Hygiene und Umweltmedizin

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1 Hygiene und Umweltmedizin Labor für Hygiene und Umweltmedizin Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg Telefon: Neben Krankenhaushygienischen Beratungstätigkeiten erbringt der Bereich Hygiene und Umweltmedizin folgende Leistungen: I. Laboruntersuchungen für Krankenhäuser und Arztpraxen II. Wasser-und Abwasseruntersuchungen III. Überprüfung von Sterilisation und Desinfektion IV. Lebensmittelhygienische Untersuchungen und Untersuchungen von dietätischen Nahrungsergänzungsmitteln V. Lufthygienische Untersuchungen. Der vorliegende Katalog gibt einen Überblick über den Leistungsumfang der durchgeführten Untersuchungen. Reguläre Dienstzeiten im Labor: Montag-Donnerstag Uhr Freitag Uhr. Während der Dienstzeiten sind die Arbeitsplätze besetzt und die Mitarbeiter stehen für telefonische Auskünfte oder Bestellungen zur Verfügung. Die Untersuchungsmaterialien können an der Pforte des Institutes, oder, falls Rücksprache erwünscht, im Laboratorium abgegeben werden. 187/261

2 Hinweise für den Einsender Die notwendige Mindestprobenmenge und die sachgerechte Probeentnahme, die Signifikanz der Beprobung und die Schnelligkeit des Transports der Einsendungen bei geeigneter Temperatur in sachgerechten Probengefäßen sind Voraussetzung für ein relevantes Ergebnis. Die Einsender aus Industrie, Kommunen und Krankenhäusern sind bei der Präanalytik auf eine enge Kommunikation mit dem Labor angewiesen. Für die speziellen bakteriologischen Untersuchungen stehen Einsendescheine zur Verfügung. Diese sind in der Regel zweigeteilt. Im oberen Abschnitt sind - Absender - Telefonnummer - Art des Untersuchungsmaterials - Zeit der Probenahme - Untersuchungsanforderung und umfang vom Einsender unbedingt vollständig auszufüllen. Der untere Abschnitt oder die Rückseite des Einsendescheines dient zur Befundung. Prinzipiell gilt: Am Tag der Untersuchung werden die Proben im Labor angelegt. Sollten größere Untersuchungsreihen durchgeführt werden müssen, ist eine telefonische Vorabsprache mit dem Laboratorium unbedingt erforderlich. Dies dient dazu, die Nährböden und Reagenzien in ausreichendem Umfang bereit zu stellen. 188/261

3 I Krankenhäuser und Arztpraxen 1. Untersuchung von Dialysierflüssigkeit und Permeat 1.1 Analyt Sterilität der Untersuchungsproben Gesamtkeimzahl in KbE/ml Aerobe und anaerobe Bakterien, u.a.: Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. Alcaligenes spp. Acinetobacter spp. Bacillus spp. Aeromonas spp. Enterobacteriaceae Pilze: Hefen Schimmelpilze 1.2 Methode Membranfiltertechnik Kultivierung von Keimen auf verschiedenen festen Nährmedien Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen Identifizierung und Resistenzbestimmung mit Hilfe des Vitek Testprinzip Keimzahlbestimmung Identifizierung der kultivierten Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) 1.4 Untersuchungsmaterial Dialysierflüssigkeit Permeat 1.5 Mindestprobeneinsatz 100 ml 189/261

4 1.6 Präanalytik Sachgerechte Probenentnahme (vorherige Desinfektion der Oberflächen) Probentransport gekühlt vornehmen Funktion des Filtergerätes überprüfen 1.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Verarbeitung erfolgt unverzüglich nach dem Eintreffen im Hygiene-Labor 190/261

5 2. Kontaminationsprüfung von Arbeitsflächen, Gegenständen und Körperoberflächen 2.1 Analyt Staphylokokken (inklusive Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-stämme), Pseudomonaden, Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Hefen, Schimmelpilze, 2.2 Methode Kultivierung Mikroskopie (Gramfärbung) Identifizierung der isolierten Mikroorganismen mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 2.3 Testprinzip Kultivierung von Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) Differenzierung der isolierten Mikroorganismen Quantitative Erfassung der Mikroorganismen 2.4 Untersuchungsmaterial Abklatschplatten von möglichst planen, glatten Oberflächen: z.b. Instrumententische, patientennahe Flächen, Verbandswagen, Fußböden, Nachtkästchen, Wäsche (nach Reinigung), Spülautomaten für Instrumente 2.5 Mindestprobeneinsatz Präanalytik Die Abklatschplatten (RODAC) werden bei der Untersuchung von Flächen von qualifiziertem Personal (z.b. Hygienefachkraft) für 3 Sekunden auf den zu untersuchenden Gegenstand schräg aufgesetzt, abgerollt und leicht angedrückt. (Platte nicht verschieben, sonst Beschädigung des Agars!) Bei Oberflächen, die Aufrauhungen, Poren oder Kerben besitzen, kann nur ein Teil der Keime erfaßt werden. Es ist daher ratsam mehrmals die gleiche Stelle mit Universal- oder Selektivmedien abzuklatschen. 191/261

6 Für alle mit Desinfektionsmittel behandelten Flächen muß Tryptic-Soy-Agar mit einem universellen Enthemmungsmittel (Inaktivierer; Tween 80, Lecithin, Histidin) benutzt werden. Über die Art und Konzentration spezieller Enthemmungsmittel entscheidet der verantwortliche Arzt. Transport bei Raumtemperatur 2.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Alle Proben werden unverzüglich nach dem Eintreffen im Verteiler zugeordnet und im Hygiene-Labor verarbeitet. 192/261

