Reinigung, Faltung und Charakterisierung von GFP

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1 Reinigung, Faltung und Charakterisierung von GFP Erster Praktikumsteil zum Modul Proteinchemie 2 ifmb Institut für Mikrobiologie der Leibniz-Universität Hannover

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 4 2 Theorie GFP Expressionssystem Proteinfaltung Grundlagen Inclusion bodies IB Präparation und Faltung von GFP Spektroskopie CD Spektroskopie Fluoreszenzspektroskopie Praktikum Lösungen Zellanzucht und ernte Anzucht Ernte Zellaufschluss und IB-Präparation Aufschluss IB Präparation Ni IMAC Äquilibrierung Beladen und Waschen Elution Dialyse Proteinkonzentrationsbestimmung SDS PAGE Herstellung der Gele Beladung und Lauf Gelscan und färbung

3 3.7 CD Spektroskopie Messung Fluoreszenzspektroskopie Protokoll 17 Generelles Einleitung Materialien und Methoden Ergebnisse und Diskussion Literaturverzeichnis Format Einheiten Gene und Proteine Rechtschreibung Abbildungen, und: Präsens oder Perfekt?

4 1 Einleitung Die Produktion großer Proteinmengen ist sowohl für die grundlagenorientierten molekularen Biowissenschaften als auch die Biotechnologie von immenser Wichtigkeit. Erstere benötigen hochreines Protein zur Aufklärung von Strukturen und Wirkmechanismen, während letztere große Menge für die Herstellung von Medikamenten (Insulin) oder Enzymen (in Waschmitteln etc.) benötigt. In einem Großteil aller Fälle wird dabei auf ein bakterielles Produktionssystem zurückgegriffen, welches Proteine einfach und effizient produzieren kann. Damit erlangt auch die Charakterisierung von Proteineigenschaften große Bedeutung: Welche Struktur besitzt mein Protein? Wie stabil ist es? Sind seine Eigenschaften unter der Bedingung X die gleichen wie unter Bedingung Y? In diesem Praktikum wird anhand des Proteins GFP gezeigt, wie Proteine überproduziert werden können, wie sie von einer aggregierten Form in ihre native und damit funktionsfähige Form überführt werden können und mit welchen Methoden die Struktur und Stabilität von Proteinen analysiert werden kann. 2 Theorie 2.1 GFP Das Grün Fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) ist ein etwa 27 kda großes Protein, welches 1962 von Shimomura Osamu aus der Qualle Aequorea victoria isoliert werden konnte. In seiner natürlichen, zellulären Umgebung absorbiert es blaues Licht, welches vom Protein Aequorin produziert wird und strahlt es als grünes Licht wieder ab (Fluoreszenz). Nachdem Anfang der 1990er Jahre die Klonierung des Gens und seine rekombinante Expression in E. coli gelang, zeigte sich, dass GFP (neben blauem Licht) keine weiteren Cofaktoren benötigt und stabil aus dem Bakterium gereinigt werden kann. Darüberhinaus zeigte die Aufklärung der Kristallstruktur, dass es die Form einer aus 12 β Faltblättern aufgebaute Tonne einnimmt (sog. β barrel, Abb.2.1), in deren Mitte ein Chromophor mittels zweier kurzer α Helices eingespannt vorliegt. Dieser Chromophor entsteht autokatalytisch durch die Zyklisierung des Proteinrückgrats der Serin 65, Tyrosin 66 und Glycin 67, wodurch die Absorption blauen 4

5 Lichts mit anschließender Fluoreszenz ermöglicht wird (Abb.2.1). N und C Terminus des Proteins liegen zugänglich auf der Außenseite des Proteins, sodass sich GFP auch für Fusionsexperimente sehr gut eignet. Durch geringe Veränderungen der Aminosäuresequenz konnten in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszierende Varianten von GFP hergestellt werden, unter anderem die blau, gelb und rot fluoreszierenden Varianten CFP, YFP und RFP. Für die Entdeckung, Klonierung und Charakterisierung erhielten Martin Chalfie, Shimomura Osamu und Roger Y. Tsien 2008 den Nobelpreis für Chemie. Abbildung 2.1: Struktur des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP). Links: Darstellung der Oberfläche des Proteins. Rechts: Darstellung der β barrel Sekundärstruktur mit dem innenliegenden Chromophor (grün). 2.2 Expressionssystem Für die Reinigung und Analyse von GFP bietet sich die rekombinante Expression des entsprechenden Gens in E. coli an. Im Praktikum wird der E. coli Stamm BL21(DE3) verwendet. Er ist ein für hohe Proteinproduktion optimierter Stamm, welcher in der hier verwendeten Form noch ein auf dem Genom eingefügtes Phagen RNA Polymerasegen (für die T7 Polymerase) trägt. Kontrolliert wird die Expression dieses zusätzlichen Gens durch Voranstellung des lac Promotors, welcher bekanntlichermaßen durch Zugabe von Laktose (oder ihres nicht abbaubaren Analogons IPTG) induziert werden kann. Wird nun ein Plasmid in die Zelle eingebracht, welches ein Gen mit T7 Polymerase Bindesequenz enthält, wird dieses von der sehr effizienten T7 Polymerase erkannt und die entsprechende mrna mit einer hohen Transkriptionsrate produziert. 5

6 Abbildung 2.2: Detailansicht des durch zwei Helices mit der β barrel Struktur verknüpften GFP Chromophors. Die durch Autokatalyse entstandene Bindung ist mit einem Pfeil markiert. Im Rahmen des Praktikums wird ein solches Konstrukt, gfp H6 im pet Vektorsystem, verwendet. Das Gen besitzt einen 3 Anhang an der gfp Basensequenz, welcher im fertigen Protein zur Anfügung von sechs Histidinen führt (Hexahistidin-Tag, His-Tag), was für die Reinigung des Proteins von entscheidender Bedeutung sind Proteinfaltung Grundlagen Alle Proteine müssen eine gefaltete Konformation einnehmen, um ihre zelluläre Aufgabe übernehmen zu können. Die Faltungsreaktion läuft unter physiologischen Bedingungen spontan ab, und führt von einer größtenteils ungefalteten Polypeptidkette über die Ausbildung kleinerer Strukturelemente bis zu einem funktionalen Protein. Dieser Weg lässt sich aus dem natürlichen Bestreben des Systems (Protein + Umwelt) verstehen, die Freie Reaktionsenthalpie (Gibbs Energie, G) zu minimieren. Jede Veränderung, welche G verringert (also Gvorher Gnachher = G= negativ), findet spontan statt. Der korrekt gefaltete Zustand eines Proteins muss folglich also jener Zustand 6

7 sein, welcher bei physiologischen Verhältnissen unter allen möglichen Konformationen des Proteins die geringste Freie Reaktionsenthalpie besitzt und damit den größten G zum ungefalteten Zustand. Welche Faktoren spielen nun bei der Proteinfaltung eine Rolle? Aus der Gibbs Gleichung G = H - T S wird ersichtlich, dass sowohl die Reaktionsenthalpie (H) als auch die Entropie des Systems (S, Maß für die Unordnung ) die Gibbs Energie beeinflussen. Die Faltung selbst wird unter anderem dadurch vorangetrieben, dass hydrophobe Seitenketten durch den Hydrophoben Effekt zusammengelagert und vom polaren Medium abgeschirmt werden. Dadurch nimmt die Entropie des Systems teilweise ab (da gefaltete Polypeptidketten höher geordnet sind als frei bewegliche), aber auch zu (da vorher um hydrophobe Seitenketten strukturiert vorliegende Wassermoleküle frei werden). Zu diesem Einfluss von S auf G kommen noch Veränderungen von H hinzu, die durch die Ausbildung von z.b. Wasserstoffbrücken und Interaktionen geladener Reste (Salzbrücken) einen negativen Wert aufweisen, sodass G für die Faltungsreaktion schlussendlich negativ wird und die Reaktion somit spontan abläuft Inclusion bodies Inclusion bodies (IBs) sind große Aggregate aus falsch bzw. ungefalteten Proteinen. Sie entstehen spontan unter bestimmten zellulären Bedingungen. Da zu IBs aggregierte Proteine von den Organismen nicht mehr genutzt werden können, und für sie damit ausschließlich einen Verlust an Aminosäuren und Energie bedeuten, sind sowohl die Proteinproduktion als auch die Proteine selbst evolutionär so entwickelt, dass in nicht manipulierten Organismen keine nennenswerte IB Bildung auftritt. IBs entstehen aus einer Konkurrenzsituation zweier Reaktionswege: 1. der korrekten Faltung eines Proteins und 2. Interaktion eines ungefalteten bzw. falschgefalteten Proteins mit einem anderen. Proteine falten größtenteils spontan in eine korrekte Form, wobei die Reaktion einer Kinetik 1. Ordnung folgt (Reaktionsgeschwindigkeit hängt nur von der Proteinkonzentration ab). Aggregationsreaktionen sind aber immer von der Interaktion der Proteine abhängig, und sind damit mindestens Reaktionen 2. Ordnung (Geschwindigkeit abh. vom Quadrat der Konzentration des ungefalteten Proteins). Das bedeutet im Organismus, dass IB Bildung immer dann stattfinden kann, wenn die Geschwindigkeit der Aggregationsreaktion größer ist als die der korrekten Faltung. Um- 7

8 so geringer die Menge des ungefalteten Proteins, umso schneller die Faltungsreaktion und umso stabiler der gefaltete Zustand, desto weniger Protein wird in IBs aggregieren. Andersherum gilt: Umso länger die korrekte Proteinfaltung dauert und umso höher die Konzentration an ungefaltetem Protein in der Zelle, desto mehr Protein wird in IBs aggregieren. Da die Geschwindigkeit bei Reaktionen 2.Ordnung exponentiell mit der Proteinkonzentration steigt, können Aggregationsreaktionen damit die Faltungsreaktion vollständig verdrängen (Abb.2.3). Abbildung 2.3: IB Bildung ist abhängig von der Konzentration ungefalteten Proteins. [A] wenig ungefaltetes Protein führt zu hoher Ausbeute an gefaltetem Protein [B] viel ungefaltetes Protein führt zu hoher IB Bildungsrate. In [A] sind die jeweiligen Reaktionsordnungen angegeben (weiteres siehe Text), die Pfeildicken geben die Reaktionsgeschwindigkeit an IB Präparation und Faltung von GFP Im Praktikum wird GFP H6 so stark produziert, dass es in E. coli inclusion bodies bildet. Die Zellen werden mittels Hochdruckhomogenisation bzw. Ultraschall aufgeschlossen, und die sehr dichten IBs zusammen mit den Zelltrümmern abzentrifugiert. 8

9 Daraufhin werden die Proteine aus den IBs in Lösung gebracht. Dies geschieht durch Zugabe großer Mengen Harnstoff, was dazu führt, dass die Lösung der Proteine im Puffer energetisch günstiger wird als die Aggregationsreaktion, sodass sich die IBs spontan auflösen und die Proteine damit in Lösung vorliegen. Aus dieser Protein Harnstofflösung können die Proteine nun mittels einer Nickelchelat Affinitätschromatographie (Ni IMAC für immobilized metal ion affinity chromatography) gereinigt werden. Der His Tag des rekombinant produzierten GFP komplexiert die an die Säulenmatrix gebundenen Nickelionen, wodurch das Protein auf der Säule zurückgehalten wird. Während das Protein auf der Säule gebunden bleibt, wird die Harnstoffkonzentration des Säulenpuffers sukzessive verringert, sodass das Protein auf der Säulenmatrix gebunden seine native Konformation einnehmen kann. Durch Zugabe großer Mengen Imidazol, welches strukturell mit dem für die Komplexierung verantwortlichen Ringsystem des Histidins übereinstimmt, wird das Protein von den Nickelionen verdrängt und somit von der Säulenmatrix getrennt. 2.4 Spektroskopie CD Spektroskopie Die in der Proteinchemie eingesetzte Circulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) macht sich die Eigenschaft von Proteinen zunutze, dass rechts und links circular polarisiertes Licht vom Proteinrückgrat unterschiedlich stark absorbiert wird. Dabei ist die Absorption abhängig von der Orientierung der Peptidbindungen zueinander, wodurch sich die regelmäßigen Sekundärstrukturelemente wie α Helix und β Sheet anhand ihres CD Spektrums unterscheiden lassen (Abb.2.4) Fluoreszenzspektroskopie Fluoreszenz ist die Eigenschaft eines Moleküls, Licht einer gewissen Wellenlänge zu absorbieren (also Photonen mit einer definierten Enerige), und mit geringer Verzögerung (Sekundenbruchteile) langwelligeres Licht wieder abzustrahlen. Die Absorption der Photonen führt dabei zu einer Energetisierung des Fluorophors, dessen Hüllelektronen damit vom Grundzustand in einen angeregten Zustand überführt werden. In kürzester Zeit verliert das angeregte Molekül jedoch Energie durch Vibration und andere molekulare Effekte, sodass das beim Zurückfallen in den Grundzustand abgegebene 9

10 Abbildung 2.4: Unterschiedliche Proteinsekundärstrukturen liefern unterschiedliche CD Spektren, links ideale Spektren homogener Sekundärstrukturen, rechts Spektren von Proteinen mit verschiedenen Anteilen der entsprechenen Sekundärstrukturen (aus Greenfield, Nature Protocols, 2007) Photon nur noch geringere Energie besitzt und demnach längerwelliges Licht abgegeben wird. Im Praktikum wird die Fluoreszenz des gereinigten GFP bestimmt, und hierbei sowohl die Anregungs als auch Emissionsspektren des Proteins mit ihren Maxima bestimmt. 10

11 3 Praktikum 3.1 Lösungen Folgende Puffer werden benötigt: Aufschlusspuffer (200 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0 Renaturierungspuffer (100 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 8 M Harnstoff, 2,5 mm DTT, 20 mm Imidazol Waschpuffer A (10 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 8 M Harnstoff, 20 mm Imidazol Waschpuffer B (10 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 4 M Harnstoff, 20 mm Imidazol Waschpuffer C (10 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 20 mm Imidazol Elutionspuffer (10 ml) 20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 250 mm Imidazol Dialysepuffer (1 l für 2 Gruppen 50 mm Natriumphosphatpuffer (ph 8,0), 100mM NaCl Vorhandene Stammlösungen: 1 M TRIS/HCl ph 8,0 1 M NaCl 100 mm DTT (Handschuhe tragen) 1 M Natriumphosphatpuffer ph 8,0 1 M Imidazol (Handschuhe tragen) 11

12 3.2 Zellanzucht und ernte Anzucht Die Anzucht der Zellen erfolgt in LB-Medium (10 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt pro Liter H 2 O). Ein Liter LB Medium wird mit einer Übernachtkultur des Stammes E. coli BL21(DE3) pet H 6 gfp inokuliert und bei 37 C bis zum Erreichen von OD 600 =0,6 schüttelnd inkubiert. Daraufhin erfolgt die Induktion der Genexpression mit IPTG (Endkonzentration 1 mm im Medium) und weiteres Wachstum der Zellen für 3 h. Unter dem Fluoreszenzmikroskop werden Bakterien nach der Induktion mit denen einer nichtinduzierten Kultur verglichen. Ernte Ein Mililiter der Zellkulturen wird in einem 1,5 ml Eppendorf Tube in der Tischzentrifuge bei maximaler Drehzahl für 5 min abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und das Zellpellet in 100µl SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert ( SDS Probe NI ). Die Zellen werden in 1 l Zentrifugenbechern für 10 min in der Cryofuge 6 6 bei 3000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand wird in die leeren Kolben zurückgeschüttet (nicht mehr als 1 l pro Kolben, da sonst beim Autoklavieren die Gefahr des Überlaufens besteht) und autoklaviert. Die Zellpellets werden in den Bechern bei -20 C über Nacht gelagert, bzw. mittels Löffeln aus den Bechern in 50 ml Greiner Röhrchen überführt und dann bei -20 C über Nacht gelagert (je nach Absprache). 3.3 Zellaufschluss und IB-Präparation Die Lagerung der Zellen, Zellfraktionen und Puffer erfolgt durchgehend auf Eis. Aufschluss Die Zellpellets werden aufgetaut und im 5 fachen Volumen (w/v) 1 eiskalten Aufschlusspuffers (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, eine Spatelspitze DNAse zugeben) mit einer Plastikpipette vollständig resuspendiert. Die Zellen werden dann entweder mittels Hochdruckhomogenisation (French Press, zwei Durchgänge bei 1250 psi) oder Ultraschall aufgeschlossen (Einteilung nach Absprache). 1 weight per volume, d.h. pro 1 g Zellgewicht 1 ml Puffer 12

13 IB Präparation Die Zellsuspension wird bei U/min für 20 min zentrifugiert (Sorvall RC5C, SS34 Rotor, austarieren auf ±0,1 g, Zentrifuge vorkühlen). Dadurch werden die Zelltrümmer sowie inclusion bodies von den Membranvesikeln und den löslichen Bestandteilen des Cyto und Periplasmas getrennt ( SDS Probe ÜS des Überstandes). Der Überstand wird verworfen. Das Zelltrümmerpellet wird zweimal mit Aufschlusspuffer (5 faches Volumen) gewaschen (d.h. resuspendiert und wie oben abzentrifugiert). Nach dem zweiten Waschschritt wird das Pellet in Renaturierungspuffer (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 8 M Harnstoff, 2,5 mm DTT, 20 mm Imidazol) resuspendiert und 1 h auf Eis rührend inkubiert. Die Zelltrümmer werden nun von den gelösten Proteinen der inclusion bodies durch Zentrifugation getrennt. Die Zentrifugation erfolgt bei U/min für 15 min (Sorvall RC5C, SS34 Rotor, austarieren auf ±0,1 g, Zentrifuge vorkühlen). Der Überstand wird in ein neues 50 ml Greiner Röhrchen überführt und für die Ni-IMAC verwendet. Das Zelltrümmerpellet wird nochmals in 5 fachem Puffervolumen (Aufschlusspuffer) aufgenommen und eine SDS PAGE Probe genommen ( SDS Probe ZT des Zelltrümmerpellets) 3.4 Ni IMAC Äquilibrierung In eine Säule werden etwa 1 ml einer 50%igen Ni NTA Lösung pipettiert (Lösung vorher gut schütteln), sodass durch das Abfließen der Lagerlösung eine Ni-NTA-Säule mit einem Säulenvolumen von etwa 0,5 ml entsteht. Die Säule wird nun mit 10 Säulenvolumen Renaturierungspuffer (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 8 M Harnstoff, 2,5 mm DTT, 20 mm Imidazol) äquilibriert (entsprechendes Volumen mit Greiner Röhrchen abmessen und auf die Säule geben, Durchfluss in Abfallbecher auffangen). Das Austrocknen der Säule muss durch Verschließen der oberen Öffnung mit dem Säulendeckel verhindert werden (Unterdruck hält Lösung zurück). Beladen und Waschen Den Überstand der Zelltrümmerzentrifugation wird nun auf die Säule gegeben, und der Durchlauf mit einem frischen Becherglas aufgefangen ( SDS Probe D des Durchlaufs) und nach vollständigem Durchfluss in ein Greiner Röhrchen überführt. Die Säule wird nun zuerst mit 2 Säulenvolumen Waschpuffer A (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 8 M Harnstoff, 20 mm Imidazol) gewaschen (im Abfallbecher auffangen), und dann durch Waschen mit 2 Säulenvolumen Wasch- 13

14 puffer B (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 4 M Harnstoff, 20 mm Imidazol) und 2 Säulenvolumen Waschpuffer C (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 20 mm Imidazol) die Harnstoffkonzentration auf der Säule veringert (Waschpuffer C separat auffangen, SDS Probe W des Waschens mit Waschpuffer C). Elution Die Elution des Proteins erfolgt in 7 Schritten: Elutionen 1 bis 4 mit 1/2 Säulenvolumen, Elutionen 5 bis 7 mit 1 Säulenvolumen des Elutionspuffers (20 mm TRIS/HCl ph 8,0, 100 mm NaCl, 250 mm Imidazol). Jeder Elutionsschritt wird separat in einem 1,5 ml Eppendorf Tube aufgefangen und auf Eis gelagert ( SDS Probe E1 E7 der Elutionsfraktionen). Die Säule wird daraufhin mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer C gewaschen und die Ni-NTA-Agarose aller Praktikumsgruppen in einem Greiner Röhrchen gesammelt (Lagerung im Kühlschrank). Dialyse Zur Dialyse wird die am stärksten leuchtende Elutionsfraktion verwendet. Diese wird in einem Dialyseschlauch zweimal gegen 1 l Phosphatpuffer (50 mm Natriumphosphatpuffer (ph 8,0), 100mM NaCl) bei 4 C rührend dialysiert (erst für 2 h, dann nach Pufferwechsel über Nacht). Für s Protokoll: Warum wird für spektroskopische (Temperaturstabilitäts-)Messungen Phosphatpuffer statt z.b. TRIS Puffer verwendet? 3.5 Proteinkonzentrationsbestimmung Die Menge bzw. Konzentration des gereinigten GFPs (dialysierte Elutionsfraktionen) muss vor den weiteren Schritten bestimmt werden. Die Bestimmung erfolgt mittels Roti Nanoquant. Die Roti Nanoquant Stammlösung wird in einer 1:5 Verdünnung verwendet. Der ganze Kurs stellt nur eine Eichreihe her, die BSA-Stammlösung steht in einer Konzentration von 100 µg/ml zur Verfügung. Die Eichreihe wird wie in Tabelle 1 beschrieben pipettiert. Die Proben des eigenen, dialysierten GFPs werden von jeder Gruppe 1:20 und 1:100 mit H 2 O verdünnt (Endvolumen: je 200 µl). Alle Eichlösungen sowie alle verdünnten GFP-Proteinlösungen werden mit 800 µl Roti- Nanoquant-Lösung gemischt und nacheinander die OD bei 590 und 450 nm bestimmt. Der Quotient von OD 590 zu OD 450 der Eichreihenlösungen wird dann gegen die BSA- Endkonzentration (BSA-Konzentration auf x-achse) aufgetragen. Über die resultieren- 14

15 de Geradengleichung einer linearen Regression kann der Quotient der GFP-Proteinlösungen einer Proteinkonzentration zugeordnet werden (Verdünnungsfaktoren nicht vergessen!). Tabelle 1: BSA Eichreihe BSA Endkonz. (µg/ml) µl BSA-Stammlsg. µl H 2 O SDS PAGE Herstellung der Gele Die Gele werden nach den während des Praktikums besprochenen Angaben hergestellt. Alle hierzu benötigten Lösungen und Materialien werden bereitgestellt. Beladung und Lauf Je 10 µl der SDS PAGE Proben (gut mischen, evtl. noch einmal kurz vortexen und anzentrifugieren, NICHT erhitzen! Für s Protokoll: Warum?) werden in folgender Reihenfolge auf das Gel aufgetragen: M, VI, NI, ÜS, ZT, D, W, E1 7. Gelscan und färbung Die Gele werden auf dem Typhoon Gelscanner mit passendem Anregungs und Detektionsfilter eingescannt. Daraufhin werden sie in Coomassie Färbelösung für mindestens 1 h inkubiert und das überschüssige Coomassie mit Entfärberlösung entfernt (über Nacht). 15

16 3.7 CD Spektroskopie Für die CD Spektroskopie werden 500 µl einer 100 µg/ml GFP-Lösung angesetzt (abh. von der gemessenen Proteinkonzentration). Zur Verdünnung wird der schon für die Dialyse verwendete Phosphatpuffer (50 mm Natriumphosphatpuffer (ph 8,0), 100mM NaCl) verwendet. Messung Die CD Spektren werden im Bereich von 250 nm bis 195 nm aufgenommen. Die Scangeschwindigkeit beträgt 50 nm/min mit einer Signalintegrationszeit (D.I.T) von 125 ms, die Temperatur 20 C. Jeweils drei Durchgänge werden gemittelt. Mit einer GFP Probe wird exemplarisch die Temperaturstabilität von GFP gemessen. Hierzu wird das CD Signal einer GFP Probe bei einer konstanten Wellenlänge von 218 nm in einem Temperaturbereich von 20 C bis 90 C gemessen. Die Temperaturrampe wird mit einem Anstieg von 1 C/min gemessen, und danach wiederum ein Spektrum bei 20 C gemessen. 3.8 Fluoreszenzspektroskopie Für diese Messungen wird ein Teil der dialysierten GFP-Lösung mit Phosphatpuffer(50 mm Natriumphosphatpuffer (ph 8,0), 100mM NaCl) auf eine Endkonzentration von 50 µg/ml (Endvolumen: 2 ml) verdünnt. Verwendet werden Suprasil Quarzglasküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm. Angaben zu den Einstellungen wie Scangeschwindigkeit und Temperatur, sowie der Aufnahme von Anregungs und Emissionsspektren werden vor der Messung besprochen. 16

17 4 Protokoll Das Protokoll sollte innerhalb von 14 Tagen nach Beendigung des Praktikums fertiggestellt und persönlich oder per beim Betreuer abgeliefert worden sein. Als Anreiz: Wenn das Protokoll innerhalb einer Woche (ordentlich) angefertigt und beim Betreuer abgegeben wurde, kann die Erwähnung und Beschreibung einer wissenschaftlichen Veröffentlichung zu GFP (siehe weiter unten) weggelassen werden. Generelles Alle im Skript mit Für s Protokoll: markierten Fragen sollten an einer geeigneten Stelle im Protokoll beantwortet werden. Ein Inhaltsverzeichnis ist nicht erforderlich. Einleitung Es sollte hier eine kurze Einführung in das bearbeitete Thema gegeben werden. Dazu gehören einige Worte zu Punkten wie z.b. dem verwendeten Organismus, dem gereinigten Protein und den Funktionsweisen der verwendeten Methoden. Es ist hier keine vollständige Nacherzählung des Skripts notwendig. In der Einleitung sollte mit einer kurzen Zusammenfassung (wenige Sätze!) auf eine Veröffentlichung zu GFP eingegangen werden (Suche unter: um auf die Einsatzmöglichkeiten von GFP einzugehen. Dabei ist unerheblich, in welchem Zusammenhang GFP (oder andere Varianten wie z.b. CFP) verwendet wird, und ob es Hauptgegenstand oder nur Mittel zum Zweck ist. Materialien und Methoden Auch hier ist keine Nacherzählung notwendig. Ein Satz als Hinweis auf das Skript reicht aus, nur eventuelle Veränderungen sollten aufgeführt werden. Ergebnisse und Diskussion Diese beiden eigentlich streng getrennten Teile einer wissenschaftlichen Arbeit sollten hier zusammen behandelt werden. Alle im Verlauf des Praktikums erhaltenen Ergebnisse sollten aufgeführt und diskutiert werden (Was wurde gemacht? Was kam raus? Welche Fehler sind aufgetreten? etc.). Um die Nachvollziehbarkeit für den Leser zu erhöhen, kann zur Verbindung der einzelnen Ergebnisse kurz auf den Ablauf des Experiments eingegangen werden. Beispiel: Die 17

18 Elutionsfraktion mit dem höchsten Proteingehalt wurde daraufhin für die nachfolgenden kalorimetrischen Messungen eingesetzt. Literaturverzeichnis hier anzugeben. Alle verwendeten Literaturstellen und Veröffentlichungen sind Format Grundsätzlich gilt wie bei allen anderen wissenschaftlichen Arbeiten: Schrift mit Serifen (also Times, Garamond usw. aber nicht Arial, Calibri usw.), Schriftgröße 12, 1,5 facher Zeilenabstand, Blocksatz, einseitiger Druck, Seitennummerierung (bis auf Deckblatt). Variabler sind meist Angaben zu Seitenrändern, hier bitte: links 4 cm, rechts 1,5 cm, oben 2,5 cm, unten 2,0 cm. Einheiten Auch hier gilt analog zu anderen wissenschaftlichen Arbeiten: Zwischen Zahl und Einheit wird ein geschütztes Leerzeichen gesetzt (unter Word: Strg+ Umschalt+ Leertaste) um Zeilenumbrüche und Vergrößerung des Zwischenraumes im Blocksatz zu verhindern. Das Prozentzeichen wird ebenso behandelt (also: 5 % SDS). Bei Angaben in Grad Celsius wird zwischen Zahl und C ein geschütztes Leerzeichen gesetzt (also: 5 C). Als Einheitenzeichen für Liter wird das kleine l verwendet (also auch ml und nicht ml). Damit wird der älteren Definition des Einheitenzeichens der Vorzug vor dem alternativen Zeichen L gegeben, und damit dem weit überwiegenden Teil der internationalen Fachpresse (u.a. Science und Nature) gefolgt. Gene und Proteine In der Bakteriologie werden Proteinnamen generell groß geschrieben (TorA), die entsprechenden Gennamen klein und kursiv (tora). Für nicht aus Bakterien stammende Proteine/Gene weicht die Benennung oft ab, z.b. bei GFP (Protein komplett groß geschrieben) und gfp. Da die Schreibweise den Bezug zum Protein oder Gen eindeutig determiniert, kann auf redundante Begriffe wie das TorA- Protein oder das tora-gen verzichtet werden. Die Protein-/Genbezeichnungen werden zu Eigennamen, d.h. man sagt und schreibt MscL (mechanosensitive channel of large conductance) ist ein interessantes Protein und nicht Der MscL ist ein interessantes Protein, ebenso wie BMW (Bayerische Motoren Werke) baut schnelle Autos statt Die BMW bauen schnelle Autos. 18

