Biologie für Mediziner

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1 Biologie für Mediziner Praktisches Arbeiten in der Mikrobiologie Steriles Arbeiten im Praktikum Beim Praktikum Biologie für Mediziner II geht es um Grundlagen und Techniken der Mikrobiologie. Dabei werden nicht die gleichen Maßstäbe für das sterile Arbeiten angelegt wie z. B. in einem medizinischen Forschungslabor oder einem Operationssaal. Durch die Einschränkungen in den zur Verfügung stehenden Räumlichkeiten sind die Nutzung einer Sterilbank oder die Verwendung von Bunsenbrennern nicht möglich. Bei Berücksichtigung der nachstehend aufgeführten Anweisungen ist ein sauberes und kontaminationsfreies Arbeiten trotzdem möglich. Das sterile Arbeiten dient der Vermeidung von Kontaminationen durch Luftkeime, Keimen an den Händen etc. beim Arbeiten mit den Mikroorganismen. Dabei sollen die Kulturen und die Mikroorganismen geschützt werden und nicht der Praktikant! Die Fenster müssen deswegen möglichst geschlossen bleiben (Luftkeime)! Man benötigt grundsätzlich eine freie und saubere Arbeitsfläche! Deshalb legen Sie bitte keine Unterlagen oder Kleidungsstücke auf den Bereich des Tisches, auf dem Sie arbeiten wollen. Vor Versuchsbeginn sollen die Hände und die Arbeitsfläche mit Sterilium desinfiziert werden. Die Arbeitsfläche gilt trotzdem nicht als steril! Deswegen dürfen Glaspipetten oder andere Arbeitsgeräte, die mit den Mikroorganismen, Medien oder Kulturplatten in Kontakt kommen, nicht auf dem Tisch abgelegt werden. Zur Vermeidung einer Kontamination durch Luftkeime arbeitet man am Brenner. Der Spiritusbrenner soll durch den warmen aufsteigenden Luftstrom die Keime aus der Luft fernhalten und dient zum Abflammen der Impföse, der Glaspipette oder der Reagenzglasränder. Er sollte in der Mitte des Arbeitsfeldes platziert werden und alles, mit dem hantiert werden muss, in einem Umfeld von maximal 30 cm stehen. Der Spiritusbrenner sollte nur brennen wenn Sie ihn benötigen. Denken Sie daran das Umfeld von Papier und Kleidung frei zu halten (Brandgefahr, Sterilität!). Da man meist nur eine Hand frei hat, sollte man sich vor Beginn den Arbeitsablauf überlegen und z. B. Flaschen vorher aufdrehen oder schwergängige Deckel von Reagenzgläsern lockern. Dabei haben Sie den Vorteil, dass Sie zu mehreren zusammen arbeiten und der bzw. die Partner eine helfende Hand zur Verfügung stellen können. Alle sterilen Gefäße werden nur zur Entnahme oder Zugabe von Material geöffnet. Nicht offen stehen lassen! An der Flamme arbeiten. Arbeiten mit Mikroliterpipetten Sie haben zwei Mikroliterpipetten mit zwei unterschiedlichen Volumenbereichen zur Verfügung: µl (gelbe Spitzen verwenden) und µl (blaue Spitzen verwenden). Diese Pipetten sind Präzisionsgeräte, mit denen sorgfältig umgegangen werden muss. Machen Sie sich vor der Benutzung mit der Pipette vertraut. Sie dürfen nicht mit Gewalt aufgestoßen werden, z. B. zum Bestücken mit

2 den Spitzen. Der angegebene Volumenbereich darf nicht über- oder unterschritten werden (Volumeneinstellrad nicht überdrehen!). Keine Flüssigkeit in die Pipette saugen, d. h. beim Pipettieren das Volumen langsam und nicht ruckartig ansaugen. Den Schaft nicht in die Kultur eintauchen. Sollte das doch einmal passieren, reinigen Sie bitte den Schaft mit einem Papiertuch, das mit Sterilium oder Alkohol getränkt ist. Pipette nie so geneigt halten, dass die angesaugte Flüssigkeit in die Pipetten laufen kann. Zum Abwerfen der Spitze hat die Pipette eine Spitzenabwurftaste. Die benutzten Spitzen werden im Tischmüllbehälter entsorgt. Die Pipettenspitzen in den Boxen sind autoklaviert und damit steril. Also lassen Sie die Boxen nicht mit geöffnetem Deckel stehen. Arbeiten mit Glaspipetten Für das Abmessen größerer Volumina haben Sie in den Alubehältern auf Ihrer Bank sterile Glaspipetten. Je einen Behälter mit 10ml-Pipetten und einen mit 1ml-Pipetten (falls Sie nicht mit Mikroliterpipette arbeiten wollen). Entsprechende Kennzeichnungen finden Sie auf dem Deckel. Die Alubehälter sollen nicht aufrecht auf dem Tisch stehen, sondern liegen! Wenn sie umfallen, sind die enthaltenen Pipetten kaputt! Es gibt für die Benutzung der Glaspipetten zwei Pipettierhilfen, grün für Pipetten mit größerem Volumen und blau für die 1ml-Pipetten. Fassen Sie die Pipetten nicht am vorderen Ende an (dieses taucht dann in die Flüssigkeit), sonst sind sie nicht mehr steril. Drücken Sie die Glaspipetten nicht mit Gewalt in die Pipettierhilfe! Die Pipetten brechen und Sie können sich verletzen. Auch hier gilt: Saugen Sie keine Flüssigkeit in die Pipettierhilfe! Allgemeines Zum Arbeiten im Labor gehört das Aufräumen der Plätze zwischen den Versuchen (wenn es der Ablauf erlaubt) und am Ende Ihres Versuchstages! Der Tischabfallbehälter ist nur für den Pipettenspitzen-Abfall. Die benutzen Glaspipetten (nicht die Mikroliterpipetten!) kommen in die Eimer, jeweils vorne an Ihren Bankreihen (vorsichtig hinein geben, keinen Glasbruch verursachen, Spitzen nach unten!). Diese Eimer sind KEINE ABFALLBEHÄLTER. Papiertücher und andere Abfälle können Sie in die Mülleimer vorne und hinten im Praktikumsraum oder unter der rechten Spüle entsorgen. Abgebrannte Streichhölzer gehören ebenfalls in die Abfalleimer! Verwendete Objektträger müssen nicht gereinigt werden, Sie können sie in dem Behälter für Glasabfälle entsorgen, der vorne auf dem Tresen bereitgestellt wird. Der Inhalt der Färbewannen kann in den Ausguss, wenn nichts anderes angegeben wird. Die Färbewannen kurz mit Leitungswasser ausspülen, mit einem Papierhandtuch trocknen und wieder an den Platz stellen. Die Färbegitter kurz reinigen und zurück auf die Färbewannen legen. Nach dem Mikroskopieren schalten Sie die Lampe aus, reinigen die Objektive und den Objekttisch und drehen den Revolver mit den Objektiven in die Ausgangsposition (Objektiv für die kleinste Vergrößerung).

3 Die Reagenzgläser werden von der Beschriftung befreit. Dazu verwenden Sie bitte das bereitgestellte Aceton (Spritzflasche am Spülbecken) und ein Papiertuch. Anschließend spülen Sie die Reagenzgläser einmal kurz mit Leitungswasser aus und legen Sie sie in die bereitgestellten Waschschüsseln. Die Reste in den Reagenzgläsern können einfach in den Abfluss geschüttet werden. Die leeren Reagenzglasgestelle werden vorne auf dem Tresen abgestellt. Wischen Sie den Arbeitstisch sauber. Verlassen Sie Ihre Plätze am Ende genauso sauber und aufgeräumt wie Sie sie vorgefunden haben! Beschriftung der Kulturplatten Grundsätzlich sollen Sie Ihre Proben immer beschriften, vor allem Nähragarplatten, die eingesammelt und bis zum nächsten Versuchstag bebrütet werden. Das Beschriften erfolgt immer vor der Verwendung. Kennzeichnen Sie die Platten folgendermaßen: Bei den Agar-Platten wird immer der Boden beschriftet (Deckel können vertauscht werden!). Nur so können die Platten zugeordnet werden und Sie Ihre Versuche auswerten. Die Beschriftung sollte nicht zu groß und am Rand entlang sein, nicht mitten auf dem Boden, sonst können Sie Ihre Ergebnisse nicht beurteilen. Gekennzeichnet werden die Kulturplatten jeweils mit dem Buchstaben für Ihren Kurs (A-H), Ihrer Gruppen-Nummer (die Bänke sind durchnummeriert von 1-12, die Nummer steht vorne auf dem Tisch), eventuell Versuchsnummer oder Proben-Kennzeichnung. Reagenzgläser immer oben beschriften, am besten mit einem gut erkennbaren Kürzel (z. B. Gruppennummer), damit Sie Ihre eigenen wieder erkennen, wenn Sie sie z. B. ins Wasserbad oder den Autoklaven stellen. Die meisten Flüssigkulturen von Bakterien bzw. Hefen und der Weichagar werden bereits von uns entsprechend aliquotiert. Sie erhalten außerdem fertig gegossene Kulturplatten. Diese sind fast immer durch einen Strichcode gekennzeichnet: LB LB+Kanamycin YEPD SCD Tryp(minus) Gly+ Adenin ein blauer Strich zwei schwarze Striche ein roter Strich ein schwarzer Strich ein grüner Strich Für Bakterien verwendet man LB-Platten oder Medium. Für Hefen dagegen YEPD-Platten oder -Medium. Anmerkungen zu einzelnen Versuchen Ansetzen eines Mediums zum Kulturplatten gießen (Versuch 1.1) Die Substanzen werden in sogenannten Waagschalen abgewogen. Die verschiedenen Stoffe werden nacheinander abgewogen und jeweils in die Glasflasche für das Medium gegeben. Chemikalien, die einmal aus dem Originalbehälter entnommen wurden, bleiben auch draußen (Gefahr von Verunreinigung)! Sollten Sie versehentlich zu viel genommen haben, wird der Rest verworfen. Man

4 kann den Überschuss so gering wie möglich halten, wenn man überlegt und vorsichtig abwiegt. Zum Auffüllen auf das erforderliche Volumen, verwenden Sie das VE-Wasser aus dem entsprechend gekennzeichneten Hahn an den Waschbecken. Die Markierung in den Glasflaschen ist genau genug. Mischen durch Schütteln oder Umschwenken. Danach den Deckel nicht fest zudrehen, da sonst beim Autoklavieren der Überdruck nicht entweichen kann (Explosionsgefahr!). Nähragarplatten gießen Das noch heiße Medium (Papierhandtuch als Hitzeschutz verwenden) noch mal durch vorsichtiges Umschwenken (möglichst keine Luftblasen oder Schaum verursachen) mischen. Die vorher beschrifteten Platten entweder als Turm aufbauen und von unten nach oben gießen, indem man jeweils die darüber liegenden noch leeren Petrischalen mit dem Deckel der Platte, welche Sie gerade befüllen wollen, anhebt. Oder alle Petrischalen nebeneinander in Brennerreichweite stellen und einzeln gießen. Deckel immer nur zum Gießen öffnen. Füllen sie nicht zu wenig Medium in die Platten. Sie trocknen sonst zu schnell aus. Das Medium sollte ca. 0,5 cm hoch in der Petrischale stehen. Dafür benötigen Sie ungefähr 40 ml pro Platte. Die von Ihnen angesetzte Menge (200 ml) reicht gut für die 5 Platten. Hinweise zum Umgang mit Nähragarplatten (Versuch 2.1) Mikroben-Ausstriche mit der Impföse Die Impföse wird immer ausgeglüht, bevor man sie benutzt und muss danach abkühlen, damit die verwendeten Bakterien oder Hefen nicht abgetötet werden. Dies kann beschleunigt werden, z. B. durch Einstechen in den Nähragar oder Anlegen innen am Reagenzglas. Für Ausstriche sollte die Impföse am besten etwas gebogen sein und dann nur sehr vorsichtig über den Agar gezogen werden. Die Oberfläche der Kulturplatten soll nicht verletzt werden. Nicht den Agar pflügen! Verdünnungsausstrich / Quadrantenausstrich (Versuch 2.2 A) Die Impföse wird ausgeglüht und nach dem Abkühlen entnimmt man aus der bereitgestellten Hefe- Mix-Platte mit der Öse etwas Mikrobenmaterial. Dieses verteilt man durch vorsichtiges Ausstreichen mit drei Strichen an einer Seite der Platte. Danach glüht man die Öse erneut aus und verteilt das ausgestrichene Material weiter, indem man wieder drei Striche zieht, bei denen man zuerst durch alle drei Enden der vorherigen Striche, dann nur noch durch zwei und schließlich nur noch durch ein Strichende zieht. Dieses Verfahren wiederholt man noch weitere zwei Mal, immer mit neu ausgeglühter Impföse, und vereinzelt so die Mikroben immer weiter. Wir geben Schablonen mit dem vorgesehenen Muster aus, die Sie unter die Kulturplatte legen können. Verdünnungsreihen (Versuch 2.2 B, Versuch 4.1 und 5 b) Im Praktikum werden serielle oder fortgesetzte Verdünnungen hergestellt. Sie dienen z. B. der Vereinzelung von