die «Killer Cell Ig-like Receptors» (KIR) gehören zur Immunglobulin-Superfamilie während das aus CD94 und NKG2A gebildete Heterodimer zur Familie der Lektine gehört. Funktionale Studien mit NK-Zell-Klonen zeigen, dass das Zusammenspiel beider Rezeptorfamilien die Spezifität der NK-Zelle weitgehend definiert. Die Gesetzmäßigkeiten, denen die Ausprägung des individuellen NK-Zell- Repertoires unterliegt, sind dabei relativ einfach: Jede NK-Zelle muss mindestens einen NKR exprimieren, der spezifisch für ein eigenes HLA- Klasse-I-Produkt ist. Dies kann sowohl ein inhibitorischer KIR oder auch CD94:NKG2A sein. Abgesehen von dieser Einschränkung können NK- Zellen beliebige Kombinationen von NKR exprimieren, was zu einem hochdiversen Gesamtrepertoire führt. In-vitro-Stimulationsexperimente zeigen, dass inhibitorische NKR auch bei NK-Zell-vermittelter Alloreaktivität eine wichtige Rolle spielen. NK-Zellen verhalten sich in Kultur tolerant gegenüber autologen B-Zell-Linien, zeigen aber starke Zytotoxizität gegen KIR-Epitop-inkompatible allogene Zellen. Die immungenetische NKR-Typisierung zeigt, dass die Alloreaktivität der NK-Zellen direkt mit dem Fehlen eines passenden inhibitorischen KIR zusammenhängt. Diese In-vitro-Daten stellen die Rationale für eine genauere Untersuchung der KIR-Gene im Rahmen der Stammzelltransplantation dar. NKR-Expression auf T-Zellen Es ist seit längerem bekannt, dass eine Subpopulation von T-Zellen im peripheren Blut NKR exprimiert. Das KIR-Repertoire dieser NKR+ T-Zellen ist dem der NK-Zellen ähnlich. Im Unterschied zu NK-Zellen exprimiert aber nicht jede T-Zelle einen inhibitorischen KIR für ein autologes HLA-Klasse-I-Produkt. Die Mehrzahl der NKR+ T-Zellen exprimiert CD45R0, CD57 und ist negativ für CD28, ein Phänotyp der charakteristisch für Memory-T-Zellen ist. Untersuchungen mit CMV- und EBV-Peptid-beladenen HLA-Klasse-I-Tetrameren zeigen, dass viele virusspezifische T-Zellen im peripheren Blut NKR exprimieren. Die antigenspezifische Stimulation dieser T-Zellen in vitro zeigt, dass die Expression von KIR zu einer Hemmung des «activation induced cell death» führt. Laufende Versuche beschäftigen sich mit der Identifikation der Moleküle die zu einer Hemmung des apoptotischen Signaltransduktionswegs in Memory-T-Zellen führen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass KIR nicht nur eine zentrale Rolle bei der Generierung des funktionalen NK-Zell-Repertoires haben, sondern durch ihre Expression auf Memory-T-Zellen auch für die adaptive Immunität bedeutsam sind. Technicians Workshop: Molecular Typing Techniques, Antibody Screening, Cross-Match M01 Die Bedeutung von HLA bei der Immunabwehr S. Reuter Abteilung für Transfusionsmedizin, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland Für die immungenetische Diagnostik sind insbesondere HLA-A, und -B (Klasse I) sowie DR (DRB1 Genort) und DQ (DQB1 Genort) von Interesse. Die Funktion von HLA-Klasse-I-Molekülen besteht darin, Peptide (Fragmente der zellinternen Proteine) auf der Zelloberfläche zu präsentieren. HLA Klasse I stellt somit eine Art «Fenster nach außen» dar, welches den zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten signalisiert, welche Proteine im Zellinneren synthetisiert werden. Im Normalfall können die T-Lymphozyten keine eigenen Peptide erkennen, da autoreaktive T-Zellen während der Embryonalentwicklung eliminiert werden. Wird z.b. bei einer Virusinfektion ein virales, d.h. fremdes Peptid auf der Zelloberfläche durch HLA Klasse I präsentiert, so werden einige der CD8+ T-Lymphozyten des Organismus in der Lage sein, an den HLA-Peptidkomplex zu binden, und die virusbefallene Zelle zu zerstören. Im Gegensatz zu HLA- Klasse-I- sind HLA-Klasse-II-Moleküle nur auf antigenpräsentierenden Zellen (z.b. B-Lymphozyten, Makrophagen) vorhanden. Ihre Funktion besteht darin, von außerhalb der Zelle aufgenommene Peptide gegenüber CD4+ T-Lymphozyten zu präsentieren. Werden fremde Peptide von diesen Lymphozyten erkannt, so aktivieren sie die antigenpräsentierenden Zellen und leiten somit die Immunabwehr ein. Wenn bei einer Knochenmarktransplantation Mismatche zwischen Spender und Empfänger vorhanden sind, so treffen die Lymphozyten des Spenders auf HLA-Moleküle, die im Vergleich zu den ihnen «bekannten» Molekülen veränderte 82 Infus Ther Transfus Med 2002;29:77 96 Abstracts