19 Rechtschreibung Da es sich um einen sehr häufig auftretenden Fehler handelt: Die deutsche Sprache kennt sog. Nominalkomposita (zusammengesetzte Substantive). Unzulässig ist daher generell das einfache Aneinanderreihen von Substantiven, z.b. Tryptophan Fluoreszenz Spektroskopie, auch wenn dies im Englischen ( tryptophane fluorescence spectroscopy ) der Norm entspricht. Es heißt also in diesem Fall korrekt Tryptophanfluoreszenzspektroskopie. Um die Lesbarkeit zu erhöhen, kann ein Bindestrich zur Gliederung verwendet werden, also: Tryptophan-Fluoreszenzspektroskopie. Auch Zusammensetzungen, die Abkürzungen/Zahlen enthalten, sind von dieser Regel nicht ausgeschlossen: TorA-Enzym statt TorA Enzym, 6-fach statt 6 fach. Englische Fachbegriffe, die (noch) nicht eingedeutscht wurden, sollten im Text durch Kursivsetzung hervorgehoben werden, also z.b. coiled coil. Kursivsetzung gilt ebenfalls für alle Artennamen. Wird der Begriff in einem zusammengesetzten Substantiv verwendet, wird das gesamte Wort mit Bindestrichen durchgekoppelt und groß geschrieben: Das Coiled-coil Protein. Dies gilt ebenso für E. coli Stämme. Abbildungen, und: Präsens oder Perfekt? Als Richtwert gilt: Alle erhaltenen Ergebnisse sind in der Vergangenheitsform zu präsentieren. Dabei wird niemals auf Abbildungen beschreibend eingegangen (also nicht: Auf dem Gel in Abbildung 2 oder Die Kurven in Abbildung 2 etc.) sondern nur auf sie hingewiesen. Abbildungen dienen nur dem Leser als Hilfe zum Nachvollziehen der erhaltenen Ergebnisse. Der Autor selbst wertet seine Ergebnisse aus, nicht Bilder, die seine Ergebnisse für die Nachwelt dokumentieren. Demnach wäre also z.b. richtig: Mittels SDS PAGE konnte GFP in allen Elutionsfraktionen nachgewiesen werden (Abb.2, Spur E1 bis E7). oder Es zeigte sich eine deutliche Verschiebung des Intensitätsmaximums auf 300 nm (Abb.2, gestrichelte Kurve). Alle Abbildungen werden durchnummeriert und müssen eine unterhalb des Bildes stehende Legende besitzen, die für sich stehend Aufbau und Inhalt des Bildes verständlich macht. Dazu gehört eine kurze Abbildungsbeschreibung (Inhalt) sowie eine Erklärung aller Abkürzungen, z.b. bei einer SDS PAGE Abb.2: Reinigung von rekombinantem TorA mittels Ni-IMAC. SDS PAGE der Reinigungsfraktionen, Coomassiefärbung. M = Marker, W = Waschschritt usw.). Tabellen werden ebenfalls durchnummeriert, jedoch oberhalb der eigentlichen Tabelle mit einer Überschrift versehen (also: Tab.1: Verwendete Plasmide ), die Legende steht hier aber wieder unter der Tabelle. Sobald von den erhaltenen Ergebnissen ausgehend ei- 19

20 ne theoretische Aussage zu einem Sachverhalt getroffen wird, deren Aussagekraft über das eigentliche Experiment hinaus Gültigkeit besitzt, wird von der Vergangenheits in die Gegenwartsform gewechselt. Der Autor beschreibt nun Allgemeingültigkeiten oder zumindest hofft er das. Hier kann als Faustregel gelten, dass all jene Sätze im Präsens geschrieben werden können, welche Aussagen betreffen, in die man im Allgemeinen einfügen kann (ohne den Satz logisch zu verfälschen). Beispiel: Somit konnte gezeigt werden, dass GFP (im Allgemeinen) bei einem ph-wert von 5,0 fluoresziert oder Demnach ist PspA (im Allgemeinen) ein membranassoziiertes Protein. 20