Zellen, um sie besser zählen zu können. Die Reagenzgläser sollten durchnummeriert oder anders gekennzeichnet werden, um eine Verwechslung der Verdünnungsstufen zu vermeiden. Mit einer 10 ml Glaspipette zuerst die angegebene Menge Puffer oder Lösungsmittel vorlegen. Dabei kann man für alle Reagenzgläser die gleiche Pipette verwenden. Für die Verdünnung der Mikroben benötigt man eine neue Pipette, kann aber auch hier durchgehend die gleiche Pipette verwenden, so lange man beim Pipettieren diese immer durch mehrmaliges auf-und abziehen des Puffers ausreichend spült. Das dient gleichzeitig der Durchmischung. Pipettiert wird dabei von der geringsten Verdünnung zur stärksten Verdünnung. Anschließend arbeitet man von der stärksten Verdünnung zur geringsten Verdünnung, z. B. beim Auftragen auf die Nähragarplatte, und kann so wieder mit nur einer Pipette bzw. Pipettenspitze

5 arbeiten. Das heißt, für die im Praktikum herzustellenden Verdünnungsreihen, benötigen Sie, egal mit wie vielen Verdünnungsstufen Sie arbeiten müssen, insgesamt nur 3 Pipetten. Arbeiten mit Weich-Agar (Versuch 3.2 und Versuche 4.1 und 4.2) Beim Weich-Agar handelt es sich um ein Nährmedium mit einer geringen Konzentration an Agar (0,5% oder 0,7%). Dadurch wird der Agar weniger fest und stabil als bei normalen Nähragarplatten. In den Weichagar können z. B. Mikroben eingebracht werden, um so einen Mikrobenrasen auf einer Nähragarplatte wachsen zu lassen. Der Weichagar ist im kalten Zustand fest. Sie erhalten ihn aufgeschmolzen und entsprechend aliquotiert im Reagenzglas mit einer Temperatur von 70 C bis 80 C. Da die Mikroben diese Temperaturen nicht überleben würden, muss der WA erst abkühlen. Als Maßstab dient Ihr Temperaturempfinden mit der Hand. Wenn Sie das RG länger mit bloßer Hand anfassen können, ist er kalt genug. Anschließend gießen sie den WA in das RG mit den Mikroben (WA zu den Mikroben gießen, nicht umgekehrt! Bessere Durchmischung). Langsam am Rand entlanglaufen lassen. Anschließend gießen Sie die Mischung auf die Nähragarplatte. Arbeiten Sie zügig, damit der WA nicht schon beim Gießen erstarrt. Sie wollen eine geschlossene, gleichmäßig glatte Oberfläche. Bis der WA auf den Kulturplatten fest geworden ist, sollten Sie die Platten nicht mehr bewegen, sonst entstehen Wellenmuster auf der Oberfläche. Auf keinen Fall die Platten auf den Kopf drehen. Replikaplattierung/Stempeln (Versuch 3.3) Dazu benutzt man einen Stempel (Holzklotz) auf dem ein sogenanntes Replika- oder Samttuch mit einem Metallring befestigt wird. Das Stempeltuch ist steril und sollte mit den Fingern nur außen am Rand angefasst werden, um die Stempelfläche nicht zu kontaminieren (Hände vorher desinfizieren, steriles Arbeiten!). Das Tuch hat eine glatte und eine samtige Oberfläche. Achten Sie darauf, dass das Tuch mit der Samtoberfläche nach oben auf dem Stempel liegt. Durch die samtige Oberflächenstruktur wird ein Verschmieren der übertragenen Zellen verhindert. Sie wollen Zellen eines Koloniemusters auf andere Nähragarplatten übertragen, damit Sie später Vergleiche über deren Wachstum anstellen können. Dazu müssen die Ausgangsplatte und alle gestempelten Platten in der Gleichen Orientierung gestempelt werden. Dies erreicht man durch das Markieren des Stempels oder Metallringes (Markierung ist meist schon vorhanden) und der Kulturplatten. Indem Sie die Markierung der Platte und des Stempels übereinander bringen, wissen Sie, in welcher Orientierung Sie gestempelt haben. Die Ausgangsplatte wird kopfüber (ohne Deckel) auf den Stempel gelegt und vorsichtig mit zwei Fingern auf das Tuch gedrückt. Dabei überträgt sich ein Teil der Zellen des Koloniemusters. Anschließend überträgt man das Muster durch auflegen frischer Platten.