Anatom. Inst. d. Med. Fak., Univ. Okayama (Vorstand: Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkugelchen mit lipoidfarbendem Viktoriablau.

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1 Anatom. Inst. d. Med. Fak., Univ. Okayama (Vorstand: Prof. M. SEKI). Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkugelchen mit lipoidfarbendem Viktoriablau. NISHINA (1952, 1953), IKI (1952) und KUWAHARA (1953, 1954) haben Lipoide, die in den Milchkugelchen mit Eiweissstoffen verbunden und verborgen sind, durch verschiedene Verfahren freigelegt und diese mit dem von KOYAMA (1950) als ein vorzuglicher lipoidfarbender Farbstoff empfohlenen Viktoriablau gefarbt. Vor kurzem liess MORI (1954) Pankreatin auf die Milchkugelchen der Kuhmilch einwirken und farbte die dadurch demaskierten Lipoide der Milchkugelchen mit Vihtoriablau. In einem fruheren Versuch (1954) wurde von mir eine auflockernde Wirkung der Ultraschallwellen auf die sublichtmikroskopische Struktur der Erythrocyten konstatiert und spater (1955) ein Entstehen von Fetttropfchen aus den durch die Ultraschallwellen zersetzten kollagenen Mikrofibrillen im Elektronenmikroskop bemerkt. Ich prufte demnach in vorliegender Arbeit, ob und wie die Lipoide der Milchkugelchen durch die Einwirkung der Ultraschallwellen demaskiert wurden, wobei ich zum Nachweis der Lipoide das Viktoriablau benutzte. I. Material und Methode. Es wurden 2cc frisch gemolkener Kuhmilch in einem hartem Pyrexglasrohrchen von 0.5mm Wanddicke, 20cm Lange und 1.5cm Kaliber gebracht. Das Glasrohrchen wurde im Beschallungsgerat von SHIMAZU so gestellt, dass seine Kuppe sich mit der Oiflache beruhrt. Man hielt es immer in der Mitte des hervorspringenden Oles und liess die Ultraschallwellen zu Wirkung kommen. Als Beschallungsgerat wurde der piezoelektrische S-200 Typus benutzt, dessen Wellen 710kc sind. Die Milchkugelchen wurden nach den folgenden verschidenen Farbungsverfahren mikroskopisch untersucht. Eine alkoholische 0.05%ige Losung von. Viktoriablau van MERCK wurde, wie es bei der Herstellung von Blutausstrich ublich ist, auf ein gereinigtes Objektglas angetrocknet. Darauf legte man ein Deckglas mit einem Tropfen der zu untersuchenden Milch nach unten auf. Dadurch verbreitete sich die Milch zwischen den beiden Glasern. Man umrandete

2 2 H. YASUDA: lang auf. Ein gleichteiliges Gemisch von 0.1%iger alkoholischer Viktoriablaulosung und 0.5%iger alkoholischer Sudan III-Losung wurde wie oben auf ein Objektglas angetrocknet, und die Milch wurde gefarbt. Man setzte ferner zu einem Tropfen der Milch auf einem Deckglas ein Zehntel der Menge der obigen gemischten Farblosung zu und vermischte sie schnell mit einem Streichholz-Stabchen. Diese Praparate Es wurde auch ein Gemisch von 0.05%iger alkoholischer Viktoriablau- und Safraninlosung zu gleichen Teilen auf ein Deckglas angetrocknet und zur Milchfarbung benutzt. Es wurde ferner ein kleine Menge dieses Gemisches unmittelbar zu der Milch hinzugetan. Zur Kontrolle wurde die nicht beschallte Milch gleichlaufend untersucht. In unseren Untersuchungen wurden anfangs 100mA Strom aus 1000V Spannung und dann 150mA aus 1500V Spannung 1 Minute bis 2 Stunden lang in das Beschallungsgerat gesandt. II. Ergebnisse der Untersuchung. A. Beschallung durch Einfuhrung von 100mA Strom aus 1,000V in das Gerat. Die frisch gemolkene Kuhmilch wurde, wie oben erwahnt, mit kugelchen blieben ungefarbt (Abb. 1). Sie wurden ferner weder mit Abb. 1. Milchkugelchen vor der Beschallung. Mit Viktoriablau nicht