7 Oberflächenstrukturen und Peptidausrichtungen haben. Dieses täuscht einer großen Anzahl von Spender-Lymphozyten die Anwesenheit von Infektionserregern vor, welche daraufhin eine massive Zerstörung des Empfängergewebes (Graft-versus-host Erkrankung) bewirken. Aus diesem Grund muss eine sorgfältige immungenetische Diagnostik erfolgen, um das Mismatch-Risiko zu minimieren und damit die Prognose der Patienten zu verbessern. M02 Strategien des Anti-HLA-Antikörperscreenings D. Rokitta Abteilung für Transfusionsmedizin, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland Anti-HLA-Antikörper können bei Nierentransplantationen zu einer sofortigen Abstoßungsreaktion führen. Diese Antikörper können z.b. nach Vortransplantationen, Bluttransfusionen und Schwangerschaften entstehen. Bei den zur Nierentransplantation vorgesehenen Patienten werden viermal pro Jahr Screeninguntersuchungen auf Anti-HLA-Antikörper durchgeführt. Neben dem klassischen Lymphozytotoxizitätstest (LCT) können auch andere Verfahren wie ELISA und FACS zum Nachweis dieser Antikörper eingesetzt werden. Aufgrund der großen Patientenzahl (zirka 1700 Patienten auf der Warteliste unseres Zentrums) wird in unserer Abteilung ein Primärscreening mittels ELISA (LAT ) durchgeführt, der Antikörper gegen HLA Klasse I und II erfasst. Mit diesem ELISA können noch keine Aussagen zur Spezifität der Antikörper getroffen werden. Im nächsten Schritt wird bei den antikörperpositiven Patienten ein LCT (HLA Klasse I) durchgeführt, und die Spezifitäten ermittelt. Wenn der LCT negativ ist, können HLA-Klasse-II-Antikörper und/oder nichtkomplementbindende HLA-Klasse-I-Antikörper vorliegen. Zur weiteren Analyse wird eine Spezifizierung mittels eines zusätzlichen ELISAs (LAT ) durchgeführt. Bisherige Studien haben die transplantatschädigende Wirkung von komplementbindenden Antikörpern gegen HLA Klasse I eindeutig belegen können. Die transplantationsmedizinische Relevanz von nichtkomplementbindenden Antikörpern gegen HLA Klasse I sowie die Bedeutung von Antikörpern gegen HLA Klasse II wird derzeit diskutiert. M03 HLA-Antikörpernachweis im Lymphozytotoxtest: Erfahrungen mit kommerziellen Zellplatten und frischen Panelzellen bei der Spezifizierung mit Dithiotreitol K. Gräning Institut für Transfusionsmedizin, Campus Virchow-Klinikum, HLA-Labor, Medizinische Fakultät Charité, Humboldt Universität zu Berlin, Deutschland Die Diagnostik von lymphozytotoxischen HLA-Antikörpern (Ak) erfolgt in unserem Labor in einem initialen Screening mit der NIH-Standard-Methode gegen ein ausgewähltes Panel von 30 frischen Lymphozytensuspensionen. Für Cito-Anforderungen setzen wir kommerzielle Zellplatten ein. Der Ansatz erfolgt mit und ohne Dithiotreitol (DTT). Ein Ergebnis positiv ohne DTT / negativ mit DTT weist auf das Vorliegen von «IgM»-Ak hin, d.h. «falsch-positiv» im Sinne von HLA-IgG-Ak. Aus unserem Quartalscreening sind uns Befunde bekannt, in denen der Test mit DTT stärker positive Reaktionen aufwies als der Ansatz ohne DTT. Diese Befunde sind auch in anderen Laboren lange bekannte und diskutierte Phänomene. Sie wurden mit dem Vorliegen von anti-idiotypischen Antikörpern begründet. Zirka 0,5% unserer Patienten auf der Warteliste Niere zeigen wiederholt dieses Bild. Bei Patienten vor Herztransplantation haben wir dieses Phänomen bei Verwendung von kommerziellen Zellplatten ebenfalls festgestellt, allerdings wesentlich deutlicher. So konnten wir deutlich positive Reaktionen in einigen Seren erst im Ansatz mit DTT sehen und HLA-Spezifitäten definieren. Zur Klärung, ob möglicherweise individuelle Serumfaktoren wie anti-idiotypische Ak oder andere blockierende Faktoren vorliegen, verglichen wir in einem ersten