1. Probenaufbereitung
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- Christa Haupt
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1 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 1. Probenaufbereitung Die analytischen Proben können aus einer Vielfalt Quellen stammen: - gasförmige wie Ozon, CO2 und Methan aus der Natur, NOx und SOx aus Abgasen der Industrie oder von Autos; flüssige wie Trinkwasser und Grundwasser, Blut und Urin oder Abwasser der Industrie; feststoffartige wie Lebensmittel, Haushaltabfälle, oder mit Industrieabfall verschmutzte Erde usw. Sie können in den verschiedensten Formen vorliegen, z.b. Aerosol, Emulsion oder Suspension. Gas Aerosol Flüssigkeitstropfen feste Teilchen Emulsion (2 unmischbare Flüssigkeiten) Flüssigkeit? Suspension (unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit) Feststoff Um eine sichere und genaue Analyse durchzuführen, ist meist eine Probenaufarbeitung notwendig. Die Probenvorbereitungsmethoden sind stark von den nachfolgenden Analysemethoden und auch von Analyteigenschaften abhängig. Das Ziel der Vorbereitung ist: 1. Die Analyten in Lösung auf eine geeignete Konzentration und in die richtige Form (neutral / ionisch) zu bringen; 2. Die Analyten von störenden Beimengungen wie unlöslichem Feststoff / Polymer, Teer, Farbstoff vorzeitig zu befreien. In allen Vorbereitungstufen sollen die Proben möglichst im Original-Zustand gehalten werden. Zudem ist auch der Zeit- und Kostenaufwand zu beachten. 1
2 1.1 Extraktion aus flüssigen Proben Flüssig-flüssig-Extraktion mit Scheidetrichter Ausschütteln mit einem Lösungsmittel, das mit dem Probe-Lösungsmittel nicht mischbar ist; Mehrmals mit kleinem Volumen ausschütteln ist viel effizienter als einmal mit grossem Volumen; Zusatz von Salzen erhöht oft die Extraktions-Effizienz (Aussalzeffekt); ph beachten, falls Säure oder Basen extrahiert werden sollen; Über- oder Unterdruck beachten. Organisches Lösungsmittel V/V: 1/5 1/3 von wässerigen Lösung C 0 V 1 V 2 organische Phase (oder wässige Phase) wässrige Phase (oder organsiche Phase) Scheidetrichter Es gibt automatisierte Systeme für Mehrfachextraktionen. Festphasen-Extraktion Selektive Adsorption der Analyten auf festem Adsorbens (in einer Kartusche) verwendet werden aus der HPLC bekannte Phasen wie Kieselgel, Ionentauscher Die Probelösung wird über die Kartusche laufen gelassen, wo die Analyten zurückgehalten werden Mit wenig Volumen eines geeigneten Lösungsmittel werden die Analyten vom Adsorbens heruntergewaschen und somit gleichzeitig aufkonzentriert Die Kapazität der Kartusche resp. der Durchbruch der Analyten ist zu beachten Konditionieren Anreicherung Elution Fritte Adsorbens Fritte Adsorbens: Kieselgel (Silicagel), Aluminiumoxid, Ionenaustauscher, Polymere Festphasen-Mikroextraktion (solid phase micro extraction: SPME) 2
3 Adsorption und Anreicherung von Analyten an einer dünnen Schicht eines festen Adsorbens, das auf einer Quarzfaser aufgebracht ist ( umgestülpte GC-Säule ) Anreicherung aus Flüssigkeiten und Gasen möglich Kein Einsatz von Lösungsmitteln Durch speziellen Verschlussmechanismus kann die Probe direkt in einen GC- Injektor eingebracht werden Thermodesorption der Probe SPME Extraktion aus Wasserprobe SPME-Faser Polydimethylsiloxan Polyacrylat Polydimethylsiloxan/ Divinylbenzen 1.2 Extraktion aus festen Proben Proben sollen getrocknet und zerrieben werden, bevor sie zur Bearbeitung kommen. Batch-Extraktion: Probe wird möglichst gleichmässig zerkleinert (homogenisiert) Zugabe von Lösungsmittel zur Probe Schütteln der Probe Abdekantieren / Abzentrifugieren / Abfiltrieren Oft geringe Extraktions-Effizienzen Soxhlet-Extraktion Extraktion im heißen Lösungsmittel in einem Soxhlet-Extraktor Stets erneuertes Lösungsmittel Problematisch bei thermisch labilen Analyten Extraktion dauert oft Stunden 3