7 3. Hygienische Umgebungsuntersuchungen mittels Abstrichtupfer 3.1 Analyt Nonfermenter, Enterobacteriaceae, Staphylokokken, Streptokokken, Schimmelpilze, Hefen 3.2 Methode Kultivierung Identifizierung mittels Bestimmung der Stoffwechselleistungen 3.3 Testprinzip Kultivierung von Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 3.4 Untersuchungsmaterial und Transport Abstrichtupfer von englumigen Gegenständen, Materialien und Hohlkörpern, die nicht mittels RODAC-Platten untersucht werden können, z.b.: Abstriche von Beatmungsschläuchen Abstriche aus Beatmungsbeuteln Abstriche von Rillen und Kanten Transport bei Raumtemperatur 3.5 Mindestprobeneinsatz Präanalytik Abnahme durch qualifiziertes Personal (Hygienefachkraft) Der feuchte Tupfer wird gleichmäßig unter Rollbewegungen über das zu untersuchende Material bewegt. Tupferabstriche sollen innerhalb von 2-3 h verarbeitet werden. Ist dies nicht möglich, müssen Transportmedien verwendet werden. 3.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen im Hygiene-Labor verarbeitet. 193/261

8 4. Nachweis von Mikroorganismen zur Kontrolle der Aufbereitung von Endoskopen 4.1 Analyt Allgemein: Testkeimzahl auf dem Bioindikatorstreifen Gesamtkeimzahl Speziell: Erreger nosokomialer Infektionen u.a.: Staphylokokken einschließlich S. aureus Streptokokken Enterococcus faecalis Enterobacteriaceae Hefen Nonfermenter; insbesondere Pseudomonas aeruginosa 4.2 Methode Einsatz von Bioindikatoren Kultivierung von Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) Identifizierung mittels Bestimmung der Stoffwechselleistungen Quantitative Erfassung der Mikroorganismen 4.3 Testprinzip Wegen der Englumigkeit der zu überprüfenden Geräte ist die alleinige Kontrolle des chemothermischen Waschprogrammes durch den Anwender des Endoskopiewaschautomaten nicht ausreichend. Deshalb erfolgt die Kontrolle von Endoskopiewaschautomaten durch eine 1. Überprüfung des Waschprozesses mittels Bioindikator: In der bakteriendichten Umhüllung des DES-Control-Streifen sind als Bioindikatoren Enterokokken in einer Keimzahlreihe von 10 3 bis 10 6 KBE aufgetragen. Durch die semipermeable Umhüllung kann erhitztes Flottenwasser mit dem Desinfektions-mittel auf die Keimträger thermisch einwirken. 194/261

9 2. Überprüfung der Keimarmut ausgewählter Endoskope durch Abklatsch-, Durchspül- und Abschwemmverfahren der Oberflächen 4.4 Untersuchungsmaterial Bioindikator (Transport bei Raumtemperatur) Endoskopkanäle (a) Biopsiekanal, b) Luft-/Wasserkanal) Außen- und Innenbereiche der Endoskopiegeräte (z.b. Tupferabstrich von der Nische hinter dem Albarranhebel) Innenmantel der Waschmaschine. Spülflüssigkeit 4.5 Mindestprobeneinsatz Präanalytik 1. Kontrolle mittels Anwendung von Bioindikatoren Korrektes Anbringen von Bioindikatoren in die Endoskopwaschmaschine Die Testkeime sind in separaten Testkammern auf den DES-Control-Streifen eingeschweißt. Auf diese Weise kann die Abtötungsrate beim Desinfektionsprozeß quantitativ gegeben werden. Durch die semipermeable Umhüllung kann erhitztes Flottenwasser mit dem desinfizierenden Agens auf die Keimträger thermisch einwirken. Nach dem chemothermischen Waschverfahren muß der Teststreifen unter fließendem Wasser abgewaschen und anschließend in Papierhandtüchern getrocknet werden. Zusätzlich erfolgt eine Kontrollen des Innenmantels und des Wasserauslasses der Waschmaschine mittels RODAC-Abklatsch-Kulturen (siehe AM-HY-100). 2. Überprüfung der Keimbelastung Durch die breiten Lumina wird Spüllösung gegeben. Enge Lumina werden mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült. Abstrichtupfer werden vom Außenmantel am distalen Ende der Ventile und Lumeneingänge genommen. (siehe AM-HY-101) 195/261

10 3. Sonstige Maßnahmen Abstriche in bereitgestellten Transportmedium versenden Möglichst sterile Entnahme der Abstriche Auffangen der Spülflüssigkeit in sterilem Versandgefäß Kurze Transportzeiten (< 4 h), gekühlter Transport Bei Vermutung von antimikrobiellen Substanzen Enthemmer zugeben. 4.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden nach Eingang in der Pforte unverzüglich im Hygiene-Labor verarbeitet. 196/261

11 II. Wasser- und Abwasseruntersuchungen 1. Untersuchung von einer Rein- und Beckenwasserprobe nach DIN 19643/1 1.1 Analyt Koloniezahl pro Milliliter bei 20 C und 37 C E. coli Pseudomonas aeruginosa Legionella spp. 1.2 Methode Direktbeschickung Kultivierung von Keimen auf und in verschiedenen festen Nährmedien Keimzahlbestimmung Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen Legionella - Serogruppenbestimmung Membranfiltration 1.3 Testprinzip Keimzahlbestimmung Identifizierung der kultivierten Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) 1.4 Untersuchungsmaterial Beckenwasser Reinwasser (aufbereitetes Wasser nach Einmischen von Desinfektionsmittel) Filtrat Flasche mit Na-Thiosulfat (erhältlich im Hygiene-Labor) 1.5 Mindestprobeneinsatz 2 ml 200 ml 197/261

12 1.6 Präanalytik 1. Beckenwasser Die Probennahme erfolgt während der Hauptbelastungszeit des Beckens ca. 50 cm vom Beckenrand entfernt aus dem oberflächennahen Bereich. 2. Reinwasser Die Probennahme erfolgt aus dem Zapfhahn der Reinwasserleitung unmittelbar vor Eintritt des Wassers in das Becken. 3. Füllwasser Wasserprobe aus der Füllwasserleitung unmittelbar vor dem Eintritt in den Wasserspeicher. Die mikrobiologischen Parameter sind nur dann zu untersuchen, wenn es nicht aus der öffentlichen Wasserversorgung stammt. 4. Filtrat Wasserprobe aus der Filtratleitung unmittelbar vor Einmischung des Desinfektionsmittels. gekühlter Transport 1.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Das Wasser wird sofort nach Eintreffen im Hygiene-Labor verarbeitet. 198/261

13 2. Untersuchung von Trinkwasser für den menschl. Verbrauch nach der Trinkwasserverordnung (TrinkwV vom ) 2.1 Analyt Koloniezahl pro ml bei 20 ±2 C und 36 ±1 C E. coli coliforme Keime Enterokokken Ggf. kann die Untersuchung auf folgende Keime erweitert werden: Pseudomonas aeruginosa Legionella pneumophila Clostridium perfringens 2.2 Methode Keimzahlbestimmung Kultivierung von Keimen auf verschiedenen festen Nährmedien Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen Identifizierung mit Hilfe des Vitek 2 (nach 13 Abs. 4 TrinkwV) Membranfiltration Plattengussverfahren 2.3 Testprinzip Bestimmung der Koloniezahl nach der Trinkwasserverordnung vom Bestimmung der Koloniezahl nach der Trinkwasserverordnung vom Untersuchungsmaterial Trinkwasser 2.5 Mindestprobeneinsatz Anlage 1, Teil I: 2 ml, 200 ml Anlage 1, Teil II: 2 ml, 750 ml 199/261

14 2.6 Präanalytik Ortsbesichtigung Angabe der Wasserart und Entnahmeart Angaben über Desinfektionsmittel (Chlorierung) gekühlter Transport 2.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Das Wasser wird sofort nach Eintreffen im Hygiene-Labor verarbeitet. 200/261

15 3. Untersuchung von Abwasser nach den Richtlinien des Robert-Koch- Instituts (Thermische Desinfektion von Krankenhausabwasser) 3.1 Analyt Mikroorganismen im Abwasser nach thermischer Desinfektion aerobe Sporenbildner 3.2 Methode Nachweis von Mikroorgansimen mit dem Plattengussverfahren Nachweis von Mikroorgansimen mit dem Oberflächenverfahren Mikroskopie der isolierten Keime Identifizieren der isolierten Keime mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 3.3 Testprinzip Kultivierung der Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) auf festen Nährmedien (Oberflächenverfahren) Differenzieren der isolierten Abwasserkeime mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 3.4 Untersuchungsmaterial Krankenhausabwasser der Infektionsstationen, die eine Abwasserdesinfektion durchführen. 3.5 Mindestprobeneinsatz 20 ml 3.6 Präanalytik Entnahme durch technischen Betrieb der Uni-Klinik Würzburg Bereitstellen von verflüssigtem DEV-Nähragar, Columbia-Blut-Agar, und MacConkey-Agar Die Abwasserproben der Infektionsstation werden nach der thermischen Desinfektion abgenommen und unverzüglich in das Hygiene-Labor gebracht. gekühlter Transport 201/261

16 3.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden telefonisch angekündigt. Die Verarbeitung muß unverzüglich bei Laboreingang erfolgen. 202/261

17 4. Untersuchung von Aqua purificata nach dem Europäischen Arzneibuch (EuAB) 4.1 Analyt Gesamtkeimzahl von Mikroorganismen in Aqua purificata Keimart (Bakterien, Hefen, Schimmelpilze) 4.2 Methode Membranfiltertechnik Keimzahlmessung Kultivierung von Keimen auf verschiedenen festen Nährmedien Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 4.3 Testprinzip Kultivierung der Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) Bestimmung der Gesamtkeimzahl 4.4 Untersuchungsmaterial Aqua purificata (gereinigtes Wasser) ist nach dem EuAB für die Herstellung von Zubereitungen bestimmt, die weder steril noch pyrogenfrei sein müssen. 4.5 Mindestprobeneinsatz 1 ml Präanalytik Die abgenommenen Proben müssen unverzüglich, spätestens 4 Std. nach der Entnahme verarbeitet werden. 4.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse - 203/261

18 III. Überprüfung der Sterilisations- und Desinfektionsleistung 1. Biologische Überprüfung von Desinfektionsgeräten 1.1 Analyt 1. Bioindikatoren zur Kontrolle der Dampfdesinfektion C B. subtilis - ATCC C E. faecium NTCT Bioindikatoren zur Kontrolle der chemisch-thermischen Desinfektionsverfahren 2.1. Steckbeckenspülmaschinen 2.2. Wäschedesinfektion 2.3. Endoskopwaschautomaten 2.4. Bettengestelldesinfektionsanlage 2.5. OP-Tischwaschmaschinen 2.6. OP-Schuhreinigungsautomaten 2.7. Sonstige Desinfektionsanlagen Für die unter 2. genannten Verfahren wird ein Enterococcus faecalis Bioindikator (im Folgenden DES-Controler genannt) eingesetzt. 1.2 Methode Biologische Überprüfung der Funktionstüchtigkeit von Desinfektionsgeräten mittels Bioindikatoren Kultivierung in Flüssigmedien Subkultivierung auf festen Nährmedien und Identifizierung der Testkeime Nachweis der Abwesenheit von Testkeimen nach Desinfektion 1.3 Testprinzip Nachweis der Abwesenheit der Testkeime nach Desinfektion durch Kultivierung von desinfizierten Bioindikatorstreifen in Flüssigmedien Subkultivierung auf festen Nährmedien und Identifizierung der Testkeime 204/261

19 1.4 Untersuchungsmaterial Bioindikatoren, beimpft mit Enterokokken und Bacillus subtilis 1.5 Mindestprobeneinsatz Je nach Größe und Fassungsvermögen der zu testenden Anlage 4 bis 10 Bioindikatoren. 1.6 Präanalytik 1. Dampfdesinfektion C B. subtilis (105 C, 5 min.) C E. faecium (75 C, 20 min; 105 C, 1 min.) Die unter 1.1. und 1.2. genannten Indikatorkeime werden gleichmäßig in der Desinfektionskammer verteilt und die Lagerung im Gerät auf dem Einsendeschein vermerkt. 2. Chemothermische Desinfektion 2.1. Steckbeckenspülmaschinen 2.2. Wäschedesinfektion 2.3. Endoskopwaschautomaten (siehe AM-HY-107) 2.4. Bettengestelldesinfektionsanlage 2.5. OP-Schuhreinigungsautomaten 2.6. Sonstige Desinfektionsanlagen Die Anzahl der DES-Control-Streifen bei der Überprüfungen von 2.1. bis 2.6. richtet sich nach der Größe des Gerätes. Die Streifen müssen während des Desinfektionsvorganges fixiert sein. Die Testkontrollstreifen sind nach chemo-thermischer Desinfektion unter Leitungswasser abzuwaschen und anschließend zu trocknen. 1.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Bearbeitung erfolgt unverzüglich nach dem Eintreffen im Hygiene-Labor. 205/261

20 2. Biologische Überprüfung von Dampf-, Heißluft-, Gas-Sterilisatoren (Formaldehyd- und Ethylenoxid-Sterilisatoren) und Chemiklaven. 2.1 Analyt Dampfautoklav: Bacillus stearothermophilus Dampfsterilisation von Flüssigkeiten: Bacillus stearothermophilus Heißluftsterilisator: Bacillus subtilis EO-Sterilisator: Bacillus subtilis FO-Sterilisator: Bacillus stearothermophilus Chemiklav: Bacillus subtilis (da keine Norm vorhanden angelehnt an DIN 58949) 2.2 Methode Biologische Überprüfung der Funktionstüchtigkeit von Sterilisatoren. Anzucht von Testkeimen in Flüssigkultur Subkultivierung auf festen Nährmedien Identifizierung des Testkeimes 2.3 Testprinzip Bioindikatoren werden bei einem Sterilisationsprozess mitgeführt. Anzucht der Test-/Indikatorkeime in Nährbouillon. Das Verfahren war ausreichend wirksam, wenn die geprüften Testkeime kein Wachstum zeigen. 2.4 Untersuchungsmaterial Bioindikatoren 2.5 Mindestprobeneinsatz Die Anzahl der Bioindikatoren richtet sich nach dem Volumen des Sterilisators. Durchschnittlich verwendet man 5 Bioindikatoren (inklusive Transport- bzw. Positivkontrolle). 2.6 Präanalytik Grundsätzlich muß der Betreiber die Verfahren zur Duchführung der Sterilisation nach der DIN und anderen Vorschriften einhalten. 206/261

21 TÜV-Abnahme und physikalisch-chemische Parameter (u.a. Druck, Temperatur und Luftfreiheit des Dampfes, Desorbtionszeiten) durch den technischen Dienst. Sterilisationszyklus wie gewohnt durchführen, evtl. zusätzliche Zugabe der Bioindikatoren in ein Normpaket, ansonsten werden die Bioindikatoren auf die verschieden Ebenen im Sterilisator zu den Instrumenten gepackt. Zusätzlich können an Schwachstellen des Sterilisators weitere Bioindikatoren deponiert werden. Nach Beendigung des Sterilisationsvorganges wird der Testbrief mit dem Bioindikator unter Angaben zum Sterilisations-vorganges und Ausfüllen des Prüfprotokolles an das Hygiene-Labor eingeschickt. Transport bei Raumtemperatur 2.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Alle Bioindikatoren werden sofort nach Eintreffen im Labor verarbeitet. 207/261

22 3. Mikrobiologische Überprüfung von Blut und Blutkomponenten auf Sterilität 3.1 Analyt 1. Sterilität von Blut- und Blutkomponenten 2. Mikroorganismen: Aerobe und anaerobe Bakterien Pilze 3.2 Methode Sterilitätsprüfung mittels Direktbeschickungsmethode Kultivierung in flüssigen Nährmedien Subkultivierung auf festen Nährmedien Identifizierung der Isolate 3.3 Testprinzip Sterilitätsprüfung gemäß???? 3.4 Untersuchungsmaterial Blut und Blutkomponenten v.a.: Vollblut Serum Erythrozytenkonzentrat Plasma 3.5 Mindestprobeneinsatz 10 +/- 1 ml pro Medium Verhältnis Inokulum zu Medium (1:10) 3.6 Präanalytik Sterile Entnahmetechnik Durchmischung des Beutelinhalts Korrekte Desinfektion der Probenentnahmestelle mit einem gelisteten Desinfektionsmittel 208/261

23 Transport bei Raumtemperatur 3.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Alle Materialien werden sofort nach Eintreffen im Hygiene-Labor verarbeitet. 209/261

24 4. Prüfung auf Sterilität nach dem Europäischen Arzneibuch 4.1 Analyt Keimfreiheit der zu untersuchenden Materialien Keimart (Bakterien, Pilze) 4.2 Methode Sterilitätsprüfung mittels Direktbeschickung zur Überpüfung der Sterilität bei Feststoffen, löslichen, unlöslichen, suspendierbaren oder emulgierbaren Zubereitungen sowie bei Cremes und Salben Sterilitätsprüfung mittels Membranfiltermethode zur Überpüfung der Sterilität bei Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen oder Zubereitungen, die in Wasser, Isopropylmyristat oder anderen geeigneten Lösungsmittel löslich sind. Kultivierung von Mikroorganismen (Bakterien, Schimmelpilze, Hefen) in den Untersuchungsmaterialien Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime Identifikation der Isolate anhand von Stoffwechselleistungen 4.3 Testprinzip Sterilitätsprüfung mittels Direktbeschickung Sterilitätsprüfung mittels Membranfiltermethode 4.4 Untersuchungsmaterial Feststoffe (z. B. Nahtmaterial, Verbandsmaterial etc.) Flüssige, lösliche, unlösliche, suspendierbare oder emulgierbare Zubereitungen sowie Cremes und Salben Wässrige Lösungen oder Zubereitungen, die in Wasser, Isopropylmyristat oder anderen geeigneten Lösungsmittel löslich sind. 4.5 Mindestprobeneinsatz Es müssen ausreichende Mengen der Proben eingesetzt werden, da zwei beimpft und Wiederholungsuntersuchungen ggf. indiziert sind. 210/261

25 4.6 Präanalytik Der Untersuchungsantrag muss Angaben über die mikrobielle Aktivität des zu untersuchenden Produktes enthalten. Transport bei Raumtemperatur 4.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Alle Materialien werden nach Eintreffen im Hygiene-Labor verarbeitet. 211/261

26 IV. Lebensmittelhygiene und dietätische Nahrungsergänzungsmittel 1. Prüfung auf mikrobielle Verunreinigung bei nicht-sterilen Produkten oder Drogen nach dem EuAB 1.1 Analyt 1. Gesamtkeimzahl Bakterien Sproß- und Schimmelpilze 2. Nachweis bestimmter Mikroorganismen: E. coli Salmonellen andere Enterobakterien S. aureus Pseudomonas aeruginosa 1.2 Methode Qualitative Untersuchung Ausschluß der Kontamination des zu untersuchenden Materials mit bestimmten Mikroorganismen (z.b. S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, Salmonellen) Voranreicherung in verschiedenen flüssigen Nährmedien Subkultivierung auf verschiedene feste Nährmedien Bestimmung der Gesamtkeimzahl Differenzierung anhand von Stoffwechselleistungen Quantitative Untersuchung Definierte Einwaage Voranreicherung in verschiedenen flüssigen Nährmedien Subkultivierung auf verschiedene feste Nährmedien Differenzierung der in den einzelnen Kategorien (siehe Untersuchungsmaterial) geforderten Mikroorganismen mittels Nachweis von Stoffwechselleistungen bzw. Vitek 2 212/261

27 1.3 Testprinzip Direktbeschickungsmethode Voranreicherung in flüssigen Nährmedien Kultivierung auf festen Nährmedien Differenzierung mit Hilfe von Stoffwechselleistungen 1.4 Untersuchungsmaterial Das EuAB teilt die zu untersuchenden Materialien in vier Hauptkategorien ein. Kategorie 1: Zubereitungen, die gemäß der Monographie steril sein müssen, und andere Zubereitungen, die als steril gekennzeichnet sind. Kategorie 2: Zubereitungen zur topischen Anwendung und zur Anwendung im Respirationstrakt mit Ausnahme von Zubereitungen, die steril sein müssen. Kategorie 3: A. Zubereitungen zur oralen und rektalen Anwendung B. Zubereitungen zur oralen Anwendung, die Rohmaterialien natürlicher Herkunft enthalten, für die eine antimikrobielle Vorbehandlung nicht möglich ist und für die die zuständige Behörde eine Keimzahl des Rohmaterials von mehr als 10 3 vermehrungsfähigen Einheiten je Gramm oder Milliliter zuläßt. (Die unter Kat. 4 beschriebenen pflanzlichen Arzneimittel sind ausgenommen) Kategorie 4: Pflanzliche Arzneimittel, die lediglich aus einer oder mehreren pflanzlichen Proben bestehen. A. Pflanzliche Arzneimittel, denen vor der Anwendung siedendes Wasser zugesetzt wird. B. Pflanzliche Arzneimittel, denen vor der Anwendung kein siedendes Wasser zugesetzt wird. 213/261

28 Die Einsender von Drogen ordnen mit dem Untersuchungsauftrag die zu untersuchenden Materialien einer Kategorie zu. 1.5 Mindestprobeneinsatz 20g-30 g 1.6 Präanalytik Ausreichende Untersuchungsmenge Die Entnahme aus der entsprechenden Charge muß unter Beachtung steriler Kautelen geschehen Angabe der antimikrobiellen Aktivität durch den Einsender Angabe einer Zubereitungskategorie nach EuAB Transport: Raumtemperatur 1.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Alle Materialien werden sofort nach Eintreffen im Labor verarbeitet. 2. Reagenzien und allgemeines Vorgehen bei hygienisch-bakteriologischen Untersuchungen von Lebensmitteln 2.1 Analyt 1. Gesamtkeimzahl aerob 2. Spezifischer Keimnachweis B. cereus C. perfringens S. aureus Enterobacteriaceae (allgemein) E. coli (inkl. EHEC) Salmonella spp. Yersinia enterocolitica Campylobacter sp Listeria monocytogenes Botulismustoxin 214/261

29 Pseudomonas aeruginosa Hefen und Schimmelpilze 2.2 Methode Die Untersuchung der Lebensmittel erfolgt grundsätzlich nach der Produktart oder nach den geforderten bzw. gesuchten Mikroorganismen.Die Untersuchungsverfahren sind unter AM-HY-116 bis AM-HY-120 beschrieben.die Untersuchungsmethoden entsprechen den in 35 LMBG genannten Verfahren.Zusätzliche Untersuchungsverfahren sind entweder modifiziert oder nach anderen Quellen (z.b. FDA/FAO Codex Alimentarius) beschrieben. 2.3 Testprinzip Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel in Voranreicherungsmedien Bebrütung des Homogenisates in flüssigen und festen Selektivnährmedien. Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen evtl. biochemische Bestätigung der erwarteten Mikroorganismen evtl. Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime evtl. Identifizierung der isolierten Keime anhand von Stoffwechselleistungen 2.4 Untersuchungsmaterial Gekühlte oder eingefrorene Rohware, die zum Verzehr gedacht ist. 2.5 Mindestprobeneinsatz Richtet sich nach der in 35 LMBG (oder anderen Verordnungen) festgelegten Untersuchungsmengen. 2.6 Präanalytik Repräsentative Probenentnahme einer Lebensmittelcharge gekühlte Anlieferung Vorbereitung der Lebensmittel z.b. Käse: gewachste und gefettete Rinde abtrennen 215/261

30 Eier: Schale entfernen Fleisch: Knochen entfernen Fische: keine Köpfe, Schwänze, Flossen, Schuppen, Gräten Vor Untersuchung der Lebensmittel sollte abgeklärt werden, ob die Lebensmittel mit Infektionen oder intoxikationen im Zusammenhang stehen können. Die Kenntnis darüber hat Einfluss auf den Standardansatz zum Nachweis spezieller Mikroorganismen. Untersuchungsgut muss gekühlt (4 C) bzw. tiefgefroren transportiert werden. 2.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und nach Auftauen unverzüglich verarbeitet. 216/261

31 3. Hygienisch-bakteriologische Untersuchung von Lebensmitteln (ohne Produktspezifizierung). 3.1 Analyt 1. Gesamtkeimzahl aerob Spezifischer Keimnachweis 2. B. cereus 3. C. perfringens 4. S. aureus 5. Enterobacteriaceae (allgemein) 6. E. coli (inkl. EHEC) 7. Salmonella spp. 8. Shigella spp. 9. Yersinia enterocolitica 10. Campylobacter sp 11. Listeria monocytogenes 12. Hefen und Schimmelpilze 3.2 Methode Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel Voranreicherung in flüssigen Nährmedien Kultivierung auf festen Nährmedien nach dem Oberflächen-Spatelverfahren oder Gussplattenverfahren Subkultivierung auf selektiven Nährmedien Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen evtl. biochemische Bestätigung der Mikroorganismen evtl. Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime evtl. Identifizierung der isolierten Keime anhand der Stoffwechselleistungen 3.3 Testprinzip - 217/261

32 3.4 Untersuchungsmaterial Lebensmittel 3.5 Mindestprobeneinsatz Richtet sich nach der in 35 LMBG (oder anderen Verordnungen) festgelegten Untersuchungsmengen. z.b. Nachweis von Salmonella spp. 5 x 1g (Geflügelfleisch-HygieneVO) 1 x 25 g ( 35 LMBG) 3.6 Präanalytik Repräsentative Probenentnahme einer Lebensmittelcharge gekühlter Transport Vorbereitung der Lebensmittel z.b. Käse: gewachste und gefettete Rinde abtrennen Eier: Schale entfernen Fleisch: Knochen entfernen Fische: keine Köpfe, Schwänze, Flossen, Schuppen, Gräten Vor Untersuchung der Lebensmittel sollte abgeklärt werden, ob die Lebensmittel mit Infektionen oder intoxikationen im Zusammenhang stehen können. Die Kenntnis darüber hat Einfluss auf den Standardansatz zum Nachweis spezieller Mikroorganismen. 3.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und unverzüglich verarbeitet. 218/261

33 4. Hygienisch-bakteriologische Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen (außer Geflügelfleisch) 4.1 Analyt 1. Gesamtkeimzahl aerob 2. spezifischer Keimnachweis B. cereus C. perfringens S. aureus Enterobacteriaceae (allgemein) E. coli (inkl. EHEC) Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia enterocolitica Campylobacter sp Listeria monocytogenes Milchsäurebakterien Pseudomonas spp. thermophile Sporenbildner 4.2 Methode Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel Voranreicherung in flüssigen Nährmedien Kultivierung auf festen Nährmedien nach dem Oberflächen-Spatelverfahren, Gussplattenverfahren und Membranfilterverfahren Subkultivierung auf selektiven Nährmedien Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime Biochemische Bestätigung der Mikroorganismen 4.3 Testprinzip Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel in inerten Voranreicherungsmedien 219/261

34 Überführung des Homogenisates in flüssige und feste Selektivnährmedien mittels Oberflächen-Spatelverfahren, Gussplattenverfahren und Membranfilterverfahren Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime Biochemische Bestätigung der erwarteten Mikroorganismen 4.4 Untersuchungsmaterial Gekühlte oder eingefrorene Rohware von Fleisch und Fleischerzeugnissen. 4.5 Mindestprobeneinsatz Richtet sich nach den in 35 LMBG (oder anderen Verordnungen) festgelegten Untersuchungsmengen. z.b. Nachweis von Salmonella spp. 5 x 1g (Geflügelfleisch-HygieneVO) 1 x 25 g ( 35 LMBG) 4.6 Präanalytik Repräsentative Probenentnahme einer Lebensmittelcharge gekühlte oder gefrorene Anlieferung Vorbereitung der Lebensmittel z.b. Knochen entfernen Vor Untersuchung der Lebensmittel sollte abgeklärt werden, ob die Lebensmittel mit Infektionen oder Intoxikationen im Zusammenhang stehen können. Die Kenntnis darüber hat Einfluss auf den Standardansatz zum Nachweis spezieller Mikroorganismen. 4.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und nach Auftauen verarbeitet. 220/261

35 5. Nachweis von Mikroorganismen in Geflügelfleisch und Geflügelfleischerzeugnissen nach der Geflügelfleischhygiene-Verordnung (GFlHV) 5.1 Analyt Spezifischer Keimnachweis Nach GFlHV wird ein spezifischer Keimnachweis von E. coli S. aureus Salmonella spp. gefordert. Zusätzlich kann auf weitere Mikroorganismen nach AM-HY-116 untersucht werden. 5.2 Methode Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel Voranreicherung in flüssigen Nährmedien Kultivierung auf festen Nährmedien nach dem Oberflächen-Spatelverfahren und Membranfiltration Subkultivierung auf selektiven Nährmedien Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen Biochemische Bestätigung von Mikroorganismen 5.3 Testprinzip Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel Überführung des Homogenisates in flüssige und feste Selektivnährmedien mittels Oberflächen-Spatelverfahren und Membranfiltration Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen Nachweis biochemischer Stoffwechselleistungen der erwarteten Mikroorganismen Mikroskopie der isolierten Keime 5.4 Untersuchungsmaterial Gekühlte oder eingefrorene Rohware von Geflügelfleisch und Geflügelfleischerzeugnissen. 221/261

36 5.5 Mindestprobeneinsatz 15 g 5.6 Präanalytik Repräsentative Probenentnahme einer Lebensmittelcharge Die entnommene Probe muß aus 5 Unterproben bestehen gekühlte Anlieferung Von den Unterproben wird unter sterilen Kautelen: - 1 g zur Untersuchung auf Salmonellen entnommen - ca 10 g ausgewogen und 1:10 mit gepuffertem Peptonwasser homogenisiert. 5.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und nach Auftauen verarbeitet. 222/261

37 6. Hygienisch-bakteriologische Untersuchung von Speiseeis 6.1 Analyt a.) Richtwert: Gesamtkeimzahl aerob (30 C) Coliforme Keime b.) Analytische Kriterien: Nachweiskeime für mangelnde Hygiene S. aureus Escherichia coli c.) obligat pathogene Erreger Salmonella spp. Listeria monocytogenes 6.2 Methode Definierte Einwaage und Aufschmelzen der Proben Kultivierung auf festen Nährmedien nach dem Oberflächen-Spatelverfahren, Gussplattenverfahren und MPN-Technik Subkultivierung auf selektiven Nährmedien Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen biochemische Bestätigung der Mikroorganismen Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime 6.3 Testprinzip Definierte Einwaage und Homogenisierung der Lebensmittel in Voranreicherungsmedien Überführung der Probe in flüssige und feste Selektivnährmedien mittels Oberflächen-Spatelverfahren, Gussplattenverfahren und MPN-Technik Keimzählung der gewachsenen Mikroorganismen biochemische Bestätigung der erwarteten Mikroorganismen Mikroskopie (Gramfärbung) der isolierten Keime 223/261

38 6.4 Untersuchungsmaterial Erzeugnisse auf Milchbasis, die gekühlt sind (Speiseeis). 6.5 Mindestprobeneinsatz 5 Proben zu min. 50 g 6.6 Präanalytik Die entnommenen Proben von unverpacktem Eis oder Fertigpackungen müssen für die Qualität der untersuchten Lieferungen repräsentativ sein. Die Anzahl der Proben muß für Analysen und ggf. Gegenproben ausreichend sein und ist in der Milchverordnung vorgeschrieben. Bei Klein- und Einzelpackungen unter 100 g darf die Probenahme nicht durch Unterteilung einer Einzelpackung erfolgen, sondern es muß eine ausreichende Ansammlung von Speiseeisportionen, die in ihrer Originalpackung aufbewahrt und transportiert werden, zur Probenahme verwendet werden. Die Geräte und Behältnisse für Abnahme und Transport müssen steril sein. Die Proben dürfen während des Transports nicht aufschmelzen (gekühlte Anlieferung). 6.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und nach Auftauen verarbeitet. Speiseeisproben, die nicht am Tage der Probennahme untersucht werden können, müssen bei - 18 C oder niedrigeren Temperaturen aufbewahrt werden. 224/261

39 7. Hygienisch-bakteriologische Untersuchung von Kakao, Schokolade, Zuckerwaren und Rohmassen 7.1 Analyt In der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG gibt es derzeit noch keine Anweisung zur bakteriologischen Untersuchung von Kakao, Schokolade, Zuckerwaren und Rohmassen. In der Literatur (Baumgart 1999, Hygiene-VO der Schweiz, de Zaan 1992 und van Houten 1986) werden unterschiedliche Untersuchungskriterien und Keimzahlangaben gemacht. V.a. werden untersucht: Gesamtkeimzahl aerob Enterobacteriaceae E. coli Salmonellen S. aureus Hefen (u.a. osmotrophe Hefen) und Schimmelpilze Die Untersuchungen werden, sofern der Einsender keine anderen Angaben macht, nach AM-HY-115/A durchgeführt. 7.2 Methode Definierte Einwaage und Aufschmelzen der Lebensmittel Voranreicherung in flüssigen Nährmedien Kultivierung auf festen Nährmedien mittels Oberflächen-Spatelverfahren Subkultivierung auf selektive Nährmedien Biochemische Bestätigung 7.3 Testprinzip Definierte Einwaage und Aufschmelzen der Lebensmittel in Voranreicherungsmedien Überführung der Anreicherung in flüssige und feste Selektivnährmedien mittels Oberflächen-Spatelverfahren, Nachweis biochemischer Stoffwechselleistungen der erwarteten Mikroorganismen 225/261

40 7.4 Untersuchungsmaterial Kakao, Schokolade, Zuckerwaren und Rohmassen 7.5 Mindestprobeneinsatz Enterobactericeae in min. 1 g Salmonellennachweis in min. 100 g Hefennachweis in min. 10g 7.6 Präanalytik Die Entnahme der Stichproben durch den Einsender müssen repräsentativ für die Gesamtcharge sein. Diese Stichproben werden im im Hygiene-Labor unter sterilen Kautelen aus den einzelnen eingesandten Proben auf 100 g gepoolt. Transport bei Raumtemperatur 7.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse Die Proben werden unverzüglich nach Eintreffen in der Pforte im Hygiene-Labor abgegeben und nach Auftauen verarbeitet. 226/261

41 V. Lufthygienische Untersuchungen 1. Partikel- und Keimzahlbestimmung der Luft 1.1 Analyt Anzahl der Partikel/Keime pro m 3 Luft Mikrokokken Staphylokokken Corynebakterien Bazillen Pseudomonas spp. u.a. Nonfermenter Enterobacteriaceae Hefen, Schimmelpilze 1.2 Methode 1. Zählung von Partikeln in einem definierten Volumen 2. Impaktionsverfahren zum Nachweis von Luftkeimen 3. Sedimentationsverfahren zum Nachweis von Luftkeimen 4. Kultivierung und Identifizierung der aus der Luft isolierten Keime. Die Identifizierung der Keime soll eine Unterscheidung zwischen normaler Mikroflora und Kontaminationskeimen ermöglichen 1.3 Testprinzip 1. Partikelzählung: Streulichtmessung mittels Lasertechnik Die Größe der gemessenen Partikel beträgt 0,3 10 µm 2. Impaktionsverfahren (Luftkeimzahlbestimmung) Luftgetragene Mikroorganismen werden durch Ansaugen von Luft auf eine Agarplatte abgeschieden und quantitativ bestimmt. 3. Sedimentationsverfahren: Luftkeime sedimentieren in definierter Zeit auf Agarplatten 227/261

42 1.4 Untersuchungsmaterial Raumluft 1.5 Mindestprobeneinsatz 1. Partikelzählung Meßvolumen: 1 f 3 bzw. 28,3 Liter 2. Impaktionsverfahren Meßvolumen: 250 l oder 500 l 3. Sedimentation 15 min 1h. 1.6 Präanalytik 1. Überprüfung aller eingesetzten Geräte am Vortag des Einsatzes. 2. Verwendung von Schutzkleidung bei der Probenahme zur Kontaminationsvermeidung. 1.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse - 228/261

43 2. Abnahme Raumlufttechnischer Anlagen 2.1 Analyt Anzahl der Partikel pro m 3 Luft Anzahl der Keime pro m 3 Luft: Bauliche Gegebenheiten Raumtemperatur Luftgeschwindigkeit Luftfeuchtigkeit (rel.) Strömungsrichtung 2.2 Methode 1. Zählung von Luftpartikeln in einem definierten Volumen: Streulichtmessung mittels Lasertechnik; die Größe der gemessenen Partikel beträgt 0,3 10 µm 2. Impaktionsverfahren zum Nachweis von Luftkeimen: Luftgetragene Mikroorganismen werden durch Ansaugen von Luft auf eine Agarplatte abgeschieden und quantitativ bestimmt. 3. Messung der Luftströmungsrichtung 4. Messung der Luftgeschwindigkeit 5. Messung der Raumtemperatur 6. Messung der Luftfeuchtigkeit 2.3 Testprinzip 1. Partikelzählung 2. Impaktionsverfahren (Luftkeimzahlbestimmung) 3. Messung der Luftströmungsrichtung Diese Messung ist nach DIN 1946/4 vorzunehmen. Die Messung der Luftströmung wird mit Hilfe von Rauchröhrchen (Fa. Dräger) gemessen. 4. Messung der Luftgeschwindigkeit Die Messung der Luftgeschwindigkeit erfolgt mittels Anemometer. Die 229/261

44 Luftströmung bewegt dabei ein Flügelradanemometer oder Thermoanemometer, die Umdrehungen werden gezählt und in m/s angegeben. 5. Temperaturmessung mittels Thermographen oder Thermometer 6. Luftfeuchtigkeitsmessung (rel. Luftfeuchtigkeit) mittels Hygrometer 2.4 Untersuchungsmaterial Raumluft bzw. Luft nach Aufbereitung in 2- oder 3-stufiger RLT-Anlage 2.5 Mindestprobeneinsatz 1. Partikelzählung Meßvolumen: 1 f 3 bzw. 28,3 Liter 2. Impaktionsverfahren Meßvolumen: Liter Messbereiche der Punkte 3-6 werden von dem Betreiber und Installateur festgesetzt und überprüft. 2.6 Präanalytik 3. Überprüfung aller eingesetzten Geräte am Vortag des Einsatzes. 4. Verwendung von Schutzkleidung bei der Probenahme zur Kontaminationsvermeidung. 5. Gründliche Vorreinigung des Operationssaales und mind. 3 h Vorlauf der RLT- Anlage. 6. Desinfektion der Zuluftleitungen vor Beginn der Untersuchungen. 2.7 Probenaufbewahrung vor der Analyse - 230/261