Schritt die Reaktionen in zwei unterschiedlichen Zellplatten und im Screening gegen frische Lymphozytenpanel jeweils ohne und mit DTT. Diese parallelen Ansätze ergaben keine übereinstimmenden Ergebnisse. Es muss nun zusätzlich geklärt werden, welchen Einfluss die unterschiedlichen Zellpräparationen der drei Screeningmethoden, zwei gefrorene Zellpanel und ein frisches Zellpanel, haben. Zur Diskussion werden Variationen in den Techniken am Beispiel von Testseren und Patientenseren vorgestellt. M04 Differente Ergebnisse zwischen serologischer und molekulargenetischer HLA-Typisierung: Troubleshooting und neue spannende Erkenntnisse V. Jacob, C. Dautert, G. Diederich Institut für Transfusionsmedizin, Campus Virchow-Klinikum, HLA-Labor, Medizinische Fakultät Charité, Humboldt Universität zu Berlin, Deutschland Für bestimmte Anforderungen werden in unserem Labor Blutproben sowohl serologisch als auch molekulargenetisch HLA-Klasse-I-typisiert. Organspender werden parallel mit beiden Methoden für die Loci HLA-A, -B typisiert und Nierenempfänger aus zwei unabhängigen Blutproben. Durch das unterschiedliche Auflösungsvermögen bedingte unterschiedliche Typisierungsergebnisse sind erwartete Ereignisse, deren Interpretation keine Schwierigkeiten bereiten. Homozygote Befunde mit der einen oder anderen Methode verlangen weitere Bearbeitung durch Einsatz weiterer Serenpanels oder Primerkits, bzw. die Kombination beider Methoden. Als Diskussionsgrundlage sollen zwei Beispiele vorgestellt werden: 1. Typisierung B-Locus: serologisch zwei Antigene nachgewiesen, molekulargenetisch ein Antigen nachgewiesen. Die nachfolgenden Untersuchungen einschließlich Sequenzierung in einem anderen Labor ergaben ein neues Allel, das mit den Primermixen der eingesetzten Testkits mehrer Firmen noch nicht erfasst werden konnte. 2. Typisierung B-Locus: serologisch zwei Antigene nachgewiesen, molekulargenetisch ein Antigen nachgewiesen. Wiederholungsansätze mit verschiedenen Testkits bestätigten die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Methoden. Eine umfangreiche Analyse der Testseren aller kommerziellen Platten mit Hilfe unserer Mikroskopsoftware ergab bisher nicht dokumentierte Extrareaktionen in mehreren Seren derselben HLA-Spezifität. M05 Profiling polymorpher Non-HLA-Gene als Kandidaten potentieller Minor-Histokompatibilitätsantigene N. Fuchs Abteilung für Transfusionsmedizin, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland Wird Gewebe transplantiert, so wird dieses vom Empfänger im ungünstigsten Fall abgestoßen. Diese immunologische Reaktion hängt weitgehend davon ab, inwieweit sich Spender und Empfänger in ihren Transplantationsantigenen unterscheiden. Neben den so genannten «starken» Major-Histokompatibilitätsantigenen gibt es die so genannten «schwachen» Minor-Histokompatibilitätsantigene (mhags), die als mitauslösende Faktoren für die Entwicklung einer Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) nach allogener Transplantation diskutiert werden und nach HLA-identischer Transplantation sogar allein für den Schweregrad der GvHD verantwortlich sind. Am Beispiel des mhags HA-1 soll die so genannte PCR-SSP dargestellt werden. Die Entwicklung der Sequenz-spezifischen PCR erfolgt auf der Basis bekannter Sequenzdaten. Die Aminosäuresequenz wird von dem Gen KIAA*0223 auf Chromosom 19 kodiert. Bisher wurden zwei HA-1-Allele identifiziert, die sich in einer Aminosäure unterscheiden. Die HLA-A*0201-präsentierten Peptide unterscheiden sich an Position 3 durch Histidin (HA-1 H ) oder Arginin (HA-1 R ). Der Aminosäureaustausch basiert auf der Substitution von Adenin (HA-1 H ) durch Guanin (HA-1 R ). Für jeden Polymorphismus wird ein Primermix, bestehend aus je einem Allel-spezifischen und einem Common-Primer, benötigt. Die spezifischen Primer haben eine Länge von 20 Nukleotiden. Die Größe des Produkts sollte nicht länger als 300 bp sein, da in jedem PCR-Ansatz zur Kontrolle eine Sequenz des humanen Wachstumshormon-Gens mit amplifiziert wird. Mit einer Länge von 1069 bp ist dieses Amplifikat eindeutig von der spezifischen Bande im 2,5%igen Agarosegel zu unterscheiden. Der optimale Master-Mix, bestehend aus Puffer, dntps, Polymerase, internen Kontrollprimern und den entsprechenden Abstracts Infus Ther Transfus Med 2002;29:

8 Sequenz-spezifischen Primern, wird routinemäßig angewandt. Ein etabliertes PCR-Programm und die Analyse im 2,5%igen Agarosegel gehören, wie auch der Master-Mix, zu den wichtigen Kriterien für ein erfolgreiches Profiling. Transplantation Minor histocompatibility antigens (mhags) are thought to be targets for graft-versus-host (GvH) and graft-versus-leukemia reactions after allogeneic stem cell transplantation (SCT). To assess the proteinase 3 (PR3) V119I polymorphism as a possible mhag, we screened the allelic distribution by sequence specific primed PCR in 221 blood donors. The allele frequencies for PR3-119V and PR3-119I were 0.56 and 0.44, respectively. To determine whether peptides derived from the PR3-V119I variation may act as mhags, we investigated the ability of synthetic peptides to induce peptide-specific T lymphocytes in vitro. According to the peptide binding motif of HLA-A*0201, decamers were chosen (sppr3-119v; sppr3-119i). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of HLA-A*0201 PR3-V119V, PR3-I119I and PR3-V119I donors were stimulated with the individual peptides. Intracellular IL-2 detection (icil-2) by flow cytometry served as an indicator of peptide-specific CD8+ T-lymphocyte activation. PR3-I119I PBMCs showed a significant CD8+ T-lymphocyte activation, when stimulated with the discordant sppr3-119v peptide. Likewise, icil-2 was induced in PR3-V119V CD8+ T lymphocytes by sppr3-119i. The allelic distribution was analyzed in 104 HLA-identical SCT pairs. In 36 HLA-A*0201 sibling SCT pairs 11% (4) had a PR3-119I and 8% (3) a PR3-119V disparity in GvH direction. The overall disparity was 19% (7). In 14 HLA-A*0201 MUD SCT pairs 36% (5) had a PR3-119I disparity in GvH direction. Though a clinical effect on the course of GvHD was only observed as a tendency, the clinical and experimental data obtained so far provide evidence that PR3 can be expected to act as mhag. A1.1 Flow cytometric analysis of T-cell proliferation in mixed lymphocyte reaction with dendritic cells X.D. Nguyen 1, H.Eichler 1, C. Piechaczek 2, H. Klüter 1 1 Institute of Transfusion Medicine and Clinical Immunology, Red Cross Blood Service of Baden-Württemberg and Faculty of Clinical Medicine Mannnheim, University of Heidelberg, 2 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany Dendritic cells (DCs) can be generated in vitro from CD14-positive or CD34-positive cells. T-cell proliferation using [ 3 H] thymidine incorporation assay has been used widely to check the DCs function. However, this technique only provides information about the T-cell proliferation. We developed a novel method for precise quantification of T-cell proliferation using flow cytometric analysis. DCs were generated from CD14-positive cells from 6 healthy blood donors. These DCs and allogenic naive T- helper cells (T H) or naive cytotoxic T lymphocytes (CTLs) from one individual were co-cultured with a ratio 1:10. T cells were harvested on day 1, 4, 6, 8, 10, 12 and analysed by flow cytometry using four different fluorescences. CD3-ECD- and CD4-FITC- or CD8-FITC-antibodies were used to distinguish T cells from the other cell populations. T-cell activation and proliferation was measured by assessment of HLA-DR, CD45RO, CD25, CD71 expression using PE fluorescence. Dead cells were excluded with 7-AAD. Fluorescent microparticles were used for T-cell quantification. The initial T-cell concentration on day 1 was ± 31.9 ( ) T H/µl and ± 46.5 ( ) CTLs/µl. The maximal T-cell proliferation was recorded on day 8, where a 5- to 10-fold T-cell expansion, resulting in 1,938 ± (1,446 2,404) T H/µl and 944 ± (560 1,483) CTLs/µl was observed. Activated and proliferated T cells showed typical characteristics with a high intensity of