ÜBUNGEN AUS HYGIENE UND MIKROBIOLOGIE

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1 ÜBUNGEN AUS HYGIENE UND MIKROBIOLOGIE JULI 2018 Verhalten im Labor Rauch-, Ess- und Trinkverbot Äußerste Sauberkeit und Ordnung im Raum und am Arbeitsplatz Nach Beendigung der Arbeit Hände desinfizieren Schutzkleidung (weißer Arbeitsmantel) Arbeitsfläche nach Beendigung der Arbeit desinfizieren Nicht mit dem Mund pipettieren. 1

2 Bunsenbrenner nicht unbeaufsichtigt lassen (nur bei Bedarf anzünden). Bei Gasgeruch sofort Gaszufuhr abdrehen. Lange Haare nicht offen tragen (Haare zusammenbinden! Kontaminations- und Verletzungsgefahr) Sachgemäße Entsorgung der kontaminierten Gegenstände ENTSORGUNG! (Agarplatten, Plastikpipette, Handschuhe) KEIN GLAS OBJEKTTRÄGER/AMPULLEN Papier 2

3 Grundlagen des sterilen Arbeitens Sterile Geräte und Materialien nicht durch Kontakt mit unsterilen Oberflächen (Hände, Mantel, etc.) kontaminieren Wir verwenden Einweg Pipetten und Spatel, diese in Desinfektionslösung geben (Eimer). Glas, Plastik, Papier getrennt entsorgen Grundlagen des sterilen Arbeitens Bei Kontamination oder Verletzung: immer melden Brandwunden sofort und lange unter Wasser halten bei Augenkontamination reichlich mit Wasser spülen (Klinik) kommt kontaminiertes Material in den Mund: nicht schlucken! Ausspucken und dann mit 0,1% KMnO4 spülen 3

4 BAKTERIOLOGISCHES LABOR UND LABORAUSSTATTUNG Mikrobiologisches Arbeiten setzt voraus, dass die Arbeitsflächen leicht zu reinigen und zu desinfizieren sind. Fußbodenbelag und Oberflächen der Tische, bevorzugt aus Kunststoff, müssen feucht abzuwischen sein. Es müssen entsprechende Einrichtungen wie Wasserhähne, Gasanschlüsse, Waschbecken usw. vorhanden sein. BAKTERIOLOGISCHES LABOR UND LABORAUSSTATTUNG Mikroskop, Objektträger, Farbstoffe Brutschrank (22 C, 30 C, 37 C, 44 C) Trockenschrank (180 C, 30min und höher) Autoklav (121 C, 20min) Kühlschrank, Wasserbad, Laborwaage Mischgeräte wie, Magnetrühr, Vortexer, Stomacher, ph-meter, Photometer, Zentrifuge UV-Lampe (254nm und 365nm) Impfgeräte (Nadel,Öse, Drigalskispatel) Glasgefäße wie Flaschen, Eprouvetten, Pipetten usw. Sterilpetrischalen Abfalleimer, Desinfektionsmittel Pipettierhilfen, Bunsenbrenner 4

5 Trockenschrank (180 C, 30min und höher) Wasserbad UV-Lampe (254nm und 365nm) VORTEXER STOMACHER Behandlung mit trockener Heißluft 5

6 VERDÜNNUNGSMEDIUM ÖSE TUPFER PASTEUR PIPETTE DRIGALSKISPATEL REINIGUNG UND STERILISATION IM LABORATORIUM Sterilisation durch feuchte Hitze (Autoklavieren) 6

7 Der zeitliche Ablauf einer Sterilisation lässt sich in vier Abschnitte gliedern: Anheizzeit: Zeit für das Anheizen des Sterilisators, Ausgleichszeit: Zeitspanne, bis das Gut die Sterilisiertemperatur angenommen hat, Abtötungszeit: Einwirkungszeit, die für das Abtöten erforderlich ist, Abkühlzeit: die für die Abkühlung des Gutes notwendige Zeit. Der zeitliche Ablauf einer Sterilisation lässt sich in vier Abschnitte gliedern: 7

8 Sterilisation durch Filtration Endotoxin (LPS) Die hitzelabilen Lösungen (Zucker usw.) werden sterilfiltriert (Porenweite 0,2 µm). Mittels dieser Methode können Lösungen endotoxinfrei gemacht werden NÄHRMEDIEN Bakteriologische Nährböden dienen der Kultivierung, d.h. der Vermehrung von Mikroorganismen außerhalb ihres natürlichen Standortes. Die Nährböden müssen bestimmte Grundeigenschaften aufweisen, die den Mikroorganismen Wachstum und Entwicklung ermöglichen. ausreichende Feuchtigkeit ausreichende Mengen entsprechender Nahrungsstoffe optimale Temperatur optimaler ph-wert optimaler osmotischer Wert entsprechendes Redox-Potential 8

9 NÄHRMEDIEN Nährböden bestehen, abgesehen vom Gehalt an Wasser, aus einer Reihe verschiedener Substanzen, die sich bezüglich ihrer Funktion folgendermaßen einteilen lassen: Trägersubstanzen (Agar-Agar, Gelatine, Kieselgel) Nährstoffe (chemisch nicht definierte Nährstoffe wie Pepton; chemisch definierte Nährstoffe wie Vitamine oder Kohlenhydrate) Puffersubstanzen Selektive Hemmstoffe (Farbstoffe, Antibiotika, Detergentien) Selektierende Faktoren wie Mangelmedien, Sauerstoff, ph-wert, Temperatur Nährmedien-Zusammensetzung Fleischwasser od. Hefe-Extrakt (Coenzyme, anorganische Ionen) Pepton (Aminosäuren) Glucose (Energie) Feste Nährmedien enthalten zusätzlich ein Verfestigungsmittel, z.b. Agar-Agar (aus Rotalgen gewonnen) 9

10 Nährmedien flüssig Nährmedien fest 10

11 Nährmedien Minimalmedium: enthält nur essentielle Bestandteile Optimalmedium: komplexes Naturprodukt, ermöglicht optimales Wachstum Streptococcus pneumoniae auf Blutagar Nährmedien Minimalmedium Optimalmedium Selektivmedium: enthält Nährstoffe, die nur von bestimmten Bakterien verwertet werden können oder Wirkstoffe, die gezielt das Wachstum mancher Arten unterdrücken Differenzierungsmedium: Unterscheidung zwischen Bakterien auf Basis von Stoffwechselleistungen 11

12 S. epidermidis und E. coli auf Blut- und Endo-Agar E. coli und P. mirabilis auf CLED-Agar E. coli P. mirabilis 12

13 AGARPLATTEN Zubereitung mikrobiologischer Nährböden: Einwaage: Trockennährboden einwiegen, Wassermenge abmessen. Suspendieren: Ca. halbe Wassermenge ins Ansatzgefäß geben, abgewogenen Trockennährboden zufügen, umschütteln bis dieser vollständig suspendiert ist, mit restlichem Wasser Trockennährboden restlos lösen. Auflösen: Ansatz im siedenden Wasserbad oder strömenden Dampf erhitzen. ph-wert Einstellung Sterilisation (15 Minuten bei 121 C) 13

14 Zubereitung mikrobiologischer Nährböden: Nach dem Sterilisieren des Nährmediums bei 121 C, lässt man dieses auf ungefähr 45 C abkühlen. Dann wird es in der Sterilbank (reine Werkbank) in sterile Petrischalen gegossen. Nährböden in Kulturröhrchen Stichkultur Schrägagarkultur 14

15 PRINZIPIEN DES STERILEN ARBEITENS Überführen von Mikroorganismen aus einem Kulturgefäß in ein anderes mit Impföse, - nadel oder Pipette unter sterilen Bedingungen zum Zwecke ihrer Anreicherung, Isolierung oder Fortzüchtung. Grundprinzipien Für die diagnostische Erfassung, Merkmalfeststellung und Resistenzbestimmung sind Reinkulturen oder zumindest gut getrennte Einzelkolonien erforderlich! Durch das fraktionierte Ausstreichen gelingt es, aus Bakterienmischungen Einzelkolonien zu isolieren! 15

16 Fraktionierter Ausstrich (Drei- Ösen- Ausstrich) Der Primärstrich wird durch Sekundärstriche verdünnt, diese wieder durch Tertiärstriche. 3. ÖSE 2. ÖSE 1. ÖSE 16

17 MO IMPFTECHNIKEN (EINZELBEISPIEL, Ü1 AUSSTREICHEN AUF NÄHRBÖDEN) Fraktionierter Ausstrich auf vier verschiedenen Nährböden: o o o o Blutagarplatte, Chromogene Coliformen Aagr, McConkey Agar, CLED Agar Bakterien: 1: Staph, 2: Strep, 3: Proteus, 4: E. coli Bebrütung: 37 C und 24h 2. Rachenabstrich (Einzelbeispiel) Zunge mit Spatel herunterdrücken oder mit Papierhandtuch greifen und nach vorne ziehen Tupfer einführen ohne dabei Lippen und Mundschleimhaut zu berühren Tupfer unter Druck von oben nach unten über die Tonsillen sowie horizontal über die Rachenwand streichen 17

18 2. Rachenabstrich Gewonnenes Material als Primärstrich auf Blutagarplatte sowie (mit Bleistift) beschrifteten Objektträger aufbringen (Rachenabstrich, Nr.1) Nährbodenplatte zugedeckt beiseite legen und später weiterverarbeiten; Objektträger nach einer kurzen Lufttrocknungsphase hitzefixieren und nach Gram färben Rachenabstrich auf Blutagarplatte Der Primärstrich wird durch Sekundärstriche verdünnt, diese wieder durch Tertiärstriche. ÖSE 18

19 Entnahme einer Bakterienkolonie Fraktionierte Ausstrich nach Bebrütung RK MK 19

20 (Pipettierhilfen benutzen) Kulturverfahren 20

21 Kulturverfahren Verfahren, das Bakterien außerhalb des natürlichen Standortes zur Vermehrung bringt (unbelebte Substrate oder Zellkulturen) Verlässlichste Sicherung einer Verdachtsdiagnose Voraussetzung für die Empfindlichkeitsprüfung Ermöglicht Analyse der Klonalität von Isolaten Infektionsepidemiologie Bakterienwachstum durch binäre Teilung 21

22 Mikroskopie 22

23 Mikroskopie Verfahren (Hellfeld, Dunkelfeld, Phasenkontrast, Fluoreszenz) Bakterien sind im Lichtmikroskop bei 1000facher Vergrößerung gerade noch sichtbar Immersionsöl zur Verbesserung der Auflösung erforderlich Pilze und Protozoen sind bereits bei 400facher Vergrößerung erkennbar Mikroskopie Wichtige Schnellmethode zum Nachweis von Bakterien in primär sterilen Materialien (Harn, Liquor, Gewebe) oder Erregern mit typischer Morphologie/Färbeverhalten (Treponemen, Vibrionen, Mykobakterien) Begrenzte Sensitivität (Nachweisgrenze 10 4 Keime/ml) Wichtig auch für vorläufige Bestimmung und systematische Einordnung von Bakterien 23

24 Lichtmikroskopie Nativpräparat Lebende Keime Ungefärbt Beweglichkeit Gefärbte Präparate Hitzefixierung Monochrome Färbungen Methylenblau Fuchsin Polychrome Färbungen Gram Ziehl Neelsen Nativpräparat 24

25 Methylenblau-Färbung Gram-Färbung 25

26 Ziehl-Neelsen Färbung FÄRBUNGEN 26

27 3. Gramfärbung Färben sie den eben hergestellten Rachenabstrich ( Nr.1) und das vorgefundene Laborpräparat (Nr.2) und Hefe mit Hilfe der Tutoren nach Gram und mikroskopieren sie die Präparate. Immersionsöl verwenden GRAMFÄRBUNG 27

28 Vorbereiten des Präparates Objektträger beschriften Aqua dest. aufbringen Vorbereiten des Präparates Kolonie entnehmen Kolonie in A. dest. einrühren Präparat LUFTTROCKNEN dann hitzefixieren 28

29 GRAMFÄRBUNG 29

30 Färbung nach Gram 1. Präparat LUFTTROCKNEN dann hitzefixieren 2. Den Ausstrich mit Kristallviolett (R1) bedecken (2 Min.) 3. Abspülen mit Aqua dest. (kurz) 4. Differenzieren mit Lugolscher Lösung (R2) (2 Min.) 5. Abtropfen lassen, vorsichtig mit Aqua dest. abspülen 6. Entfärben mit Alkohol (95%) (R3) 7. Abspülen mit Aqua dest. (kurz) 8. Gegenfärben mit Safranin (R4) (30 sek.) 9. Abspülen mit Aqua dest., lufttrocknenn und unter dem Immersionsobjektiv untersuchen (Immersionsöl) Vorbereiten des Präparates 30

31 Lufttrocknen und Hitzefixieren Färbung mit Kristallviolett (R1) Kristallviolett auftropfen Nach 2 min abgießen 31

32 Beizung mit Lugol scher Lösung (R2) Lugol sche Lösung auftropfen Nach 2 min abgießen Entfärbung mit Alkohol (R3) Entfärben mit 96% Alkohol bis keine Farbwolken mehr abgehen 32

33 Gegenfärbung mit Safranin (R4) Safranin auftropfen Nach 30 sec mit Leitungswasser abspülen Vorsichtig abtupfen und lufttrocknen Färbeverhalten und Morphologie 33

34 Bei Betrachtung in stärkster Vergrößerung (100X), muss auf das Präparat ein Tropfen Immersionsöl aufgebracht und die Außenlinse des Immersionsobjektivs darin eingetaucht werden. Vergrößerung (100X) Immersionsöl Farbstoffe entsorgen Färbewanne putzen Mikroskopieren Ergebnis notieren 34

35 Bacillus cereus 35

36 C. bifermentans C. difficile 36

37 Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis 37

38 HEFE 38