4 Ultraschall-Extraktion Erleichtert/beschleunigt den Extraktionsvorgang aufgrund der hohen Drücke/Temperaturen, die der Ultraschall verursacht Besser einsetzbar bei thermisch labilen Analyten als Soxhlet. Die sehr kurzzeitigen Temperaturschwankungen haben oft keinen negativen Einfluss auf Proben. Mikrowellen-Extraktion (mirowave assisted extraction: MAE) Probe und Lösungsmittel werden in einem druck- und temperaturstabilen Behälter in den Mikrowellenofen gestellt. Mikrowellenenergie wird auf die feste Probe übertragen und erhitzt sie Einsatz von polaren Lösungsmitteln nötig, apolare Lösungsmittel lassen sich von Mikrowellen nicht erhitzen Erwärmung des Lösungsmittels viel schneller (wenige Minuten) als mit herkömmlichen Aufheizmethoden. Probe wird gleichmäßig erhitzt Es kann unter erhöhtem Druck gearbeitet werden Oft dauert die Extraktion viel kürzer als bei einer Soxhlet-Extraktion Überkritische Fluid-Extraktion (supercritical fluid extraction: SFE) Superkritisches Fluid: Wenn eine Substanz so hoch erhitzt wird, dass sie auch durch extrem hohen Druck nicht verflüssigt werden kann, hat sie den sogenannten kritischen Punkt überschritten Fluide haben spezielle Eigenschaften: die Dichte kann durch Temperatur- und Druckänderungen erheblich verändert werden; die höheren Diffusionskoeffizienten (im Vergleich zu Flüssigkeiten) haben verbesserte Extraktionseigenschaften zur Folge Anstelle einer Flüssigkeit wird zur Extraktion ein überkritisches Fluid eingesetzt: Typischer Arbeitsbereich: bis C, bis 400bar Es kommen (kaum) organische Lösungsmittel zum Einsatz 4
5 CO 2 ist das am häufigsten verwendete Fluid. Apolare bis mittelpolare Substanzen können extrahiert werden. Geringe Zusätze (z.b. Methanol, Säuren, Amine) können die Löseeigenschaften des CO 2 verändern Nach erfolgter Extraktion wird das Fluid in eine Auffangvorrichtung geleitet und entspannt. Damit entweicht das CO 2 als Gas, und die Analyten bleiben zurück SFE kann auch direkt mit HPLC oder GC gekoppelt werden 1.3 Aufkonzentrieren der Extrakte Rotationsverdampfer (Rotavapor) Abdampfen vom Lösungsmittel in einem Wasserbad (meist leicht geheizt) unter Anlegen eines Vakuums Das verdampfte Lösungsmittel kondensiert in einem Kühler und wird aufgefangen Die Probe wird rotiert, um Siedeverzüge zu verhindern Ein Rotavapor kommt meist zu Einsatz, wenn größere Volumina eingeengt werden sollen Verdampfen im Stickstoffstrom Einengen von Proben bis zu wenigen 100µl oder bis zur Trockne Mögliche Verluste der Analyten beachten 1.4 Aufreinigung der Extrakte Nach Extraktion und Einengen sind bei vielen Proben noch weitere Aufarbeitungsschritte notwendig, so z.b. Abtrennen von chemisch ähnlichen aber nicht interessierenden Substanzen, die eine chromatographische Trennung oder die nachfolgende Detektion stören könnten. Säulenchromatographie HPLC-Säulenmaterialien 5
6 Trennung von Analyten und störenden Komponenten. Die Analyten werden auf der Säule (~ cm Durchmesser) zurückgehalten, die störenden Komponenten jedoch eluieren, oder umgekehrt. Festphasen-Extraktion Die oben erwähnte Festphasen-Extraktion kann auch zur Reinigung von störenden Komponenten verwendet werden Es steht eine grosse Vielfalt an verschiedenen stationären Phasen zur Verfügung Fraktionierung mit HPLC Durch fraktioniertes Auffangen der Analyten können ebenfalls störende Substanzen effektiv abgetrennt werden (präparative HPLC). 1.5 Übersicht der Probenaufbereitung Natürliche Quelle in gasförmiger, flüssiger oder feste Form Analyten Künstliche Quelle aus fester Matrix von störenden Substanzen abtrennen von unlöslichem Polymer/Teer von störenden Substanzen Anreicherung in Lösung Verdünnung auf geeigneter Konzentration Analytenproben Probenaufbereitung Homo- und Heterogenes Stoffgemisch Probenarten Gas Flüssigkeit Vortrennung und Anreicherung Aerosol Flüssigkeitstropfen feste Teilchen Emulsion (2 unmischbare Flüssigkeiten) Adsorption Filtration Extraktion LLE, SPE, SPM, SPME Aufkonzentrierung Aufreinigung GC HPLC EP mit Feststoff Suspension (unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit) Löslich oder unlöslich Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE MS NMR IR UV Messung 6
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