Medizinische Mikrobiologie und Hygiene. Allgemeine Bakteriologie: Aufbau und Funktion von Bakterienzellen

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1 Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Allgemeine Bakteriologie: Aufbau und Funktion von Bakterienzellen

2 Mikroorganismen: Pro- und Eukaryonten Protozoen, Pilze, Algen: Eukaryonten Bakterien (Eubakterien): Prokaryonten Archaebakterien: Prokaryonten (Viren; Phagen)

3 Bakterien im menschlichen Körper Besiedlung welcher Bereiche? Haut, Schleimhäute Anzahl Bakterienarten im Mund? ca. 350 bekannt Anzahl Bakterienzellen im Mund? bis ca /ml Speichel; Zahnbelag /g! Gesamtzahl Körperzellen? ca Gesamtzahl Bakterien? ca !

4 Bakterien im menschlichen Körper Besiedlung des Magen-Darm-Trakts:

5 Bakterien im menschlichen Körper Körperregion Haut, äußere Nasenhöhlen, äußerer Gehörgang Mundhöhle, Nasopharynx Speiseröhre, Magen Dünndarm Duodenum Jejunum Ileum Dickdarm (Colon) distale Urethra Vagina Keimzahl /cm 2 bis 10 9 /ml Speichel meist <10/ml bis 10 3 /ml 10 5 /ml /ml /g Stuhl /ml /ml Vorherrschende Flora Staphylokokken (KNST, STAU), Mikrokokken, Corynebakterien, Propionibakterien, Acinetobacter vergrünende Streptokokken, Lactobacillen, Neisseria, Moraxella, Haemophilus, Enterokokken, Meningokokken, Pneumokokken, Pseudomonas, artenreiche anaerobe Flora transient (Mundhöhlenflora); Helicobacter pylori wie Speiseröhre, Magen, retrograde Besiedlung möglich Lactobacillen, Streptokokken, Enterobacteriaceae, Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Bifidobakterien, Enterokokken, sonstige Anaerobier wie Ileum + Clostridien, Staphylokokken, Pseudomonas, Peptostreptokokken, Sprosspilze Hautflora, Streptokokken, Enterokokken, Mykoplasmen Laktobacillen, Streptokokken, Prevotella u.a. Anaerobier

6 Kommensale vs. pathogene Keime 1885 Escherichia coli der häufigste fakultativ aerobe Keim im menschlichen Gastrointestinaltrakt (Anaerobe, z.b. Bacteroides, 20x häufiger) E. coli als Indikatorkeim für fäkale Kontaminationen

7 Was ist eine Art (Spezies)? Bei Bakterien gilt eine genetische Definition: > 70% DNA Homologie Ribosomale RNA-Sequenzen

8 Kommensale vs. pathogene Keime: Pathotypen Croxen & Finlay (2010) Nature Rev. Microbiol.

9 Kommensale vs. pathogene Keime: Pathotypen Basismodell + Extras

10 Kommensale vs. pathogene Keime: Pathotypen

11 Kommensale vs. pathogene Keime: Pathotypen Enterotoxische E. coli (ETEC) Adhäsion, Toxin Enteropathogene E. coli (EPEC) Adhäsion, A/E Enterohämorrhag. E. coli (EHEC) Adhäsion, A/E, Toxin Enteroaggregative E. coli (EAggEC) Adhäsion, Toxin Enteroinvasive E. coli (EIEC) Invasion, intrazell. Überleben Uropathogene E. coli (UPEC) Adhäsion, Toxin Meningitis auslösende E. coli Adhäsion, Invasion, K-1-Antigen Penetration Pathogenitätsfaktoren!

12 Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryonten Zellkern Erbinformation Organellen Ribosomen Membransteroide Eucyte echter Zellkern mit Membran meist mehrere Chromosomen Mitochondrien, Chloroplasten u.a. 80S (Cytoplasma), 70S (Organellen) meist ja Protocyte Nukleoid (Kernäquivalent) meist ein Chromosom (+ Plasmide) keine Organellen 70S-Ribosomen (nein, wenige Ausnahmen) Zellwand meist einfache Homopolymere komplexe Aggregate (Mureingerüst) Zellatmung Zellteilung in Organellen geschlechtliche oder vegetative Vermehrung Protonengradient über CM äquale Zweiteilung (binäre Spaltung)

13 1 Staphylokokken 2 Neisserien 3 Pneumokokken (Strept. pneumoniae) 4 Streptokokken (Strept. pyogenes) 5 Tetrakokken 6 Sarcinen 7 Enterobakterien 8 Milzbrandbakterien (Bacillus anthracis) 9 Corynebakterien 10 Fusobakterien 11 Salmonellen (peritriche Begeißelung) 12 Vibrionen (monotriche Begeißelung) 13 Pseudomonas (lophotriche Begeißelung) Spirochäten Bakterienmorphologie

14 Flagellen (Geißeln) und Pili

15 Polysaccharid-Kapseln Beispiele für Krankheitserreger mit Polysaccharid-Kapsel (Schutz vor Phagozytose) Streptococcus pneumoniae Neisseria menigitidis Haemophilus influenzae

16 Bakterielle Dimensionen Mycoplasma genitalium 0.4 µm Haemophilus influenzae 1.0 µm Staphylococcus aureus 0.9 µm Escherichia coli 1.5 µm Bacillus megaterium 4 µm Rotes Blutkörperchen 8 µm

17 Bakterielle Dimensionen Standardbakterium E. coli: 0,5 x 2 µm (ca. 1 µm 3 ) 1ml reine Bakterienmasse: Zellen Günstiges Oberflächen/Volumen-Verhältnis: - enorm hoher Stoffaustausch mit der Umgebung - sehr hohe Produktionsraten - sehr hohe spezifische Atmungsraten - kurze Generationszeiten Verdopplungszeiten von Bakterien ab 20 min.

18 Bakterien Bakterien Bakterielles Zellwachstum 140 N = N 0 2 n (n Generationen) x(t) = x 0 e µt Wachstumsrate µ = ln N(t) - ln N(0) t - t(0) Zeit Verdopplungszeit t d = ln2/µ Zeit

19 Bakterielles Zellwachstum 1 E. coli Zelle teilt sich mit einer Generationszeit von 20min Wieviel Zellmaterial hat man theoretisch nach 48 Stunden exponentiellem Wachstum? Zellen = 2,23 x Zellen = ca g = t Zellmaterial = x Gewicht der Erde (5,97 x t)

20 Bakterielles Zellwachstum

21 Biofilme häufigste Lebensweise der Bakterien komplexer Verband von Bakterienzellen auf einer Oberfläche meist an Grenzflächen zwischen fester und flüssiger Phase eingebettet in Glykokalix aus Exopolysacchariden (Mikrokolonien) Besiedelung der Zonen mit verschiedenen Arten heterogener Aufbau: - kompakter Kernbereich (anaerob) - lockerer Randbereich (aerob) Dicke von ~100µm

22 Entstehung von Biofilmen Induktionsphase: Anheften erster Bakterien (Adhäsine) Akkumulationsphase: weitere Besiedlung (Quorum sensing), Ausbildung einer (Glyko-)Matrix Existenzphase: Gleichgewicht zwischen Zuwachs und Abbau

23 Entstehung von Biofilmen

24 Einteilung der Bakterien I Gracilicutes II Firmicutes III Tenericutes Gram-negative Bakterien Gram-positive Bakterien Mycoplasmen wenig Murein (<10% der Zellwand) viel Murein (30-70% der Zellwand) keine Zellwand IV Mendosicutes Archaebakterien kein Murein (nur Peptide und Polysaccharide)

25 Aufbau der Bakterienzelle Äußere Membran Periplasmatischer Raum Zellwand Cytoplasmamembran Cytosol (Cytoplasma) Gram-positive Bakterien Gram-negative Bakterien

26 Aufbau der Bakterienzelle

27 Aufbau der bakteriellen Zellhülle (Gram +)

28 Aufbau der bakteriellen Zellhülle (Gram +)

29 Das Cytoplasma (Cytosol) Lösliche Komponenten (DNA, Enzyme, Komplexe für Stoffwechsel, Transkription, Translation, Replikation etc.) 70S-Ribosomen * Große Untereinheit (50S) 23S-rRNA und 5S-rRNA, 32 spezifische ribosomale Proteine * Kleine Untereinheit (30S) 16S-rRNA und 21 spezifische ribosomale Proteine Ribosomen als Angriffsstelle für Antibiotika: z.b. Aminoglykoside (Bindung an 16S-rRNA) Makrolide (an 23S-rRNA)

30 Die Cytoplasmamembran Semipermeable Doppelmembran Osmotische Barriere zur Umgebung Aufnahme- und Sekretionsapparate für Proteine, Substrate, Ionen und Metabolite Protonengradient; Atmungskettenphosphorylierung (PMF = Proton Motive Force)

31 Die Die Cytoplasmamembran (CM)

32 Die Cytoplasmamembran

33 Aufbau der bakteriellen Zellhülle (Gram -)

34 Aufbau der bakteriellen Zellhülle (Gram -)

35 Periplasmatischer Raum nur bei Gram-negativen Bakterien Zellwand (+/- durchlässig) Enzyme wie Nukleasen, Proteasen, Phosphatasen Bindeproteine, Substrattransport, Sekretionssysteme

36 Äußere Membran (Outer membrane, OM) nur bei Gram-negativen Bakterien asymmetrischer Aufbau Innenseite Phospholipidschicht Außenseite: LPS (Lipopolysaccharid) Porine/OMPs: Kanäle für kleine Moleküle/ Ionen, Adhärenz, Bindung von Phagen etc.

37 Lipopolysaccharid (LPS) Abgrenzung Gram-negativer Bakterien nach außen Bedeutung für Diagnostik (Serotypen) und Erkennung durch das Immunsystem Bestandteile: Lipid A + Oligosaccharidseitenkette Endotoxin (Fieber, Diarrhoe, Endotoxinschock) Kernzone O-Seitenketten Endotoxin: unterschiedliche Aktivität bei verschiedenen Spezies (abhängig von Phosphorylierungs- und Acylierungsgrad)

38 Die bakterielle Zellwand (Murein, Peptidoglykan) mechanische Barriere / Formgebung Druckresistenz in hypotonischen Lösungen Mureinnetz aus wenigen (Gram - ) bis zu 40 (Gram + ) Schichten starke Quervernetzung durch Interpeptidseitenketten niedriger Proteingehalt (v.a. Lipoproteine); bei Gram-positiven Bakterien zusätzlich Teichon- und Lipoteichonsäuren

39 Aufbau des Peptidoglykans

40 Aufbau des Peptidoglykans

41 Biosynthese des Peptidoglykans

42 Biosynthese des Peptidoglykans

43 Biosynthese des Peptidoglykans

44 Biosynthese des Peptidoglykans

45 Biosynthese des Peptidoglykans

46 Biosynthese des Peptidoglykans

47 Biosynthese des Peptidoglykans

48 Biosynthese des Peptidoglykans

49 Biosynthese des Peptidoglykans

50 Biosynthese des Peptidoglykans

51 Biosynthese des Peptidoglykans

52 Biosynthese des Peptidoglykans Formgebung: Peptidoglykan und Cytoskelett-Proteine (z.b. MreB in Stäbchenbakterien)

53 Grundlagen der mikrobiologischen Diagnostik

54 Untersuchungsmaterialien - Blut - Serum - Liquor - Sputum - Stuhl - Urin - Abstriche

55 Klassische Infektionsdiagnostik - Mikroskopie - Keimanzucht - Untersuchung von Stoffwechselleistungen (z.b. Bunte Reihe, API-Tests) - Antibiotikaresistenz - indirekt: -Antikörpernachweis (Serologie) -Antigennachweis

56 Mikroskopie: Färbemethoden Methylenblau-Färbung (Meningokokken)

57 Aufbau der bakteriellen Zellhülle Gram+ Gram-

58 Färbemethoden: Gram-Färbung

59 Gram-Färbung

60 Gram-Färbung (Sputum)

61 Gram-Färbung (Protokoll) Ausstrich (z.b. eine halbe Bakterienkolonie und etwas NaCl-Lösung) auf Objektträger lufttrocknen und hitzefixieren Objektträger 3 Minuten mit Kristallviolett-Lösung überschichten Farbstoff abgießen Objektträger 2 Minuten mit Lugol scher Lösung überschichten Lösung abgießen, mit Ethanol entfärben Mit Wasser nachspülen Gegenfärbung mit Safranin (rot) 1 Minute Mit Wasser abspülen Zwischen Filterpapier trocknen

62 Aufbau der bakteriellen Zellhülle Gram+ Säurefest: Mycobakterien

63 Färbemethoden Ziehl-Neelsen-Färbung (säurefeste Stäbchen)

64 Klassische Infektionsdiagnostik - Mikroskopie - Keimanzucht - Untersuchung von Stoffwechselleistungen (z.b. Bunte Reihe, API-Tests) - Antibiotikaresistenz - indirekt: -Antikörpernachweis (Serologie) -Antigennachweis

65 Problem: Keimmischungen

66 3-Ösen-Ausstrich Blutplatte Gram-positive Kokken Gram-negative Stäbchen Technik des Drei-Ösen-Ausstrichs MacConkey-Platte (violett) Gram-negative Stäbchen (Selektivmedium!)

67 3-Ösen-Ausstrich

68 Erregeranzucht: Koloniemorphologie

69 Erregerdifferenzierung: Hämolyse Formen der Hämolyse Columbia-Agar (Blutagar) -, -, -Hämolyse

70 Erregerdifferenzierung: Antibiotika Antibiotika zur Erregerdifferenzierung: Optochin S. viridans S. pneumoniae

71 Erregerdifferenzierung: Kleine Bunte Reihe Kligler-Agar: Harnstoff-Röhrchen: MIO-Röhrchen: Simmons Citrat-Agar: Nachweis der Laktose-Verwertung (Laktase), Gärung in Form von CO 2 -Bildung, H 2 S-Bildung Nachweis der Harnstoffspaltung (Urease) Nachweis der Beweglichkeit, Indolbildung, Ornithindecarboxylierung Nachweis der Nutzung von Citrat

72 Erregerdifferenzierung: API-Test

73 Massenspektrometrie zur Erregerdifferenzierung Biochemische Differenzierung MALDI-Biotyper