side and forward scatter. The flow cytometric method enabled a simple and rapid quantification of T-cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction with DCs. Thus, specific T-cell subsets involved in these proliferative responses can be assessed into details. A1.2 Genomic profiling and T cell epitope mapping identified peptides derived from the PR3 variant region as minor histocompatibility antigens B. Eiz-Vesper 1, B. Khattab 1,2, N. Fuchs 1, A. Ganser 2, B. Hertenstein 2, R. Blasczyk 1 Depts. of 1 Transfusion Medicine and 2 Hematology & Oncology, Hannover Medical School, Germany A.1.3 Proteasomal cleavage analysis of polymorphic proteins to predict presentation of minor histocompatibility peptides B. Khattab 1,2, A. Ganser 2, B. Hertenstein 2, R. Blasczyk 1 Depts. of 1 Transfusion Medicine and 2 Hematology & Oncology, Hannover Medical School, Germany Minor histocompatibility antigens (mhags), derived from polymorphic proteins, are thought to be targets for graft-versus-host disease and graftversus-leukemia reactions after allogeneic stem cell transplantation. To achieve a correct size for an optimal binding to MHC class I molecules, proteins have to be fragmented by proteasomal processing. We used the proteasomal cleavage prediction algorithm recently developed by Nussbaum et al. to analyze the known aa sequences of the autosomal mhags HA-1, HA-8, HB-1 and of the Y-chromosomal mhags SMCY, DFFRY, and UTY for a properly proteasomal processing. Strikingly, the immunodominant HA-1 H nonamer was correctly predicted at both the N- and C- terminus. By replacing histidine by arginine at position 3, an epitope-destroying cleavage site is inserted into HA-1. For the HA-8 R nonamer and the HB-1 H decamer slightly prolongated peptides at the N-termini were predicted which could be further N-terminally processed by cytosolic or ER-trimming proteases, but the C-termini of these mhags were correctly predicted. The replacement of arginine by proline in HA-8 as well as of histidine by tyrosine in HB-1 leaded to epitope destroying cleavage sites. For the analyzed Y-chromosomal encoded mhags, known to be recognized by CD8+ cytotoxic T lymphocytes, the algorithm failed to predict correct cleavage sites. The predicted peptides had shorter sequences than the HLA-restricted CTL epitopes described for HLA-A1, B7, B8 and B60. Despite the drawback of being incomplete the protesomal cleavage analysis provides evidence that a large portion of mhag peptides which could be presented by HLA class I molecules will never be generated by proteasomal cleavage and thus are without any clinical relevance. A1.4 No evidence for an effect of disparities of polymorphic cytokine genes and selected minor antigens on GvHD and survival in a Viennese patient group undergoing bone marrow transplantation G.F. Fischer, I. Faé, W.R. Mayr, K. Lechner, P. Kalhs, H. Greinix Department for Blood Group Serology, Department of Internal Medicine, University of Vienna, Vienna, Austria We were interested whether disparities of polymorphic cytokine genes and disparities of other putative minor antigens show an influence on the outcome of bone marrow transplantation with HLA identical donors. We typed the polymorphic cytokine genes of TNF, IL-10, IFN-γ, IL-6 and TGF-β in 50 patients and their donors by the SSP technique. In addition we characterised polymorphisms of CD31, Hag-1 and IL1-RA genes with the same technique. Patients were grouped in respect to the severity of graft versus host disease (GvHD) and overall survival. We studied correlations of the presence of genomic polymorphic markers and disease outcome. In addition, the distribution of polymorphic alleles was compared in the various patients groups. For the analysis of disparities of the Hag-1 antigen, patients were further grouped into HLA-A2-positive and -negative individuals. We could not find any statistically significant correlation of polymorphisms and the incidence of GvHD and survival. In addition, the distribution of genomic polymorphisms did not differ between patients groups characterised by various grades of GVHD, or the survival. 84 Infus Ther Transfus Med 2002;29:77 96 Abstracts

