Mikrobiologische Methoden

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1 Eckhard Bast Mikrobiologische Methoden Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken Spektrum Akademischer Verlag

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Erste Hilfe bei Laborinfektionen Sterilisation und Keimreduzierung Abtötung durch Hitze Feuchte Hitze Autoklavieren (Dampfsterilisation) ilisation... Kontrolle der Dampfsterilisation Tyndallisieren Heißluftsterilisation Kontrolle der Heißluftsterilisation Ausglühen und Abflammen Chemische Sterilisation und Desinfektion Desinfektion und Keimreduzierung durch chemische Mittel Händedesinfektion Gerätedesinfektion 3.3 Bestrahlung UV-Strahlung Sterilfiltration Sterilfiltration von Flüssigkeiten I Filtermaterialien Filtrationsgeräte Sterilisation von Filter und Filtrationsgerät Durchführung der Sterilfiltration Sterilfiltration von Gasen Tiefenfilter Membranfilter

3 vlll Inhaltsverzeichnis 4 Steriles Arbeiten. Sicherheit im Labor Räumliche Voraussetzungen Grundregeln des sterilen Arbeitens Die Reine Werkbank Prinzip, Gerät Ausstattung Überprüfung Regeln für das Arbeiten an der Reinen Werkbank Kultivierung von Mikroorganismen Nährböden Einteilung der Nährböden Die Nährbodenbestandteile Wasser. Wasseraufbereitung durch Entsalzung Auffangen und Lagerung des r Kohlenstoff- und Energiequellen Stickstoff- und Schwefelquellen Mineralstoffe Wachstumsfaktoren Verfestigungsmittel 64 Agar Gellan Gelatine Das ph-meter Indikatorfarbstoffe Puffer Kommerzielle Herstellung von Nährböden Lagerung gebrauchsfertiger Nährböden Kulturgefäße Die Werkstoffe Glas Kunststoffe Petrischalen, Vielfachschalen Herstellung von Agarplatten Kulturröhrchen Schrägagarröhrchen Kolben und Flaschen Verschlüsse Watteverschlüsse Siliconschwammverschlüsse Überwurfkappen

4 Inhaltsverzeichnis Ix Schraubkappen Reinigung der Kulturgefäße und anderer Laborgeräte... Y I Reinigung neuer Glasgeräte. Y Reinigung gebrauchter Glas-... Y5.. Manuelle Reinigung... Y5 Maschinelle Reinigung... Y7 5.3 Entnahme von Zellmaterial, Impftechniken Das Impfmaterial Grundregeln des Überimpfens Impfösen und -nadeln Pipetten Meß- un Pasteurpipetten Spritzen Drigalskispatel Lederbergstem 5.4 Bebrütung Temperatur Licht Aerobe Bebrütung Oberflächenkultur Feste Nährböden Zweiphasenkultur Deckenkultur Submerskultur Kultur in flacher Schicht Schütteln Rühren, Einleiten von Luft Mikroaerobe Bebrütung Anaerobe Bebrütung Redoxpotential Das Arbeiten mit Anaerobiern Redoxindikatoren.... I Zusatz reduzierender Stoffe Kultur in hoher Schicht, Fla Wright-Burri-Röhrchen Der Anaerobentopf... I32 6 Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen I Anreicherungskultur Aerobe freilebende N2-Fixierer: Azntobacter chroococcum Saccharolytische Clostridien Kartoffelkultur N2-fixierende iuni pasteuranum I.3 Sulfatreduzierende Bakterien: Desulfovibrio Ammoniakoxidierende Bakterien I.5 Farblose schwefeloxidierende Bakterien: Thiobacillus thirpirus

5 x Inhaltsverzeichnis Bacillus (einschließlich Paenibacillus) Milchsäurebakterien aus Milch und Sauermilchprodukten Streptokokken s Lactobacillus-Arten (A Schwefelfreie Purpurbakterien Gewinnung von Reinkulturen Ausstrichverfahren Durchführung des Ausstrichverfahrens Reinheitskontrolle Schüttelagarkultur Verdünnung in flüssigem Nährmedium Aufbewahrung und Beschaffung von Reinkulturen Kurz- und mittelfristige Aufbewahrung Periodisches Überimpfen Aufbewahrungsgefaße Nährböden Überimpfung und Bebrütung Lagerung Aufbewahrung unter Paraffinöl Trocknen Trocknen in Gelatine Langfristige Aufbewahrung Trocknen unter Vakuum Schutzstoffe Vakuumtrocknung o ieren Gefriertrocknung Reaktivierung der Trockenkulturen Tiefgefrieren Aufbewahrungsge Schutzstoffe Einfrieren und Lagern im Tiefkühlschrank Aufbewahrung über Flüssigstickstoff Reaktivierung der tiefgefrorenen Kulturen Beschaffung der Kulturen von Kulturensammlungen Lichtmikroskopische Untersuchung von Mikroorganismen Grundlagen der Lichtmikroskopie Vergrößerung Auflösungsvermögen Kontrast Aufbau des Mikroskops Mechanische Bauteile