3 Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkagelchen usw. 3 fettfarbendem Sudan III, noch mit eiweissfarbendem Safranin gefarbt. 1. Nach 10 minutiger Beschallung. Wie in Abb. 2 dargestellt wird, farben sich die Milchkagelchen leicht mit Viktoriablau. Man sieht oft ein ungefarbtes, leuchtendes Tropfchen in ihnen, das mit Sudan III orangerot zu farben ist. Es ist echtes Fett. In derselben Abbildung trifft man nicht selten ein Fetttropfchen an, das sich von der Oberflache eines Milchkugelchens aufhebt und eben davon trennen will. Abb. 2. Nach 10 minutiger Beschallung durch Einfuhrung von 100mA aus 1,000V in das Gerat. Die Milchkugelchen sind mit Viktoriablau schwach gefarbt. Man sieht in und ausser den Milchkugelchen hell erscheinende fettige 2. Nach 15 minutiger Beschallung. Die Milchkugelchen werden mit Viktoriablau besser gefarbt als vorher (Abb. 3). Bei starkerer Vergrosserung findet man, wie in Abb. 4 gezeigt wird, zahlreiche ungefarbte Fetttropfchen in und ausser den Milchkagelchen. Man sieht auch solche, die gerade im Begriffe sind, sich von einem Milchkugelchen zu trennen. Die schon in der Flussigkeit frei gewordenen Fetttropfchen sind, weil sie wegen ihres kleineren spezifischen Gewichtes emporgestiegen sind, in der Photographie meist nicht mit deutlicher Kontur dargestellt. 3. Nach 20 minutiger Beschallung. Merkwurdigerweise wird in diesem Falle die Farbbarkeit der Milchkugelehen mit Viktoriablau wieder schwacher. In den Milchkugelchen sieht man wie vorher sehr oft ein ungefarbtes, leuchtendes Fetttropfchen,

4 4 H. YASUDA: Abb. 3. Nach 15 minutiger Beschallung durch Einfuhrung von 100mA aus 1,000V in das Gerat. Die Milchkugelchen sind mit Viktoriablau starker Abb. 4. Starkere Vergrosserung der Abb. 3. In und ausser den Milchkugelchen finden sich hell erscheinende Fetttropfchen. Man sieht auch solche, die sich welches zumeist wegen seines kleineren spezifischen Gewichtes im oberen Pol des Kugelchens seinen Sitz hat (Abb. 5).

5 Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkugelchen usw. 5 Abb. 5. Nach 20 minutiger Beschallung durch Einfuhrung von 100mA aus 1,000V in das Gerat. Die Milchkugelchen sind mit Viktoriablau schwach 4. Nach 30 minutiger bis lstundiger Beschallung. Die Milchkugelchen farben sich mit Viktoriablau immer schlechter, um schliesslich fast nicht farbbar zu werden. Im Gegenteil vermehren sich die mit Sudan III farbbaren leuchtenden Fetttropfchen. Nach etwa 1 Stunde dauernder Beschallung bilden sich grosse geschmolzene Tropfen oder Klumpen. B. Beschallung durch Einfuhrung von 150mA Strom aus 1,500V in das Gerat. 1. Nach 1 bis 5 minutiger Beschallung. Nach einer Beschallung von 1-3 Minuien werden die Milchkugelchen mit Viktoriablau ein wenig farbbar (Abb. 6). Nach 5 minutiger Beschallung wird aber ihre Farbbarkeit schon wieder abgeschwacht, viel fruher als bei der Einfuhrung von 100mA Strom. In und ausser den Milchkugelchen sieht man stark lichtbrechende Fetttropfchen, die mit Viktoriablau nicht und mit Sudan III orangerot farbbar sind. 2. Nach 10 minutiger Beschallung. Die Milchkugelchen farben sich nicht mehr mit Viktoriablau. Die mit Sudan III farbbaren leuchtende Fetttropfchen vermehren sich. 3. Nach 30 minutiger Beschallung. Vielerorts vereinigen sich die Fetttropfchen miteinander und bilden grosse Klumpen (Abb. 7).

6 6 H. YASUDA: Abb. 6. Nach 3 minutiger Beschallung durch Einfuhrung von 150mA aus 1,500V in das Gerat. Die Milchkugelchen farben sich mit Viktoriablau schwach. Die in ihnen vorhandenen und ausser ihnen befindlichen hellen Fetttrdpfchen sind Abb. 7. Nach 30 minutiger Beschallung durch Einfuhrung von 150mA aus 1,500V in das Gerat. Die Milchkugelchen farben sich nicht mehr mit Viktoriablau. Man sieht Verschmelzungen der fettigen Tropfchen, die mit Sudan 4. Nach lstundiger Beschallung.