9 We conclude that we could not see a clear-cut effect of disparities of polymorphic cytokine genes and other putative minor antigens on the outcome of bone marrow transplantation in our patient sample. The number of patients was probably too small and larger studies are be necessary to prove any influence of those markers on transplantation outcome. A1.5 Soluble CD30 as a predictor of kidney graft outcome C. Süsal 1, S. Pelzl 1, M. Wiesel 2, P. Schnülle 3, C. Schönemann 4, G. Opelz 1 1 Department of Transplantation Immunology and 2 Department of Urology, University of Heidelberg, 3 Department of Nephrology, Clinic for Internal Medicine, University of Mannheim, 4 Bloodbank, Charité, Berlin, Germany In the present study we investigated whether the soluble form of CD30 (scd30), a marker for Th2-type cytokine producing T cells, is increased in sera of potential kidney graft recipients and whether the pretransplant serum scd30 content is related to kidney graft survival. Pretransplant sera of 844 cadaver kidney recipients from 3 transplant centers in Germany were tested for serum scd30 content using a commercially available ELISA kit. Kidney graft recipients showed a significantly higher serum scd30 content than healthy controls (p < ). High scd30 serum content was associated with graft rejection. The 2-year graft survival rate in recipients with a high pretransplant serum scd30 was 68 ± 6%, significantly lower than the 86 ± 1% rate in recipients with a low scd30 (p < ). Importantly, high scd30 was indicative of an increased risk of graft loss even in recipients without lymphocytotoxic alloantibodies. These data show that an increased pretransplant Th2-type immune response as indicated by elevated serum scd30 is detrimental for kidney graft survival. A1.6 Analysis of microchimerism using mitochondrial DNA polymorphisms A. Reil, C. Diening, M. Feigl, G. Bein Institute for Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Justus-Liebig- University Gießen, Germany The expanding use of reduced intensity conditioning regimens for allogeneic stem cell transplantation requires exact monitoring of donor cell engraftment. Analysis of chimerism serves to discriminate between reconstitution of donor and recipient lymphohematopoietic cells. In order to detect a relapse of the disease as soon as possible, a high sensitivity of the detection method is needed. Methods currently used achieve a sensitivity of 1 among 1,000 cells (FISH) to 1 of 10,000 cells (nested PCR). Leukocytes contain about 10,000 mitochondria with a specific genome (mtdna). Thus, employing polymorphic mtdna sequences should increase the sensitivity of chimerism detection markedly. Sequence-specific primers were established for frequent polymorphisms in the first hypervariable region of the mitochondrial genome (HVR1). We used the Roche LightCycler system with the SYBR Green I fluorescence detection technique. First, we tested the sensitivity of standard PCR with two sequence-specific primers amplifying genomic sequences of the HLA- DRB1 locus. The DNA equivalent of 4 cells, i.e. 4 copies of the DRB1 allele in a heterozygous individual, was necessary to obtain a specific PCR product. Using two sequence-specific primers for mtdna sequences, the DNA equivalent of cells was sufficient to obtain a specific PCR product. In conclusion, the detection of mtdna sequences increased the sensitivity 1,000-fold. Another important advantage of this procedure is the rapidity: Once primers are established, the analysis is done within 2 h. LightCycler PCR of mitochondrial sequence polymorphims provides a new rapid, sensitive and quantifiable method for analysis of microchimerism. Autoimmunity, Gene Regulation A2.1 Epitopanalyse des humanen monoklonalen MHC-Peptid- Antikörpers UL-5A1 A. Wölpl 1, A.B.Vogt 2, H. Kropshofer 2, S.F. Goldmann 3, T. Eiermann 