6 Inhaltsverzeichnis XI Abbildende Optik Lichtfilter, (Hellfeld-)Kondensor Köhlersche Beleuchtung Das Arbeiten mit dem Mikroskop Inbetriebnahme des Mikroskops Mikroskopieren im Hellfeld Das Arbeiten mit der Ölimmersion Kondensor Präparate... Einschlußmittel Besonderheiten des Phasenkontrastbildes... Haloeffekt... Farbstiche Längenmessungen unter dem Mikroskop Pflege und Reinigung des Mikroskops Die häufigsten Störungen beim Mikroskopieren und ihre Ursachen, 8.4 Untersuchung lebender Bakterien und Hefen Einfaches Lebendpräparat Prüfung auf Beweglichkeit Färbungen am Lebendpräparat I Nachweis organischer Speicherstoffe.... Polysaccharide Darstellung vo Objektträgerkultur Allgemeine Methoden Durchführung Einfache Färbungen Färbung mit

7 XI1 Inhaltsverzeichnis Färbung mit Kristallviolett Färbung mit Karbolfuchsin Differentialfärbungen I Gramfärbung Färbung säurefester Stäbchen (Ziehl-Neelsen-Färbung) Cytologische Färbungen Endosporenfärbung Nachweis von Polyphosphatgranula Geißelfärbung Bestimmung der Zellzahl und Zellmasse in Populationen einzelliger Mikroorganismen Bestimmungsfehler Zufällige Fehler Mittelwert, Streuungsmaße I.2 Konfidenzintervall des Mittelwerts Poissonverteiiung 9.2 Bestimmung der Zellzahl I Gewinnung Probenahme Auswahl der Proben.... Dispergierverfahren... Anlegen von Verdünnungsreihen Bestimmung der Gesamtzellzahl.... e... Berechnung des Zählergebnisses... Epifluoreszenzmikroskopie...,,Vitalfärbungen" Bestimmung der Lebendzellzahl (Keimzahl) Dispersions- und Verdünnungsmittel Plattenverfahren Gußplattenverfahren Spatelplattenverfahren

8 Inhaltsverzeichnis Auszählung der Kolonien Berechnung des Zählergebnisse Schüttelagarkultur irn Hochschichtr Mernbranfiltertechnik Filter Filtrationsgeräte... Probenmenge... Nährböden Filtration (..most probable number") Prinzip, Durchführung Verteilungstyp, Genaui Verwendung und Nachteile der Methode... 3 I9 9.3 Bestimmung der Zellmasse Bestimmung der Feuchtmasse Bestimmung der Trockenmasse Trockenmassebestimmung mit Abtrennung der Zellen durch Zentrifugation 322 Grundlagen der Zentrifugation DieZentrifuge Rotoren Zentrifugengefäße 325 Durchführung der Bestimmung Trockenrnassebestimmung mit Abtrennung der Organismen durch Membranfiltration Filter Durchführung d Systematische Fehler Proteinbestimmung Ernte der Zellen Biuretrnethode Durchführung Störende Substanzen.... Bewertung der Methode Methode nach Lowry et al... Prinzip Durchführung Berechnung des Proteingehalts 342 Störende Substanzen Bewertung der Methode Trübungsrnessung Grundlagen der Trübungsmessung Das Photometer Lichtquellen Monochromator

9 x1v Inhaltsverzeichnis Lichtfilter Weiterführende Literatur Allgemeine und zusammenfassende Literatur Lehrbücher Lexika Mikrobiologische Methoden Spezielle Literatur Bezugsquellen Produktgruppen und ihre Bezugsquellen Firmenanschriften Konzentrations- und Gehaltsangaben Verwendete Zeichen und Abkürzungen Abbildungsnachweis Sachverzeichnis