7 Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkugelchen usw. 7 Man sieht vermehrte fettige Klumpen. Es erscheinen zugleich viele amorphere Substanzen, die sich mit lipoidfarbendem Viktoriablau stark und mit eiweissfarbendem Safranin schwach farben (Abb. 8). Abb. 8. Nach 2stundiger Beschallung durch Einfuhrung von 150mA aus 1,500V in das Gerat. Die Milchkiigelchen farben sich nicht mit Viktoriablau. Neben den verschmolzenen fettigen Massen finden sich amorphe Substanzen III. Auswertung der Ergebnisse. Bei der unbehandelten frischen Milch bemerkt man fast keine, mit Viktoriablau, Sudan III oder Safranin farbbaren Milchkugelchen. NISHI- das Auftreten von vielen mit Viktoriablau farbbaren Milchkugelchen beobachtet. Ich konnte im obigen Versuche durch die Ultrabeschallung schnell die Milchkugelchen mit Viktoriablau farbbar machen. Dass dies durch eine Trennung der Lipoide aus den Lipoproteinen der Milchkugelchen bedingt ist, ergibt sich aus der Auffassung von MOHR (1951) und der Beobachtung der mit Antiserum versetzten Milchkugelchen von KUWA- HARA (1953) usw. Dauert die Beschallung langer, so wird die Viktoriablaufarbbarkeit der Milchkugelchen wieder schwocher. Ebenso treten in den Milchkugelchen mit Sudan III farbbare Fetttropfchen auf, die oft von den Milchkugelchen nach aussen abgestossen werden. Schliesslich verlieren die Milchkugelchen die Farbbarkeit mit Viktoriablau, und die Fetttropfchen in der Flussigkeit nehmen an Zahl und Grosse zu und gestalten sich zu grossen Klumpen. KUWAHARA (1954)

8 8 H. YASUDA: hat diese Buttermassen in der Milch erst nach 25 Minuten langer Schuttelung bemerkt. Mit der Bildung der fettigen Klumpen treten viele amorphe Substanzen auf, die mit lipoidfarbendem Viktoriablau dunkelblau und mit eiweissfarbendem Safranin rot zu farben sind. Aus der Farbbarkeit darf man schliessen, dass es sich um Gemische aus freien Lipoiden und Proteinen handelt. Aber es bleibt dahingestellt, ob sie nur aus Milchkugelchen entstanden sind oder inwieweit Substanzen des Milchserums sich an ihrer Entstehung beteiligt sind. IV. Zusammenfassung. Durch die Wirkung der Ultrabeschallung werden die Milchkugelchen mit Viktoriablau bis zu einem gewissen Grade farbbar. Die Lipoide werden namlich demaskiert. Wenn die Beschallung aber langer dauert, befreit sich das echte Fett in den Fettkugelchen in tropfiger Form. Zugleich werden die Milchkugelchen wieder mit Viktoriablau schwer farbbar, weil das Fett wahrscheinlich die Lipoide auflost und in sich einschliesst. Die von den Milchkugelchen in die umgebende Flussigkeit ausgegangenen Fetttropfchen mischen sich miteinander, um schliesslich grosse Buttermassen zu bilden. Die trube Schwellung des Cytoplasma von degenerierten Zellen und die Fettphanerose in degenerierten und veralterten Zellen erfolgen vermutlich im grossen und ganzen durch ahnliche Vorgange Literatur. Iki, K.: Untersuchung uber die Sekretion des Fettes und der Lipoide der Milchdruse der Maus. (Jap. m. dtsch. Zfass.) Arch. hist. jap. 4 (1952). -

9 Farbung der durch Ultraschallwirkung zersetzten Milchkugelchen usw. 9 Koyama, Y.: Versuche der Farbung von Olen und Fetten mit alkoholloslichen Farbstoffen. (Jap. m. dtsch. Zfass.) Arch. hist. jap. 1 (1950). - Kuwahara, S.: Veranderungen der mit Antiserum versetzten Milchkugelchen. Arch. hist. jap. 5 (1953). - Morphologische und farberische Veranderungen der Milchkugelchen durch Warme- und mechanische Wirkungen. Arch. hist. jap. 6 (1954). - Mohr, W. H.: Heutige Milchwissenschaft und Versorgung der Bevolkerung mit einwandfreier Kindermilch. Mschr. Kinderhk. 99 (1951). - Mori, C: Morphologische Studien uber die Verdauuug der Milchkugelchen. Arch. hist. jap. 6 (1954). - Nishina, T.: Morphologische Studien uber die Milchkugelchen und Milchzellen des Menschen. (Jap. m. dtsch. Zfass.) Arch. hist. jap. 4 (1952). - Mikroskopische Untersuchung der Veranderung der Milch des Menschen und Tiere beim langeren Stehen. Arch. hist. jap. 5 (1953). - Yasuda, H.: Elektronoskopische Beobachtung der mit hochfrequentem Schall behandelten fixierten Erythrocyten und Bestimmung ihrer Ultrastrukturdichte auf farberischem Wege. Arch. hist. jap. 7 (1954). - Beobachtung der mit hochfrequentem Schall behandelten Kollagenfasern im Elektronenmikroskop und Bestimmung ihrer Strukturdichte auf farberischem Wege. Arch. hist. jap. 8 (1955).