4 1 Labor für Medizinische-Genetik, Martinsried, Deutschland; 2 Institut für Immunologie, Basel, Schweiz, 3 Transplantationimmunologie, BSD Baden-Württemberg Institut Ulm, 4 Blutbank, Universität Hamburg, Deutschland Der HLA-Molekül-Peptid-Komplex wirkt für T Zellen als starker Immunstimulator. Um diesen Komplex genauer untersuchen zu können, haben wir das peptidabhängige Epitop des humanen monoklonalen Antikörpers UL-5A1 weiter charakterisiert. Der mab UL-5A1 erkennt, ebenso wie die T-Zelle, ein Konformationsepitop, bestehend aus dem HLA- DR1/DRB1*0101-Molekül und einem von HLA-A2 (A*0201) abgeleiteten Peptid ( ) (VGSDWRFLRGYHQYA). Durch FACS-Analyse von lymphoblastoiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass das minimale Bindungsepitop von UL-5A1 auf dem HLA-DR1-Molekül die Aminosäuren (AS) 67, 71, 85 und 86 umfasst. AS-Variationen des A2-Peptids zeigen, dass neben der AS 107 als Ankermolekül die AS-Positionen 108 (R), 109 (F) und 111 (R) für die UL-5A1-Bindung von entscheidender Bedeutung sind. Werden 5 Tage mit GM-CSF und IL-4 kokultivierte, HLA-DR1/DRB1*0101-positive, periphere Monozyten mit rekombinantem A2/A*0201-Peptid ( ) inkubiert, so kann nach 7 Tagen der gebildete HLA-DR1-A2-Komplex mit UL-5A1 nachgewiesen werden. Werden dendritische Zellen mit Zelllysaten von verschiedenen A2-Subtypen (A*0201, 0204, 0205, 0207, 0210) koinkubiert, konnte gezeigt werden, dass AS-Veränderungen außerhalb der Sequenz keinen Einfluss auf das UL-5A1-Epitop haben. Ein AS-Austausch bei 107 (W-G), wie bei A*0210 führt zum Verschwinden des UL-5A1-Epitops. Diese Experimente zeigen, dass für den In-vitro- und In-vivo-Einsatz solcher Antikörper die genaue Kenntnis des Bindungsepitops notwendig ist. A2.2 HLA haploid typing of single diploid individuals by analysis of haplotype-marking SNPs (Haplon analysis for HAPLA typing) M.J. Simons 1, E. Albert 2 1 HaploGEN, Melbourne, Australia; 2 Laboratory for Immunogenetics, Children s Polyclinic, Munich University, Germany A continuing goal in genomic and genetic analysis is the development of practical methods for direct haplotyping of single individuals in the absence of pedigree information. Separately we have described a strategy for chromosome dissection of the two haploid elements (HAPLO-DIS- SECTION). GMP conversion technology involving rat-human cell hybrid formation also separates the two DNA sequences for separate analysis. The remaining goal is to resolve the diploid state into the two haploid components using genomic DNA. Routine HLA-DNA typing is shortsegment haplotyping. Because there are very few allele-specific SNPs, locus alleles are defined and assigned on the basis of unique combinations of SNPs. However, the extent of HLA locus polymorphism, and the SNP patterning of allele sequence variation do not permit unambiguous resolution of the genotype into two alleles in all cases. Longer-segment, including inter-locus, haplotyping also requires resolution of phase for unambiguous haplotype assignment. A single SNP which appears to be subtypic to an adjacent locus allele is a candidate haplotype-specific marker, but may reflect an hitherto undetected coding sequence allele. As with coding allele typing, inter-locus haplotyping depends on multi-snp pattern analysis. Current approaches estimate haplotypes based on pair-wise linkage disequilibrium (LD) analysis. This approach, usually assuming independence of SNPs, has least statistical power. LD strength varies as a function of SNP co-occurrence, and of population frequency of haplotypes on which each SNP occurs. High LD levels reveal segments of lesser inheritance complexity, thereby helping to define the minimum extent of haplotypes in that genomic region. However, the unit of inheritance is not individual SNPs but more the genomic segment between boundaries of recombination. Within segments having shared inheritance histories SNPs are not independent. Over evolutionary time, up to the advent of each Abstracts Infus Ther Transfus Med 2002;29: