Abschlussbericht an das Ministerium für Umwelt, Klima und Energiewirtschaft Baden-Württemberg, Dezember Rita Triebskorn, Prof. Dr.

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1 Modellstudie zur Effizienz der Reduktion der Gehalte an anthropogenen Spurenstoffen durch Aktivkohle in Kläranlagen: Monitoring vor Inbetriebnahme der Adsorptionsstufe auf der Kläranlage Langwiese "SchussenAktiv" UVM-Vorhaben Nr. 306/2010 Abschlussbericht an das Ministerium für Umwelt, Klima und Energiewirtschaft Baden-Württemberg, Dezember 2012 Rita Triebskorn, Prof. Dr. Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen und Steinbeis-Transferzentrum für Ökotoxikologie und Ökophysiologie Blumenstraße 13, Rottenburg GÖL - Starzach Schussen Aktiv

2 Inhalt Inhalt Seite 1. KOOPERATIONSPARTNER 3 2. HINTERGRUND 4 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1. Probestellen Freilandstationen Probenahmen Elektrobefischungen Testorganismen Genehmigungen RESULTATE 4.1. Limnochemische Untersuchungen Chemische Analytik Hauptanalysen TZW Zusatzanalysen persistente Verbindungen in Fischen Zusammenfassung Analytik Endokrine Potentiale und Wirkungen Östrogene Gesamtaktivität: E-Screen (Anti)-östrogene und anti-androgene Potentiale: Reportergenassays Reproduktionstest mit Potamopyrgus antipodarum Vitellogenininduktion bei Forellen Geschlechterverhältnis, Reifezustand, GSI bei Fischen Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden Toxische Potentiale und Wirkungen Dioxin-ähnliche Potentiale: Reportergenassays Gentoxische Potentiale: Reportergenassays Gentoxische Wirkungen: Mikrokerntests bei Fischen Acetylcholinesterase Stressproteinanalysen Histopathologie Entwicklungstoxische Potentiale: Embryotests mit dem Zebrabärbling Entwicklungstoxische Wirkungen: Embryotests mit Forellen Gesundheitszustand Gammariden Untersuchungen des Makrozoobenthon Öffentlichkeitsarbeit: Informationsflyer ZUSAMMENFASSUNG und AUSBLICK DANKSAGUNG ANHANG 197 2

3 Kooperationspartner 1. Kooperationspartner Universität Tübingen, Physiologische Ökologie der Tiere, Tübingen: Jonas Geburzi, Lisa Hanslik, Anja Henneberg, Sebastian Kindermann, Prof. Dr. Heinz Köhler, Stefanie Krais, Marlene Langjahr, Diana Maier, Dr. Raphaela Osterauer, Katharina Peschke, Carolin Schultz, Paul Thellmann, Prof. Dr. Rita Triebskorn. Durchführung Beprobungen, Aufbau und Betreuung Freilandstationen und Laborexposition, Histologie, Embryotests, Stressproteine, Gentoxizitätstests, Vitellogenin, Biotransformationsenzyme. Steinbeis Transferzentrum für Ökotoxikologie und Ökophysiologie, Rottenburg: Prof. Dr. Rita Triebskorn: Projektkoordination. ISF (Institut für Seenforschung) der LUBW (Landesanstalt für Umwelt, Messungen und Naturschutz Baden-Württemberg), Langenargen: Dr. Harald Hetzenauer, Dr. Hans Güde, Brigitte Engesser, Andreas Schiessl, Kurt Sarembe. Koordination, Fischerei TZW (DVGW-Technologiezentrum Wasser), Karlsruhe: Dr. Frank Sacher, Dr. Doreen Richter. Chemische Analytik BBW Biologiebüro Weyhmüller, Achberg: Michael Weyhmüller. Aufbau und Betreuung der Freilandstationen. Universität Frankfurt, Aquatische Ökotoxikologie, Frankfurt: Prof. Dr. Jörg Oehlmann, Agnes Sieratowicz. Potamopyrgus-Tests für endokrine Wirkungen in vivo RECETOX, Masaryk Universität Brno: Prof. Dr. Ludek Blaha. Reportergen-Assays für cytotoxische, genotoxische und endokrine Wirkungen in vitro Universität Stuttgart, ISWA (Institut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und Abfallwirtschaft), Stuttgart: Dr. Bertram Kuch, Prof. Dr. Jörg Metzger. E-Screen für endokrine Wirkungen in vitro GLW (Gewässerökologisches Labor Wurm), Starzach: Dr. Karl Wurm. Makrozoobenthosuntersuchungen Hydra-Büro, Konstanz: Peter Rey. Öffentlichkeitsarbeit, E-Befischung Universität Avignon: Dr. Magali Rault. Acetylcholinesterasehemmung 3

4 Hintergrund 2. HINTERGRUND Der Eintrag von Spurenstoffen in Oberflächengewässer ist in den letzten Jahren verstärkt ins Zentrum des Interesses von Wissenschaft, Politik und Öffentlichkeit gerückt (Brauch, 2011). Die geplante Änderung der Wasserrahmenrichtlinie (WRRL) dahingehend, dass die Liste prioritärer Substanzen erweitert werden sollen, hat dieses Interesse in jüngster Zeit deutlich verstärkt. Einhergehend mit dem steigenden öffentlichen Interesse und dem Wissenszuwachs zur Thematik "Spurenstoffe" hat das Land Baden-Württemberg im Jahre 2009 im Rahmen des Konjunkturprogramms beschlossen, die Nachrüstung von überwiegend größeren Kläranlagen am Bodensee mit Aktivkohlefiltern zu fördern, um den Eintrag von Spurenstoffen in Gewässer zu mindern. Im Vordergrund steht hierbei am Bodensee aus Vorsorgegründen das Schutzgut Trinkwasser. Mit Aktivkohlefilterung ausgestattet werden im Bodensee-Einzugsgebiet die Anlagen Esparsingen (Zweckverband Stockacher Aach), Emmingen - Liptingen, Kressbronn -Langenargen sowie Langwiese (AZV Mariatal, Ravensburg). Zudem erhalten aktuell noch die Kläranlagen Sindelfingen und Mannheim eine solche zusätzliche Reinigungsstufe. Im Fokus des Projektes SchussenAktiv, im Rahmen dessen der Erfolg der weiteren Abwasserbehandlung mit Aktivkohle überprüft werden soll, steht die Kläranlage Langwiese des AZV Mariatal, Ravensburg (Abb. 2.1). Diese ist das größte Klärwerk im nördlichen Bodensee-Einzugsgebiet. Es reinigt eine Schmutzfracht von Einwohner-Werten (ca Einwohnern). Für das gereinigte Abwasser wird als Vorfluter die Schussen genutzt, in die, neben der Kläranlage Langwiese, noch 17 weitere mittlere und kleine Anlagen einleiten. Dass in der Schussen eine relativ große Anzahl an Spurenstoffen in z.t. recht hohen Konzentrationen nachgewiesen werden können (Triebskorn & Hetzenauer, 2012), liegt einerseits an den hohen Eintragsmengen an Klärwasser. Darüber hinaus bedingt aber auch das große und dicht besiedelte Einzugsgebiet der Schussen mit 815 km² und eine relativ geringe Abflussmenge (im Mittel 9-13 m 3 /s) u.a. aufgrund realtiv geringer Niederschläge im Nordwesten des Bodenseegebietes eine vergleichsweise geringe Verdünnung des eingeleiteten Abwassers. Der im Projekt als wenig belastetes Vergleichsgewässer betrachtete Bodenseezufluss Argen hat beispielsweise einen mittleren Abfluss von m 3 /s bei einem Einzugsgebiet von 652 km 2. Im Rahmen des Projektes SchussenAktiv wird der Erfolg des Ausbaus der Kläranlage Langwiese mit Aktivkohle hinsichtlich dreier Aspekte untersucht: (A) Die tatsächliche Reduktion an Spurenstoffen im Kläranlagen Ablauf und in der Schussen (im Vergleich zur Argen). 4

5 Hintergrund (B) Die hieraus resultierende Reduktion an toxischen und hormonellen Potentialen im Kläranlagen Ablauf und in der Schussen (im Vergleich zur Argen). (C) Die aus der Reduktion an Spurenstoffen resultierenden Wirkungen bei Fischen und Fischnährtieren in der Schussen (im Vergleich zur Argen) bzw. bei Tieren, die aktiv in der Schussen (und in der Argen) in Bypass-Systemen exponiert wurden. Innovativ an dem Projekt ist damit die kombinierte Betrachtung von Exposition (Vorhandensein von Spurenstoffen im Klär- und Oberflächenwasser sowie im Sediment und in Biota) mittels instrumenteller Analytik und Effekten in Labor-Testsystemen sowie Biota im Freiland. Diese Kombination erlaubt eine komplementäre und umfassende Bewertung der Belastungssituation. Während die chemische Analytik stoffspezifische Fragestellungen nach Präsenz oder Verbleib von Chemikalien in Umweltmatrices beantworteten kann, stößt diese an Grenzen, sobald das gesamte Spektrum an vorhandenen chemischen Belastungsfaktoren erfasst werden soll. Grund hierfür ist, dass die Auswahl der zu analysierenden Stoffe a priori die Anzahl potentiell im Gewässer detektierbarer Chemikalien bestimmt bzw. einschränkt. Zudem ist der chemische Charakter vor allem von Metaboliten anthropogen eingetragener Substanzen derzeit vielfach noch unbekannt, so dass diese Stoffe analytisch (noch) nicht greifbar sind. Problematisch kann auch sein, dass Stoffe in so niedrigen Konzentrationen vorliegen, dass die Nachweisgrenzen unterschritten werden. Dies ist vor allem in komplizierteren Matrices, wie Sedimenten oder Biota der Fall. Effektanalysen haben den Vorteil, dass sie über ein je nach Testsystem mehr oder weniger großes und spezifisches Spektrum an Belastungsfaktoren integrieren. Sie ermöglichen dadurch, entweder stoffgruppenspezifisch z.b. durch östrogenartige oder neurotoxische Chemikalien verursachte spezifische Effekte zu erfassen, oder aber den Gesundheitszustand von exponierten Organismen als relativ unspezifischen Endpunkt zu beschreiben, der über die Gesamtheit vorhandener Belastungsfaktoren integriert. SchussenAktiv kombiniert im Bereich dieser Effektanalytik Labortests, die schädliche Potentiale in Umweltmatrices detektieren mit Studien zu realen Wirkungen bei Freilandorganismen. Mit Hilfe der Potentialanalytik, die im Labor mit standardisierten Testsystemen durchgeführt wird, werden Umweltproben (Kläranlagenabläufe, Oberflächenwasser oder Sediment) auf toxische oder endokrine Potentiale hin untersucht. Sie vermitteln ein Bild vom Belastungszustand der Umweltprobe zum Zeitpunkt der Probenahme im Sinne einer Momentaufnahme. Wirkungen in Freilandorganismen oder in Organismen, die aktiv im Freiland exponiert werden, übermitteln komplementär hierzu Informationen zum Belastungszustand der jeweiligen Probestelle bis zum Zeitpunkt der Beprobung im Sinne einer Langzeitaufnahme. Da alle Methoden auf zeitgleich entnommene Umweltproben angewendet wurden, können im Rahmen von 5

6 Hintergrund SchussenAktiv Querverbindungen zwischen den Ergebnissen geknüpft und Plausibilitätsketten erstellt werden. Das Ziel von SchussenAktiv ist es, in diesem Sinne den Erfolg des Ausbaus der Kläranlage Langwiese mit Aktivkohle zu dokumentieren. Da mit der Fertigstellung der Aktivkohle-Anlage in Langwiese allerdings erst bis Frühsommer 2013 zu rechnen ist, wird im vorliegenden Bericht zunächst der Zustand vor Ausbau der Kläranlage beschrieben. Die Untersuchungen werden von im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projektverbundes SchussenAktivplus weitergeführt. Im Folgenden werden zunächst die Ergebnisse der chemisch-analytischen und limnochemischen Expositionscharakterisierung vorgestellt. Darauf folgen die Resultate der Studien zu endokrinen Potentialen und Wirkungen gefolgt von den Ergebnissen der Untersuchungen zu toxischen Potentialen und Wirkungen. Jedem Kapitel ist eine kurze, methodenspezifische Einleitung vorangestellt. Nach der Beschreibung der jeweils spezifischen Methodik werden die Ergebnisse beschrieben und diskutiert. Jedes Kapitel endet mit einer Kurzzusammenfassung, die die wichtigsten Erkenntnisse stichpunktartig darstellt und bewertet. Am Ende des Berichts folgt eine Synthese und Bewertung der erzielten Ergebnisse. Abb. 2.1: Kläranlage Langwiese bei Ravensburg (AZV Mariatal). Links: Faultürme; rechts: Baumaßnahme Aktivkohlefilter Literatur Brauch, H.-J. (2011): Organische Spurenstoffe in Gewässern. Vorkommen und Bewertung. Gwf- Wasser/Abwasser,

7 Hintergrund Triebskorn R, Hetzenauer H (2012): Micropollutants in three tributaries of Lake Constance, Argen, Schussen and Seefelder Aach: a literature review. (Mikroverunreinigungen in den drei Bodenseezufluessen Argen, Schussen und Seefelder Aach - eine Literaturstudie). Environmental Sciences Europe 24. online available at: 7

8 Probestellen 3. Material und Methoden 3.1. Probestellen Im Rahmen einer Vorstudie wurden zunächst sieben potentielle Probestellen ausgewählt, an denen erste Untersuchungen durchgeführt wurden. Für die Hauptstudie wurde die Zahl der Probestellen aus Kostengründen dann auf vier reduziert. Tab : Probestellen Vorstudie P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6 Schussen oberhalb KA, oberhalb Regenüberlaufbecken (RÜB) bei Weissenau (vor Bahnhof links, geradeaus durch Industriegebiet, an Firma vorbei, rechts Feldweg) Schussen, 1700 m oberhalb KA, direkt unterhalb RÜB bei Weissenau, bei Altgewässerarm (vor Bahnhof links, geradeaus durch Industriegebiet, an Firma vorbei, rechts Feldweg) Schussen, 700 m unterhalb KA, Nähe Oberzell (durch Oberzell durchfahren, rechts Kläranlage Mariatal liegenlassen, Richtung Lachen, bei Reißer abbiegen, Richtung Entsorgungszentrum, Straße: Rautbrühl; Links vor Zülz Feldweg nehmen zur Schussen Schussen, unterhalb KA bei Lochbrücke / Gerbertshaus (ca. 10 km), beim Pegelhäuschen bzw. im Oktober in der Nähe bei Oberbaumgarten (Erdbeerfeld, ca. 17 km) Obere Argen bei Mindbuch (1,6 km oberhalb KA Wangen): (Ravensburg Richtung Wangen, danach Richtung Lindau auf B18. Bei Grub in Richtung Neukirch, Tettnang, Vor Gasthof Hirschen links Wanderparkplatz. Bergab zur Argen, links halten, unter Autobahnbrücke. Zusätzlich: Kleiner Zufluss mit Gammariden (P4*). Argen mündungsnah bei Langenargen (Von Langenargen Richtung Hängebrücke, hinter Hängebrücke rechts ab, Waldweg an Argen entlang, nach Informationsschild / Bänken links bei Parkbucht. Schussen Mündung (bei Panzerbrücke) nach Abfluss KA Eriskirch (50 m unterhalb) Hauptstudie Bei der ersten Probenahme im Juni 2010 wurden neben der Probestelle 3 (P3) unterhalb der KA Langwiese zwei mögliche Kontrollstellen beprobt, eine oberhalb der KA Langwiese an der Schussen bei Sulz (P00) und eine in der Nähe der früheren P4, jedoch nicht an der Oberen Argen, sondern an der Unteren Argen bei Wangen (P4b). Von diesen wurde auf der Basis der analytischen Ergebnisse die Probstelle an der Argen als endgültige Kontrollstelle ausgewählt. Zusätzlich wurden für ausgewählte Tests Untersuchungen von Wasser- und Sedimentproben von der Schussenmündung (P6) sowie mit dem Ablauf der Kläranlage Eriskirch direkt bei der Schussenmündung durchgeführt. Zu jedem Probenahmezeitpunkt wurden 24 h Sammelproben des KA-Ablaufs der KA Langwiese untersucht. Die Lage der Probestellen ist in Abb dargestellt. 8

9 Probestellen Tab : Probestellen Hauptstudie P00 P3 P4b P6 Schussen ca. 12 km oberhalb KA, weit oberhalb RÜB und oberhalb Mündung Wolfegger Aach bei Staig Schussen, 13 km unterhalb KA bei Oberbaumgarten (zwischen Erdbeerfeld und Holzbrücke) N E Untere Argen bei Amtzell Oberau (oberhalb KA Wangen, unter Autobahnbrücke) N E Schussen Mündung, 19 km unterhalb KA (bei Panzerbrücke) nach Abfluss KA Eriskirch (50 m unterhalb) Bypass Gunzenhaus Bypass Pflegelberg Abb.3.1.1: Die Probestellen der Hauptstudie 9

10 Freilandstationen 3.2. Freilandstationen An der Schussen wurden ca. 6 km unterhalb der Kläranlage Langwiese (N E ) bei Gerbertshaus im Pumpwerk Gunzenhaus (N E ) sowie an der Argen in einem Bauwagen auf dem Gelände der Kläranlage Pflegelberg (N E ) zwei Freilandstationen errichtet (Abb ). Diese beinhalten jeweils fünf Aquarien (à 250 L), durch die das Flusswasser als Bypass geleitet wird. Der Wasserdurchfluss beträgt pro Aquarium 0,4L / sec. Im zweiten Jahr wurden jeweils zwei Becken auf vergleichbare Temperatur geheizt, um die Temperatur als bestimmenden Faktor für die Entwicklungsgeschwindigkeit der Fischembryonen im Embryotest auszuschließen. In beiden Stationen wurden Forelleneier für einen Forellenembryotest sowie adulte Bachforellen für Untersuchungen toxischer und endokriner Wirkungen exponiert. Abb : Entnahme und Wiedereinleitung von Wasser an der Argen 10

11 Freilandstationen Abb : Bypass-Station an der Argen im Bauwagen Abb : Entnahme und Wiedereinleitung von Wasser an der Schussen Abb : Bypass-Station an der Schussen: Pumpwerk und Hebepumpe Technische Umsetzung Das Flusswasser wird an den beiden Stationen von einer außerhalb der Versuchsstation in einer separaten Hütte eingebauten selbstansaugenden Kreiselpumpe (SAER AP97-B; s. 11

12 Freilandstationen Abb ) mit einer elektrischen Leistung von max 1,3kW) über einen Saugkorb, der grobe Partikel mit einer Korngröße > 5mm abscheidet, in einen Vorratsbehälter gefördert (s. Abb ). Dieser Vorratsbehälter dient dazu, kleinere Schwebstoffpartikel durch Sedimentation abzuscheiden. Die mittlere Aufenthaltsdauer des Flusswassers im Vorratsbehälter beträgt etwa 3,5 min. Vom Vorratsbehälter wird das Wasser über eine zweite Pumpe (Calpeda A40-110) über 2 separate Stränge in die Aquarien gefördert. In Strang 1 durchläuft das Wasser einen Durchlauferhitzer mit einer elektrischen Leistung von 6 kw (Infinity D-EWT-6), der die Temperatur um max. 8 K über die Eingangstemperatur anhebt. Die Ausgangstemperatur des Durchlauferhitzers wird über einen PID-Regler mit nachgeschaltetem Halbleiterrelais elektronisch geregelt. Dieser beheizte Strang versorgt zwei der fünf Becken mit Frischwasser, während die Becken 3 bis 5 über Strang 2 mit thermisch unbeeinflusstem Frischwasser gespeist werden. Der Wasserstand in den Becken wird durch einen Überlauf konstant gehalten. Das Rücklaufwasser aller Becken wird in einem gemeinsamen Sammelrohr in den Vorfluter zurückgeleitet. Um die Einflüsse der technischen Anlagen auf die Versuchsergebnisse möglichst gering zu halten, wurden alle medienberührten Anlagenteile entweder in Edelstahl (Werkstoffnr ), Glas oder PTFE ausgeführt. Lediglich die beiden Pumpengehäuse bestehen aus Grauguss. Die Steuerung der Anlage erfolgt über eine speicherprogrammierte Kleinsteuerung (Moeller Easy 600; s. Abb ). Über diese Steuerung wird der Füllstand des Vorratsbehälters überwacht und füllstandsabhängig die beiden Pumpen geschaltet. Weiterhin werden durch die Steuerung die Daten verschiedener Sensoren und Störmelder überwacht und beim Überschreiten vorgegebener Grenzwerte über ein an die SPS angeschlossenes GPRS- Modem entsprechende Warnmeldungen als SMS verschickt. Bei Ausfall einer der beiden Pumpen wird über einen Kompressor Druckluft in die Becken eingeblasen, um einem Absinken der Sauerstoffkonzentration entgegenzuwirken. Ein ebenfalls in die Steuerung integrierter Datenlogger zeichnet wichtige Parameter, wie Sauerstoffgehalt des Wassers, Wassertemperatur, Lufttemperatur, elektrische Leitfähigkeit und Durchfluss in den beiden Speisesträngen in 10-Minuten-Intervallen auf. Sowohl die Steuerung als auch der Kompressor werden über getrennte Notstromversorgungen im Falle eines Stromausfalls für maximal etwa 10 Stunden mit Strom versorgt. Die Abb und zeigen die beiden Anlagen in situ. 12

13 Freilandstationen Abb : Pumpenhütte mit Förderpumpe Abb : Vorratsbehälter mit Verteilerpumpe, Durchlauferhitzer und einem Teil der Sensorik 13

14 Freilandstationen Abb : Anlagensteuerung Abb : Bypass-Anlage an der Schussen 14

15 Freilandstationen Abb : Bypass-Anlage im Bauwagen an der Argen bei Pflegelberg 15

16 Probenahmen 3.3. Probenahmen Freiland Im Jahr 2010 fanden drei, 2011 vier Freilandprobenahmen statt, bei denen Fische (Döbel, Leuciscus/Squalius cephalus, und Schneider, Alburnoides bipunctatus), Wasser und Sedimentproben aus Schussen und Argen entnommen wurden. Die Fische wurden vor Ort präpariert und die Proben wurden sofort entweder chemisch fixiert (für histologische Untersuchungen) oder in flüssigem Stickstoff (für biochemische Untersuchungen) bzw. auf Trockeneis eingefroren (für chemische Analytik). Zusätzlich wurden zu jedem Zeitpunkt von der Kläranlage Langwiese 24h-Sammelproben vom Kläranlagenablauf zur Verfügung gestellt. Am fand in Kooperation mit Herrn Dr. Manuel Konrad, Regierungspräsidium Tübingen und Herrn Peter Rey, Hydra Konstanz, eine zusätzliche Beprobung von Döbeln an der Argen statt. Tab Probenahmetermine Freiland Vorstudie (2009) und Hauptstudie (2010 und 2011) Probenahmecode Datum Wasserverhältnisse PN A nach Hochwasser PN B Niedrigwasser PN C 29./ nach starkem Hochwasser PN D 19./ Niedrigwasser PN E 12./ Normalwasser PN F 9./ Niedrigwasser PN G Niedrigwasser PN H Normalwasser PN extra Argen (AR) Normalwasser PN J 27./ Normalwasser Folgende Proben wurden bei den Freilandprobenahmen gewonnen bzw. zur Analytik zur Verfügung gestellt: Uni Tübingen: Fische (Histopathologie, Stressproteinanalysen, Biotransformationsenzyme), Wasser, Sediment, Kläranlagenablauf (Embryotest Zebrabärblinge) TZW Karlsruhe: Fische, Wasser, Sediment, KA-Ablauf; PN D und E: nur KA-Ablauf Uni Frankfurt: Sediment plus KA-Ablauf (Potamopyrgus-Tests) Recetox Brno: Sediment plus KA-Ablauf (in vitro Tests) 16

17 Probenahmen Uni Stuttgart: Wasser plus KA-Ablauf (E-Screen) plus außerplanmäßig Fische aus Vorstudie für chemische Analytik von persistenten Stoffen Fischproben wurden in Tübingen gefriergetrocknet und pulverisiert. Wasser- und Sedimentproben wurden in gekühltem bzw. gefrorenem Zustand verschickt bzw. zur Verfügung gestellt. Abb : Beprobung vor Ort Expositionen und Probenahmen in den Bypass-Stationen Die Bypass-Stationen waren Ende 2010 fertig gestellt, so dass Anfang 2011 die ersten Fischeier bzw. männlichen Forellen (Bachforellen, Salmo trutta f. fario, bzw. Regenbogenforellen, Oncorhynchus mykiss) exponiert werden konnten. Eier von Bach- und Regenbogenforellen Die Forelleneier wurden direkt nach Befruchtung von der Forellenzucht Störk, Bad Saulgau, zu den Bypass-Stationen sowie ins Labor transportiert und dort in speziell angefertigte Aquarieneinsätze überführt. Die Befruchtungsrate wurde in einem gesonderten Ansatz im Labor bestimmt. Während der gesamten Expositionsdauer wurde kontinuierlich die Anzahl der gestorbenen Embryonen/Larven notiert (Mortalität). Des Weiteren wurde der Zeitpunkt bestimmt, ab dem die Augen der Embryonen pigmentiert waren (Augenpunktstadium). Der Schlupfbeginn und die Schlupfdauer waren ebenfalls Endpunkte. Einige Tage nach dem Schlupf wurden die Herzschlagrate (Anzahl Herzschläge/min) von zehn Larven bestimmt. Als Endpunkt swimup wurde der Zeitpunkt festgehalten, ab dem der Dottersack der Larven aufgebraucht war und diese begannen, frei im Wasserkörper zu schwimmen und selbstständig Nahrung 17

18 Probenahmen aufzunehmen. Larven für die Hsp70-Analysen und histologische Untersuchungen wurden nach dem Schlupf sowie ca. 4 Wochen später beprobt. Abb : Expositionseinheiten für Eier in den Bypässen Tab : Exposition Forelleneier 2010/2011; Zeitpunkte, zu denen Endpunkte untersucht wurden Ort Versuchsstart Augenpunktstadium Schlupf Herzschlagmessung Erste Probenahme Histolgie/Hsp Bachforellen Labor Expositionszeit 0d 21d 45d-52d 51d 77d Bachforellen Schussen Expositionszeit 0d 52d 74d-77d 83d 86d Bachforellen Argen Expositionszeit 0d 73d 81d-85d 87d 86d Regenbogenforellen Labor Expositionszeit 0d 28d 50d 56d 58d Regenbogenforellen Schussen Expositionszeit 0d 56d 44d-47d 53d 58d Regenbogenforellen Argen Expositionszeit 0d 43d 51d-55d 58d 58d Tab : Exposition Forelleneier 2011/12 Ort Versuchsstart Augenpunktstadium Schlupf Herzschlagmessung Erste Probenahme Histolgie/Hsp Bachforellen Labor Expositionszeit Becken 5 0d 28d 53d 63d 77d Becken 6 0d 28d 58d 63d 77d Bachforellen Schussen Expositionszeit Becken beheizt 0d 47d 58d 68d 76d 18

19 Probenahmen Becken unbeheizt 0d 49d 57d 68d 76d Bachforellen Argen Expositionszeit Becken beheizt 0d 49d 63d 68d 76d Becken unbeheizt 0d 55d 65d 68d 76d Adulte männliche Bach- und Regenbogenforellen Als Vorversuch zur Optimierung der Versuchsanlagen wurden im ersten Schritt im Januar 2011 adulte Regenbogenforellen (Herkunft: Forellenzucht Dietmayer, Hettingen) in die Freilandstationen eingesetzt. Von diesen wurden Proben für Stressproteinanalysen, Histologie und EROD-Assays gewonnen. Nach Optimierung der Anlagen wurden 2011 und 2012 adulte männliche Bachforellen (2011: Forellenzucht Störk, Bad Saulgau; 2012: Forellenzucht Schindler, Alpirsbach) eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden parallel Fische gegenüber 5-30 ng 17α- Ethinylestradiol (EE2) / L exponiert. Als Negativkontrolle wurden die Tiere in aufbereitetem Leitungswasser gehalten. Von den exponierten Tieren wurden entsprechend nachfolgender Tabelle Blut für Vitellogeninbestimmungen entnommen. Zusätzlich wurden Organe für Stressproteinanalysen und Histopathologie sowie für die Bestimmung des Zustandes der Gonaden entnommen. Tab : Expositionen im Bypass 2010/2011 Regenbogenforellen SCHUSSEN ARGEN Versuchsbeginn Anzahl eingesetzter Tiere 8 8 Expositionszeitraum (d) 65d 43d Probenahme PN 1: Anzahl beprobter Tiere 8 8 Bachforellen LABOR neg. LABOR pos. SCHUSSEN Gunzenhaus Versuchsbeginn Anzahl eingesetzter Tiere Expositionszeitraum (d) 33d (Eingewöhnung) 12d (1ng EE2/L) 61d 26 d (5ng EE2/L) 43 d 43 d Probenahmecode (Zeitpunkt) PN 4 Labor neg./pos. ( ) PN 1 G / P ( ) Anzahl beprobter Tiere ARGEN Pflegelberg Tab : Expositionen im Bypass 2011/2012 Bachforellen LABOR neg. LABOR pos. SCHUSSEN ARGEN 19

20 Probenahmen Versuchsbeginn Anzahl eingesetzter Tiere Expositionszeitraum (d) 39d (Eingewöhnung) d (5-30 ng EE2/L) Probenahme PN 15 Labor pos./neg. ( ) PN 12 G / P ( ) Anzahl beprobter Tiere Abb : Blutentnahme von in den Bypässen exponierten männlichen Bachforellen Da aus der Literatur bekannt ist, dass Vitellogeninuntersuchungen auch an juvenilen Fischen möglich sind, da bei diesen durch äußere östrogene Einflüsse die Vitellogeninbildung induziert werden kann (Stalter et al., 2010), wurde zunächst ein Laborversuch mit 16d alten Bachforellen durchgeführt, die gegenüber 40 ng EE2/L exponiert wurden. Daraufhin wurden aus den Bypass-Stationen 76d, 98d und 111d alte Fische beprobt, die in den Stationen geschlüpft waren. Tab : Laborversuch zur Vitellogenin-Induktion bei juvenilen Forellen LABOR neg. LABOR pos. Versuchsbeginn Anzahl eingesetzter Tiere Expositionszeitraum (d) 16d (40ng EE2/L) Probenahme Anzahl beprobter Tiere Literatur: Stalter, D., Magdeburg, A., Weil, M., Knacker, T., Oehlmann, J. (2010). Toxication or detoxication? In vivo toxicity assessment of ozonation as advanced wastewater treatment with the rainbow trout. Water Research 44:

21 Elektrobefischungen 3.4. Elektrobefischungen Die Elektrobefischungen wurden von Brigitte Engesser, ISF Langenargen koordiniert und von ihr zusammen mit Kurt Sarembe und Andreas Schießl, ebenfalls ISF Langenargen durchgeführt. Im August 2010 sowie im Oktober 2011 war zusätzlich Peter Rey, Hydra Konstanz mit MitarbeiterInnen an der Elektrobefischung beteiligt. Abb : Elektrobefischungen an Schussen und Argen 21

22 Testorganismen 3.5. Testorganismen Freiland: An allen Probestellen wurden Döbel (Leuciscus/Squalius cephalus) und Schneider (Alburnoides bipunctatus) entnommen. Abb : Döbel (Leuciscus/Squalius cephalus) Abb : Schneider (Alburnoides bipunctatus) Zusätzlich zu den Fischen wurden Flohkrebse (Gammarus pulex / roeseli), wenn möglich in Präcopulastellung entnommen. Vor Ort wurden Eier und juvenile Tiere in der Bruttasche gezählt. Abb : Gammarus Präcopula Abb.3.5.4: Gammarus mit Brut Bypass-Stationen: An den Bypass-Stationen wurden Eier von Bachforellen (Salmo trutta f. fario) und Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss), adulte männliche Bach- und Regenbogenforellen sowie Flohkrebse exponiert. 22

23 Testorganismen Abb : Verschiedene Entwicklungsstadien der Bachforelle Labortests Im Labor wurden Zwergdeckelschnecken (Potamopyrgus antipodarum) und Zebrabärblinge (Danio rerio) gegenüber Wasser- und Sedimentproben sowie gegenüber Kläranlagenablauf exponiert. Abb : Zwergdeckelschnecke Abb : Zebrabärbling Abb.3.5.8: Embryo des Zebrabärblings in der Eihülle 23

24 Genehmigungen 3.6. Genehmigungen Für das Projekt wurden folgende Genehmigungen eingeholt bzw. Maßnahmen angezeigt: 1. Tierversuchsgenehmigung nach dem Tierschutzgesetz zur Durchführung von Untersuchungen mit männlichen Forellen und Forelleneiern. Antrag vom : Genehmigung vom beim Regierungspräsidium Tübingen über die Tierschutzbeauftragte der Universität Tübingen. Tierversuchsnummer: ZU 1/09 2. Genehmigung zur Entnahme und Wiedereinleitung von Wasser aus Schussen und Argen beim Landratsamt Ravensburg. 3. Anzeige/ Mitteilung von Eingriffen und Behandlungen an Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken: Entnahme von Döbeln und Schneidern aus Schussen und Argen am beim Regierungspräsidium Tübingen über die Tierschutzbeauftragte der Universität Tübingen. 24

25 Limnochemie 4. Resultate 4.1. Limnochemische Untersuchungen Katja Bader, Stefanie Krais, Marlene Langjahr, Dr. Raphaela Osterauer, Katharina Peschke, Carolin Schultz & Prof. Dr. Rita Triebskorn, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen. a) Stichproben Die Ergebnisse der limnochemischen Untersuchungen zu den Probenahmeterminen sind in nachfolgenden Tabellen zusammengefasst PN C 29./ (starkes Hochwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2 - ) [mg/l] Nitrat (NO3 - ) [mg/l] Ammonium (NH4 + ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO43- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :30 18,6 27,8 9,4 105, ,1 0,06 4,2 0,02 29,5 1, P :15 19,1 24,9 8,98 100, ,93 0,03 4,1 0, , P :50 19,4 26,2 8,29 94, ,85 0,06 4,6 0, P :15 19,2 18,2 8,9 101, ,05 0,05 4,1 0, P4 (Oberau) :30 14,8 19,6 9,7 102, ,03 0,02 1,3 0 15,5 0, P4 kl.zufluss :15 15,3 23,7 9,6 103, ,08 0,01 1, , P :30 16,7 21,3 9,4 101, ,99 0, , PN D 19./ (Niedrigwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2- ) [mg/l] Nitrat (NO3- ) [mg/l] Ammonium (NH4+ ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO43- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :30 16,3 20 9,58 102, ,14 0,03 4,1 0, , P :00 16, ,1 106, ,22 0,04 3, , P :30 15,5 21 9,56 100, ,1 0,04 3, , P4 (Oberau) :15 15, ,16 107, ,21 0,03 1, , P :25 17, ,4 114, ,37 0,02 2, , P :30 16, ,09 107, ,9 0,04 5,2 0, , Karbonathärte [ dh] Karbonathärte [ dh] 25

26 Limnochemie PN E 12./ (Mittelwasserstand) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2 - ) [mg/l] Nitrat (NO3 - ) [mg/l] Ammonium (NH4 + ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO4 3- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :20 10,3 10,7 10,51 99, ,4 0, , P :20 9,8 9,2 10,50 97, ,6 0, , P :18 9,7 9,0 10,90 101, ,12 0,01 4, , P4 (Oberau) :05 8,5 6,9 10,50 96, ,3 0, , P :55 10,3 13,1 11,80 111, ,38 0,02 8 0, , P :30 10,5 11,3 9, ,43 0,01 4, , Karbonathärte [ dh] PN F 9./ (Niedrigwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2 - ) [mg/l] Nitrat (NO3 - ) [mg/l] Ammonium (NH4 + ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO43- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :19 15,8 18,6 10,0 105, ,54 0,06 4,3 0, , P :33 16,1 22,9 10,8 114, ,55 0,04 4,1 0, , P :11 16,4 24,2 10,4 110, ,62 0,08 4,3 0, , P4 (Oberau) :15 13,4 17,8 11,1 112, ,54 0,04 1,4 0, , P :40 14,8 19,0 10, ,41 0,01 1, , P :08 15,5 17,6 8,3 85, ,3 0, , , Karbonathärte [ dh] PN G (Niedrigwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2- ) [mg/l] Nitrat (NO3- ) [mg/l] Ammonium (NH4+ ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO43- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :10 20,2 28,0 9,2 108, ,02 0,02 3,5 0, , P : ,4 9,0 106, ,64 0,11 2,8 0, , P :50 19,7 25,2 8,8 100, ,58 0,12 4,7 0, , P4 (Oberau) :20 16,6 19,8 9,9 108, ,6 0,02 1, , P :15 17,9 22,8 9, ,39 0,09 1,8 0, , P :55 19,9 27,7 6,7 78, ,49 0,14 4 0,13 2 0, Karbonathärte [ dh] 26

27 Limnochemie PN H (Normalwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2 - ) [mg/l] Nitrat (NO3 - ) [mg/l] Ammonium (NH4 + ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO4 3- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :31 16,6 18,2 8,23 87, ,56 0,04 4,5 0, , P :50 16,1 18,8 8,43 88, ,51 0,05 3,3 0, , P :53 16,8 17,6 6,97 74, ,53 0,04 4 <0, , P4 (Oberau) :18 15,2 24,1 9,85 102, ,62 0,03 1,2 <0,04 15 <0, P :05 16,1 22,2 9,82 102, ,42 <0,02 1,9 <0,04 15 <0, P :16 17,1 21,2 737,00 7, ,31 0,04 4,2 0, , Karbonathärte [ dh] PN J 27./ (Normalwasser) Temp. Wasser [ C] Temp. Luft [ C] Sauerstoffgehalt [mg/l] Sauerstoffsättigung [%] Leitfähigkeit [µs/cm] ph- Wert Nitrit (NO2 - ) [mg/l] Nitrat (NO3 - ) [mg/l] Ammonium (NH4 + ) [mg/l] Chlorid (Cl - ) [mg/l] Ortho- Phosphat (PO4 3- ) [mg/l] Gesamthärte [ dh] P :00 8,5 10,5 11,8 107, ,43 0,025 5,1 0,07 26 <0, P :25 8,7 8,9 11,8 107, ,41 0,022 2,9 0,14 23 <0, P :30 9,5 12,5 11,0 107, ,4 0,022 3,5 0,05 27 <0, P4 (Oberau) :45 9,5 11,7 13,7 128, ,4 0,008 0,8 <0,04 11 <0, P :08 9,5 5,9 11,7 102, ,27 0,009 1,4 <0,04 15 <0, P :45 10,1 5,9 8,6 79, ,89 0,041 7,2 0, , Karbonathärte [ dh] 27

28 Sauerstoffkonz. [mg/l] Durchfluss Q [l/min] El. Leitfähigkeit [µs/cm] Wassertemperatur [ C] Limnochemie Außer von Probestelle 6 (Schussenmündung) können die limnochemischen und physikochemischen Daten von allen Probestellen als gut bis sehr gut eingestuft werden. Hierbei liegen die Messwerte an der Argen (P4) meistens unter denjenigen der Schussen. An der Schussenmündung sind vor allem Ammonium, Nitrat und Chlorid als problematisch einzustufen. b) Kontinuierliche Messungen über Datenlogger Die Überwachung der Durchflussmenge sowie der elektrischen Leitfähigkeit, Wassertemperatur und Sauerstoffkonzentration erfolgte während der Exposition der Fischeier und Fische kontinuierlich an den beiden Bypass-Stationen über Datenlogger. Diese wurden vom BBW Weyhmüller installiert und gewartet. Insgesamt gesehen sind keine besonderen Extremwerte aufgefallen. Die Sauerstoffsättigung lag an der Argen immer im Sättigungsbereich und betrug an der Schussen stets zwischen 80% und 120%. Die Leitfähigkeit des Wassers war an der Schussen deutlich höher und stärker schwankend als an der Argen. Die Temperatur zeigte naturgemäß eine starke diurnale und saisonale Schwankungsbreite. Tendenziell war die Argen um 1-2 C kühler als die Schussen. Loggerdaten Station Gunzenhaus April Durchflusssensor blockiert Durchfluss Q El. Leitfähigkeit Wassertemperatur Sauerstoff-Konzentration 1 Apr 6 Apr 11 Apr 16 Apr 21 Apr 26 Apr Datum Abb : Beispiel für eine Datenloggeraufzeichnung an der Station Gunzenhaus im April

29 Limnochemie Tab : Zusammenfassende Bewertung: grün: guter Zustand; gelb: erhöhte Werte; orange: problematische Werte Kurzzusammenfassung: Limnochemische Untersuchungen Lediglich an Probestelle 6 (Schussenmündung) temporär problematische Werte für Ammonium, Nitrat und Chlorid Gute Sauerstoffversorgung in den Bächen und Bypass-Systemen Argen im Schnitt 1-2 C geringere Durchschnittstemperatur als Schussen Bearbeitung des Teilprojektes Stefanie Krais, Katharina Peschke, Krisztina Vincze, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; ; stefanie.krais@uni-tuebingen.de; Michael Weyhmüller, BBW Achberg, Am Königsbühl 15, Achberg; ; info@biologiebuero-weyhmueller.de 29

30 Chemische Analytik (Hauptanalysen) 4.2. Chemische Analytik Hauptanalysen TZW Karlsruhe Einleitung Im Projektteil chemische Analysen sollte die chemische Beschaffenheit des eingeleiteten Abwassers ebenso charakterisiert werden wie die Qualität der Schussen. Zusätzlich wurden die Sediment- und Fischproben aus der Schussen chemisch auf Umweltchemikalien analysiert. Der Umfang der Untersuchungen enthielt u.a. Pflanzenschutzmittel (PSM) und PSM-Metabolite, Arzneimittelrückstände, hormonell wirksame Stoffe, Flammschutzmittel, synthetische Komplexbildner und künstliche Süßstoffe, aber auch Schwermetalle. Über die Untersuchungen im Gewässer hinaus wurden auch Gewebeproben oder Vollhomogenate exponierter Tiere (Fische, Gammariden) parallel zu den Effektuntersuchungen auf das Vorkommen von organischen Mikroverunreinigungen untersucht. Durch diese analytischen Untersuchungen sollte es möglich sein, die Präsenz der Spurenstoffe in der Schussen mit deren Effekten zu korrelieren. Methodik Zur Bestimmung der Belastungssituation von Kläranlagenabläufen und der Oberflächengewässer wurden verschiedene Gaschromatographische (GC-MS bzw. GC- ECD) und Flüssigchromatographische (HPLC bzw. HPLC-MS/MS) Messverfahren eingesetzt. Hierzu wurden 10 ml bis 1000 ml Probenwasser eingesetzt, mit einem internen Standard (z.b. Isotopenverdünnungsmethode) versetzt und mittels Festphasenextraktion oder Flüssig/Flüssig-Extraktion angereichert. Die Extrakte wurden je nach Analysenverfahren weiter aufbereitet und gemessen. Die substanzspezifischen Bestimmungsgrenzen variieren je nach Analysenverfahren zwischen 10 ng/l und 1000 ng/l. Die Gewebeproben von Schneider und Döbel (gesamter Fisch, Leber, Muskel, Gonaden etc.) wurden durch die Universität Tübingen gefriergetrocknet und homogenisiert bereitgestellt. Von den getrockneten Fischproben bzw. Sedimentproben wurden 100 mg bis 500 mg mit dem jeweiligen Analysenverfahren und angepassten Extraktionsverfahren (jeweils spezifisch für die jeweiligen Substanzen) extrahiert. Neben dem oxidativen Aufschluss für die Elementanalytik wurden Extraktionsverfahren wie Ultraschallverfahren, Schüttelverfahren und ASE eingesetzt. Dabei wurden Mischungen von Methanol und Acetonitril, Cyclohexan und Aceton oder auch Einzellösungen wie Aceton und Toluol als Extraktionsmittel verwendet. Zum Teil wurde als Extraktreinigungsverfahren für die 30

31 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Feststoffextrakte die jeweilige Festphasenextraktion nachgeschaltet. Bei den restlichen Verfahren wurde der Feststoffextrakt (Sediment- oder Fischextrakt) ohne weitere Aufbereitung direkt gemessen. Die Messmethoden entsprechen denen der Wasseranalytik (HPLC, HPLC-MS/MS, GC-MS, GC-ECD, ICP-MS/OES). Ergebnisse Für ca. 70 Substanzen liegen Messwerte über die Jahre 2010 und 2011 für die Kläranlagenabläufe (insgesamt 7 Beprobungen) und Oberflächengewässer (pro Probestelle insgesamt 2 Beprobungen) vor. Folgende Stoffgruppen wie Arzneimittelrückstände, aliphatische Amine, hormonell wirksame Verbindungen, Pflanzenschutzmittel und deren Metabolite, Korrosionsinhibitoren (Benzotriazole), synthetische Süßstoffe, synthetische Komplexbildner, Flammschutzmittel und Schwermetalle wurden untersucht. Von den insgesamt 70 untersuchten Einzelverbindungen wurden im Kläranlagenablauf und Oberflächenwasser bis zu 30 Verbindungen nachgewiesen (Abb ). Die am häufigsten gefundenen Verbindungen wurden im Kläranlagenablauf bei der Beprobung im Juli 2011 detektiert. Insgesamt gesehen liegen die nachgewiesenen Verbindungen in den untersuchten Proben im Oberflächenwasser zu ca. 50 % niedriger als in den Kläranlagenabläufen, was auf den Verdünnungseffekt durch das Oberflächenwasser zurückzuführen ist. Eine Zusammenfassung zu der Anzahl der analysierten Parameter und der Anzahl von detektierten Verbindungen ist im Kapitel Zusammenfassung Chem. Analytik zu finden. Insgesamt zeigt sich über den gesamten Untersuchungszeitraum ein konstantes Bild der Anzahl der positiv detektierten Verbindungen pro Messstelle. Bei den häufig nachgewiesenen Verbindungen handelt es sich um die Korrosionsinhibitoren 1H-Benzotriazol, 4-Methylbenzotriazol, 5-Methylbenzotriazol, zwei Arzneimittel-Metaboliten von Metamitzol, N-Acetyl-4-aminoantipyrin und N-Formyl-4-aminoantipyrin, die Arzneimittel Sulfamethoxazol, Carbamazepin und Diclofenac, das Flammschutzmittel Tris-(2-chlorpropyl)- phosphat und den künstlichen Süßstoff Acesulfam (Abb ). Die Konzentrationen der genannten Verbindungen im Oberflächenwasser liegen bei maximal 420 ng/l. In dem Vorfluter Schussen wurden Konzentrationen z.b. des Schmerzmittels Diclofenac von bis zu 160 ng/l und des Korrosionshemmers 4-Methylbezotriazol bis zu 420 ng/l ermittelt. Eine Ausnahme ist der künstliche Süßstoff Acesulfam, der mit einer Konzentration von bis zu 2000 ng/l im Vorfluter Schussen nachgewiesen wurde. In den untersuchten Kläranlagenabläufen wurden für nahezu alle Verbindungen eine 10fach höhere Konzentrationen als im Oberflächenwasser nachgewiesen (Abb ), was in etwa dem Verhältnis gereinigtes Abwasser zu Oberflächenwasser in der Schussen entspricht. 31

32 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Anzahl analysierter Parameter Anzahl positiver Befunde Jun 10 Jun 10 Jun 10 Mai 11 Mai 11 Schussen (oberhalb KA) Schussen (unterhalb KA) Argen Schussen (unterhalb KA) Argen Anzahl analysierter Parameter Anzahl positiver Befunde Jun 10 Aug 10 Okt 10 Mai 11 Jul 11 Sep 11 Okt 11 KA-Ablauf KA-Ablauf KA-Ablauf KA-Ablauf KA-Ablauf KA-Ablauf KA-Ablauf Abb : Anzahl der nachgewiesenen Verbindungen in den untersuchten Oberflächengewässern (OFW) und Kläranlagenabläufen (KA-Ablauf). Nickel wurde als einziges Schwermetall in einer Konzentration von maximal 0,003 mg/l im Kläranlagenablauf gefunden. Somit sind die untersuchten Wasserproben gering mit Metallen belastet. Die Messstelle an der Schussen oberhalb der Kläranlage (P00), die ursprünglich als Kontrollstelle geplant war, stellte sich als eine ebenfalls stark mit Kläranlagenablauf belastete Oberflächenwassermessstelle heraus, weshalb sie bei den folgenden Probenahmen nicht mehr untersucht wurde. Als Kontrollstelle wurde eine Probestelle an der Argen ausgewählt. Die Konzentrationen an der Schussen (P3) und der Argen (P4) zeigen zueinander deutliche Unterschiede in ihrer Belastungssituation. Beispielsweise liegen die Messwerte für Diclofenac an der Schussen ca. 10fach höher als an der Argen. Dieser Trend zeigt sich weitestgehend auch bei den übrigen Verbindungen. Die im Vergleich zur Argen höheren Konzentrationen an Spurenstoffen im Oberflächenwasser der Schussen sind größtenteils darauf zurückzuführen, dass aufgrund des deutlich niedrigeren Gebietsniederschlags an der Schussen im Vergleich zur Argen der mittlere Abfluss nur halb so hoch ist, dass es zu einer höheren Verdünnung kommt. Über den Untersuchungszeitraum (2010 und 2011) zeigt sich 32

33 Chemische Analytik (Hauptanalysen) für die einzelnen Messstellen der Schussen und Argen wie auch für die Kläranlagenabläufe eine geringe Schwankungsbreite der Einzelstoffkonzentrationen (Abb ) Oberflächenwässer a) OFW, PS 00, Jun 10 OFW, PS 3, Jun 10 OFW, PS 4, Jun 10 OFW, PS 3, Mai 11 OFW, PS 4, Mai 11 ng/l Methylbenzotriazol 5-Methylbenzotriazol Benzotriazol N-Acetyl-4-aminoantipyrin N-Formyl-4-aminoantipyrin Sulfamethoxazol Carbamazepin Diclofenac Tris-(2-chlorpropyl)-phosphat Acesulfam ng/l Methylbenzotriazol Kläranlagenabläufe b) 5-Methylbenzotriazol Benzotriazol N-Acetyl-4-aminoantipyrin N-Formyl-4-aminoantipyrin Sulfamethoxazol Carbamazepin KA, Jun 10 KA, Aug 10 KA, Okt 10 KA, Mai 11 KA, Jul 11 KA, Sep 11 KA, Okt 11 Diclofenac Tris-(2-chlorpropyl)-phosphat Acesulfam Abb a, b: Konzentrationen der sehr häufig nachzuweisenden Spurenstoffe in den Fließgewässern Schussen (P00, P3) und Argen (P4) und den Kläranlagenabläufen (KA). 33

34 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Bei den untersuchten Sedimentproben wurden bei den Substanzklassen Arzneimittelrückstände, hormonell wirksame Verbindungen, Pflanzenschutzmittel und deren Metabolite, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und Flammschutzmittel keine positiven Messwerte ermittelt. Die Ergebnisse zeigen für alle Einzelverbindungen Messwerte unterhalb der substanzspezifischen Bestimmungsgrenzen. Die Schwermetallgehalte von Cadmium, Kupfer, Nickel, Zink und Quecksilber in den Sedimentproben aus den Beprobungen im Jahr 2010 und 2011 liegen bei maximal 45 mg/kg Trockensubstanz (TS). Die Gehalte von Nickel liegen bei allen 5 Sedimentproben im Bereich von ca. 10 mg/kg TS. Dagegen unterscheiden sich die Gehalte an Zink deutlich stärker voneinander. Hier variieren die Gehalte von 20 mg/kg TS für die Messstellen und -zeiten C 4 bzw. F 4 bis zu 45 mg/kg Zink pro TS für die Messstellen und -zeiten C 3 bzw. F 4 (Abb ). Cadmium, Kupfer und Quecksilber wurden nicht in den Sedimentproben gefunden C 00 C 3 C 4 F 3 F 4 mg/kg TS Cadmium Kupfer Nickel Zink Quecksilber Abb : Gehalte der Elemente aus den Sedimentproben der Schussen (C 00, C 3 bzw. F 3) und der Argen (C 4 bzw. F 4). Die Untersuchungen an Gewebeproben von Fischen aus der Schussen ergaben, dass häufig nachgewiesene Schwermetalle Zink und Kupfer sind. Die Gehalte von Zink liegen zwischen 30 mg/kg TS und 330 mg/kg TS. Bei Kupfer wurden Messwerte von bis zu 180 mg/kg TS ermittelt. Bei Untersuchungen von Türkmen et. al. (2008) wurden Gehalte in Meerfisch von Zink bis zu 91,4 mg/kg in der Leber bzw mg/kg im Filet und von Kupfer bis zu 44,6 mg/kg in der Leber bzw mg/kg im Filet, so dass die gefundenen Werte als hoch einzuordnen sind. Besonders hervorzuheben sind die deutlich erhöhten Arsenkonzentrationen von bis zu 180 mg/kg TS in den Schneidern entnommenen Proben von In den übrigen Fischproben konnte kein Arsen gefunden werden (Arsen wurde nur 34

35 Chemische Analytik (Hauptanalysen) im Jahr 2011 untersucht). Im Jahr 2010 sind erhöhte Quecksilberwerte (max. 0,75 mg/kg TS) nachgewiesen worden, dies konnte an den Gewebeproben aus der Probenentnahme im Jahr 2011 nicht bestätigt werden. Die erhöhten Cadmiumgehalte in den Lebern aus Döbeln im Jahr 2010 konnte 2011 ebenso nicht bestätigt werden. Die Schwermetallkonzentrationen der Fischproben von Döbel, Schneider bzw. einzelne Gewebeproben für das Jahres 2011 sowie 2010 sind in der Abb und Abb gezeigt. Schneider und Döbel wie auch die Gammariden weisen ähnlich hohe Gehalte an Zink auf, wobei jedoch Kupfer kaum nachzuweisen ist. In Lebern von Döbeln und bei den Gammariden bestätigen sich im Jahr 2011 die Messwerte vom Jahr 2010 mit erhöhten Kupfergehalten von bis zu 180 mg/kg TS. Quecksilber Schneider Zink Nickel Kupfer Cadmium a) C 00 C 3 C mg/kg TS Döbel-Gonade Quecksilber Zink Nickel Kupfer Cadmium b) mg/kg TS 35

36 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Döbel Quecksilber Zink Nickel Kupfer Cadmium c) mg/kg TS Döbel-Leber Quecksilber Zink Nickel Kupfer Cadmium d) mg/kg TS Abb a-d: Gehalte der Elemente in Gewebeproben von Fischen (Probenahme 2010). 36

37 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Döbel - Leber mg/kg TS a) Cd Cu Ni Zn Hg As mg/kg TS Schneider - Restfisch bzw. Pool b) Cd Cu Ni Zn Hg As 37

38 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Döbel - Restfisch bzw. Filet mg/kg TS c) Cd Cu Ni Zn Hg As 200 mg/kg TS (Gammariden) (Gammariden) (Gammariden) (Schneider - Gonade) (Döbel - Fett) d) Cd Cu Ni Zn Hg As Abbildung a-d: Gehalte der Elemente in Gewebeproben von Fischen (Probenahme 2011). Bei den organischen Einzelverbindungen wurden neben polybromierten Diphenylethern (PBDE) auch polychlorierte Biphenyle (PCB) in den Gewebeproben gefunden. Es wurden die Kongenere PBDE-47 bis PBDE-209 untersucht. In den Gewebeproben wurden die Kongenere PBDE-47, PBDE-100 und PBDE-209 nachgewiesen (Abb ). PBDE-47 wurde mit bis zu 5,6 µg/kg TS in Döbeln, deren innere Organe bereits entnommen waren ( Restfisch ) bzw. in deren Muskulatur ( Filet ) gefunden. In den Gammariden wurde 38

39 Chemische Analytik (Hauptanalysen) vorrangig PBDE-209 gefunden (Abb ). Die Untersuchungen im Jahr 2010 wie auch im Jahr 2011 spiegeln ein ähnliches Bild wieder. Die polychlorierten Biphenyle (PCB) wurden ausschließlich im Jahr 2011 untersucht. Es wurden die Kongenere PCB-138 und PCB-153 gefunden. In den 5 untersuchten Gewebeproben wurden von 24 µg/kg TS bis zu 97 µg/kg TS PCB-153 und für PCB µg/kg TS bis 64 µg/kg TS nachgewiesen. Die höchsten Gehalte von PCB-138 und PCB-153 wurden in der Probe eines Döbels, in welcher Leber und Galle gemeinsam untersucht wurden, gefunden. 6 5 Döbel - Leber a) µg/kg TS BDE-28 BDE-47 BDE-66 BDE-85 BDE-99 BDE-100 BDE-138 BDE-153 BDE-154 BDE-183 BDE Schneider - Restfisch b) BDE-28 BDE-47 BDE-66 BDE-85 BDE-99 BDE-100 BDE-138 BDE-153 BDE-154 BDE-183 BDE-209 µg/kg TS

40 Chemische Analytik (Hauptanalysen) 6 5 Döbel - Restfisch bzw. Filet c) µg/kg TS BDE-28 BDE-47 BDE-66 BDE-85 BDE-99 BDE-100 BDE-138 BDE-153 BDE-154 BDE-183 BDE Gammariden d) BDE-28 BDE-47 BDE-66 BDE-85 BDE-99 BDE-100 BDE-138 BDE-153 BDE-154 BDE-183 µg/kg TS BDE Abbildung a-d: Gehalte der polybromierten Diphenylether (PBDE) in Gewebeproben von Fischen (Probeentnahme 2011). Pharmazeutische Wirkstoffe wie Diclofenac, Carbamazepin und andere sowie weitere Flammenschutzmittel wie z.b. TCPP konnten in den Fischgewebeproben nicht positiv detektiert werden. Für das Jahr 2011 liegen keine weiteren Werte für diese organischen Einzelverbindungen vor (pharmazeutische Wirkstoffe und Flammschutzmittel). Die Verbindungen β-sitosterol (pflanzliches Sterin) wurde mit Gehalten bis zu 5 mg/kg TS und 4- tert.-oktylphenol (endokrin wirkende Substanz) bis zu 0,4 mg/kg in den Fischproben nachgewiesen (hohes Bioakkumulationspotential). 40

41 Chemische Analytik (Hauptanalysen) Diskussion Die untersuchten Probenmatrices (Wasser-, Sediment und Fischgewebeproben) zeigen einen deutlichen anthropogenen Einfluss auf das Gewässer. Die Belastung der Oberflächengewässer durch das kommunale Abwasser lag über den Untersuchungszeitraum hinweg ca. 10fach niedriger als die der Kläranlagenabläufe. Generell hat die Schussen einen höheren Anteil an Kläranlagenablauf gegenüber dem Gesamtabfluss als die Argen. In den Fischen wurden vorrangig polychlorierte Biphenyle (PCB) und polybromierte Diphenylether (PBDE) gefunden. Hier waren PCB-135 und PCB-138 und PBDE-47, PBDE-100 und PBDE- 209 dominierend. Eine Einschätzung zu diesen Einzelergebnissen der PCBs kann noch nicht vorgenommen werden, hierzu werden weitere Untersuchungen notwendig. Bei den polybromierten Diphenylethern findet im Gegensatz zu Umweltproben (Sedimente und Klärschlämme) eine Verschiebung der Kongeneren zu PBDE-47 und PBDE-209 statt. Bei den Sedimentproben wurden aufgrund des sehr grobkörnigen Materials (sandig-kiesig) keine organischen Einzelstoffe festgestellt. Eine Akkumulation von organischen, anthropogenen Verbindungen ist in feinkörnigen Sedimenten bzw. Schwebstoffen der Vorfluter zu vermuten. Eine Tabelle mit allen analytischen Daten und Methodendetails ist Anhang 1 zu entnehmen. Literatur Turkmen, M., Turkmen, A., Tepe, Y. (2008). Metal contaminations in five fish species from Black, Marmara, Aegean and Mediterranean Seas, Turkey J. Chil. Chem. Soc. 53(1): Bearbeitung des Teilprojektes: Dr. Doreen Richter, Dr. Frank Sacher, DVGW-Technologiezentrum Wasser Karlsruher Str. 84, Karlsruhe; ; doreen.richter@tzw.de 41

42 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Zusatzanalytik: Persistente Verbindungen in Fischen aus der Schussen und der Argen* *Dieser Projektteil wurde vom ISWA Stuttgart ohne Finanzierung durchgeführt. Es wurden Tiere analysiert, die vom TZW Karlsruhe nicht benötigt wurden und deshalb zusätzlich zur Verfügung standen. Einleitung Bioakkumulierende Verbindungen wie die polychlorierten Biphenyle (PCB), DDT und seine Abbauprodukte als auch die polybromierten Diphenylether (PBDE) stellen aufgrund ihrer Persistenz klassische Parameter für den Vergleich und die Bewertung von Belastungssituationen in aquatischen Organismen dar. Heutzutage sind die Verteilungen dieser Substanzen in der Umwelt zumindest in Fischen oder Sedimenten aus größeren Oberflächengewässern als diffus und gleichmäßig zu betrachten; Konzentrationsspitzen deuten auf konkrete Punktquellen hin. Eine Mikroverunreinigung mit spezifischem Eintragspfad stellt das Desinfektionsmittel Triclosan dar, das u.a. in kosmetischen Produkten eingesetzt wird. Die Substanz wird zum größten Teil über gereinigte kommunale Abwässer in die aquatische Umwelt eingetragen. Zum Teil schon in der Kläranlage, aber vor allem in aquatischen Organismen wird Triclosan zu Methyltriclosan transformiert. Die Methylierung führt zu einer erheblichen Steigerung der Bioakkumulierbarkeit der Verbindung, die als eine wichtige Indikatorsubstanz für den Einfluss von kommunalen Abwässern auf z.b. Fische zu werten ist. Im Rahmen des Projektes wurden ergänzende Untersuchungen zum Vorkommen der obengenannten Mikroverunreinigungen in drei Fischen aus der Schussen durchgeführt. Methodik Die Bestimmung der Indikator-PCB (PCB-28, - 52, -101, -138, -153 und 180), der PBDE- Kongenere BDE-47, -99 und 100, von DDT, DDE, DDD und Methyltriclosan wurde in einer Barbe (Barbus barbus), einem Schneider und einem Döbel, die bereits 2009 unterhalb der Kläranlage gefangen worden waren, sowie in Forellen, welche in den Bypass-Systemen exponiert worden waren, durchgeführt. Die tiefgefrorenen nach Stuttgart gelieferten Fische (Barbe, Döbel, Schneider) wurden aufgetaut und in Filet, Innereien und Haut separiert. Nach der Gefriertrocknung und dem Homogenisieren der Proben erfolgte eine 12h-Soxhlet- Extraktion mit n-hexan. Die über Kieselgel aufgereinigten Soxhlet-Extrakte wurden mittels HRGC/LRMS gemessen. Die Quantifizierung erfolgte über die Isotopenverdünnungsmethode ( 13 C-markierte Standardverbindungen). 42

43 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Resultate Die Untersuchungsergebnisse sind in den folgenden Tabellen, jeweils auf Frischgewicht und auf Trockensubstanz bezogen, dargestellt. Die Bestimmungsgrenzen liegen für die einzelnen Substanzen im Bereich von < 0,1 ng/g Frischgewicht. Barbe Probestelle 3 (alle Angaben in ng/g) Gruppe Einzelsubstanz Filet Innereien Haut TS FW TS FW TS FW PCB PCB028 4,0 0,9 13,5 3,6 7,7 2,8 PCB052 10,2 2,4 24,4 6,6 16,8 6,1 PCB101 52,2 12,2 185,2 49,6 85,3 30,7 PCB118 31,1 7,3 144,1 38,6 49,2 17,7 PCB ,9 43,3 236,8 63,5 222,0 79,9 PCB ,3 25,6 211,2 56,6 179,8 64,7 PCB180 70,1 16,4 137,6 36,9 110,5 39,8 Summe PCB 6 430,7 100,8 808,8 216,8 622,1 223,9 DDX DDE 82,4 19,3 166,2 44,5 135,3 48,7 DDT 4,5 1,1 27,9 7,5 7,4 2,7 DDD 3,1 0,7 15,7 4,2 4,7 1,7 Summe DDX 90,1 21,1 209,8 56,2 147,5 53,1 Sonstige Methyltriclosan PBDE BDE047 28,6 6,7 64,6 17,3 45,8 16,5 BDE099 1,0 0,2 3,2 0,9 1,3 0,5 BDE100 3,4 0,8 6,1 1,6 4,4 1,6 Summe PBDE 33,0 7,7 73,9 19,8 51,5 18,6 Schneider Probestelle 3 (alle Angaben in ng/g) Gruppe Einzelsubstanz Filet Innereien Haut TS FW TS FW TS FW PCB PCB028 2,4 0,5 5,5 1,5 6,3 2,0 PCB052 3,7 0,8 12,1 3,3 14,8 4,6 PCB101 18,6 3,8 52,8 14,6 97,7 30,3 PCB118 8,2 1,7 28,0 7,8 43,3 13,4 PCB153 45,9 9,4 155,2 43,1 111,2 34,5 PCB138 37,1 7,6 107,0 29,7 80,7 25,0 PCB180 34,6 7,1 74,4 20,6 42,4 13,1 Summe PCB 6 142,3 29,2 407,0 112,9 353,0 109,4 DDX DDE 19,8 4, ,5 38,1 11,8 DDT 2,0 0,4 2 0,5 4,4 1,4 DDD 0,0 0,0 1 0,4 2,1 0,7 43

44 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Summe DDX 21,8 4, ,4 44,6 13,8 Sonstige Methyltriclosan PBDE BDE047 12,0 2,5 26,1 7,2 22,5 6,9 BDE099 0,8 0,2 1,5 0,4 1,3 0,4 BDE100 1,3 0,3 2,9 0,8 2,5 0,8 Summe PBDE 14,1 2,9 30,4 8,4 26,3 8,1 Döbel Probestelle 3 (alle Angaben in ng/g) Gruppe Einzelsubstanz Filet Innereien Haut TS FW TS FW TS FW PCB PCB028 3,0 0,7 14,0 5,1 4,4 1,4 PCB052 4,9 1,1 40,5 14,6 9,7 3,0 PCB101 19,0 4,4 123,5 44,5 72,8 22,6 PCB118 10,8 2,5 49,1 17,7 2,7 0,8 PCB153 49,8 11,5 156,9 56,6 89,0 27,6 PCB138 38,6 9,0 189,6 68,4 76,5 23,7 PCB180 25,6 5,9 106,3 38,3 34,0 10,5 Summe PCB 6 140,8 32,7 630,8 227,5 286,3 88,7 DDX DDE 31,3 7,3 98,1 35,4 39,2 12,1 DDT 2,8 0,7 27,3 9,8 5,5 1,7 DDD 1,1 0,3 5,8 2,1 1,9 0,6 Summe DDX 35,2 8,2 131,2 47,3 46,7 14,5 Sonstige Methyltriclosan PBDE BDE047 12,81 2,97 63,9 23,1 25,8 8,0 BDE099 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. BDE100 1,51 0,35 7,7 2,8 2,9 0,9 Summe PBDE 14,3 3,3 71,6 25,8 28,7 8,9 44

45 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Daten zu PCB 7, Methyltriclosan und PBDE für Döbel von Probestelle 3 (Schusssen unterhalb KA Langwiese [µg/kg], (PN F) PN-Stelle Art Polychlorierte Biphenyle (PCB) in ng/g Trockensubstanz Methyltriclosan in Polybromierte ng/g TS Diphenylether (PBDE) in ng/g TS PCB_28 PCB_52 PCB_101 PCB_118 PCB_153 PCB_138 PCB_180 PCB_7 BDE-47 BDE-99 BDE-100 Summe PBDE_3 Verhältnis BDE47/BDE99 PN F, PS 3 Tier 16 Freiland) Döbel 1,1 2,1 7,7 3,6 20,1 13,5 9,9 58,1 14,3 3,1 0,9 0,6 4,7 3,41 PN F, PS 3 Tier 17 Freiland) Döbel 2,1 3,9 20,9 8,8 60,7 41,3 21,9 159,6 22,5 6,7 1,3 1,9 9,9 5,23 PN F, PS 3 Tier 20 Freiland) Döbel 1,1 2,0 8,4 5,2 27,5 19,3 14,1 77,7 12,0 4,2 1,4 1,1 6,7 2,97 PN F, PS 3 Tier 21 Freiland) Döbel 1,5 2,2 9,5 4,9 29,1 21,9 13,8 83,0 14,4 4,6 1,0 0,8 6,4 4,64 PN F, PS 3 Tier 22 Freiland) Döbel 1,7 1,9 7,1 4,0 24,8 17,8 11,7 69,0 18,8 3,8 1,0 0,8 5,5 3,93 PN F, PS 3 Tier 23 Freiland) Döbel 2,9 4,1 11,7 6,7 28,8 21,3 11,1 86,7 27,9 4,2 1,3 1,3 6,8 3,26 PN F, PS 3 Tier 24 Freiland) Döbel 0,9 1,4 8,7 5,1 45,7 33,1 30,2 125,1 13,6 7,4 1,2 1,0 9,6 6,32 Daten zu PCB 7, Methyltriclosan und PBDE für in den Bypässen exponierte Forellen [µg/kg], (PN 1/4) PN-Stelle Art TS n % Fett % Fett % Polychlorierte Biphenyle (PCB) in ng/g Trockensubstanz Methyltriclosan in Polybromierte ng/g TS Diphenylether (PBDE) in ng/g TS Bezug TG Bezug FG PCB_28 PCB_52 PCB_101 PCB_118 PCB_153 PCB_138 PCB_180 PCB_7 BDE-47 BDE-99 BDE-100 Summe PBDE_3 Verhältnis BDE47/BDE99 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,4 20,3 5,1 1,7 1,9 4,0 2,2 5,7 3,6 2,0 21,1 9,6 1,3 0,6 0,2 2,1 2,37 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,5 22,9 5,8 1,9 1,7 4,8 2,0 6,7 4,4 2,3 23,8 10,1 1,5 0,7 0,3 2,6 2,21 PN 1 Gunzenhaus Forelle 28,0 19,6 5,5 1,5 2,2 4,0 2,1 5,3 3,5 1,9 20,4 10,4 1,6 0,6 0,2 2,4 2,62 PN 1 Gunzenhaus Forelle 27,2 28,4 7,7 1,3 2,1 3,4 2,5 6,6 4,4 2,5 22,7 12,1 1,4 0,4 0,2 2,0 3,54 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,5 20,3 5,2 1,1 1,7 2,9 2,4 6,7 4,4 2,1 21,4 10,8 1,4 0,5 0,2 2,0 2,99 PN 1 Gunzenhaus Forelle 28,4 15,6 4,4 1,4 1,7 3,4 1,7 5,5 3,6 1,7 19,1 8,3 2,2 0,5 0,3 3,0 4,20 PN 1 Gunzenhaus Forelle 24,1 18,9 4,6 1,5 1,7 3,7 2,2 6,1 4,7 2,1 22,1 9,6 1,8 0,4 0,2 2,5 4,17 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,4 22,7 5,8 1,2 1,7 3,1 2,0 5,2 3,8 2,0 19,1 8,8 1,4 0,6 0,2 2,1 2,52 PN 1 Gunzenhaus Forelle 17,8 11,0 2,0 2,3 2,6 4,6 2,4 6,8 5,1 3,1 26,7 10,8 1,4 0,7 0,3 2,3 2,08 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,2 23,0 5,8 2,8 6,2 7,1 4,5 8,9 2,8 4,1 36,3 11,3 1,1 0,6 0,2 1,9 1,91 PN1 Pflegelberg Forelle 26,1 26,7 7,0 2,3 2,8 9,9 5,2 11,5 6,8 4,1 42,7 2,4 1,1 0,4 0,1 1,6 2,38 PN1 Pflegelberg Forelle 22,8 25,3 5,8 3,4 2,8 10,8 6,4 9,1 5,3 3,7 41,5 4,9 1,0 0,5 0,3 1,9 2,21 PN1 Pflegelberg Forelle 26,7 25,6 6,8 1,4 1,5 2,7 2,1 7,7 6,3 2,9 24,6 4,1 1,4 0,6 0,3 2,3 2,46 PN1 Pflegelberg Forelle 23,0 15,9 3,6 3,4 8,1 20,6 8,0 5,5 2,8 2,6 51,0 3,5 1,1 0,9 0,4 2,5 1,28 PN1 Pflegelberg Forelle 21,7 13,2 2,9 2,7 7,7 8,6 2,0 5,2 2,8 1,2 30,2 3,5 1,3 0,4 0,4 2,1 3,24 PN 1 Gunzenhaus Forelle 24,0 20,8 5,0 2,6 3,2 6,2 4,0 13,9 9,6 3,4 42,8 8,9 0,8 1,3 0,3 2,4 0,62 PN 1 Gunzenhaus Forelle 25,9 23,3 6,0 2,8 3,3 4,6 3,0 11,5 8,1 3,5 36,7 8,5 0,8 1,2 0,3 2,4 0,69 PN 1 Gunzenhaus Forelle 23,5 17,3 4,1 1,8 3,1 5,6 2,9 12,3 9,6 5,0 40,4 6,0 0,7 0,7 0,2 1,6 0,95 PN 4 neg. Labor Forelle 23,8 18,0 4,3 4,4 8,5 5,5 3,2 7,3 6,5 6,0 41,5 1,4 1,4 1,5 0,2 3,2 0,95 PN 4 neg. Labor Forelle 22,7 11,6 2,6 1,9 7,5 5,7 2,8 8,7 6,3 5,4 38,3 2,5 1,7 1,6 0,3 3,5 1,03 PN 4 neg. Labor Forelle 23,0 17,2 4,0 4,7 9,8 7,6 5,3 9,4 5,5 4,0 46,3 2,8 1,4 1,5 0,3 3,2 0,93 PN 4 pos. Labor Forelle 22,3 14,8 3,3 3,8 10,1 9,6 3,3 9,1 3,6 2,9 42,5 3,0 2,5 1,6 0,3 4,3 1,58 PN 4 pos. Labor Forelle 22,1 9,6 2,1 3,7 10,5 10,0 3,0 5,1 3,3 2,7 38,1 1,6 3,0 2,6 0,3 5,8 1,13 PN 4 pos. Labor Forelle 23,0 14,2 3,3 3,4 9,2 6,5 2,7 8,9 3,8 2,2 36,8 3,1 2,2 2,0 0,4 4,5 1,12 45

46 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Diskussion In den untersuchten Probenmatrices wurden für Fischproben typische Kongenerenverteilungen der PCB 6 (Summe Indikator-PCB) mit den dominierenden Kongeneren PCB- 153 und PCB-138 gefunden. Höhere Konzentrationen der PCB 6 in den Innereien und der Haut sind u.a. auf den höheren Fettgehalt zurückzuführen. Im Folgenden werden aus Gründen der Vergleichbarkeit nur die Konzentrationen in den Filetproben auf das Frischgewicht bezogen betrachtet. Die PCB-Konzentrationen in den Filets von Schneider und Döbel sind mit 29,2 bzw. 32,7 ng/g FW sehr ähnlich, bei der untersuchten Barbe sind die Konzentrationen mehr als dreifach höher. Zum Vergleich liegen Werte aus dem Fischmonitoring 2010 vor (Ergebnisse Fischmonitoring, CVUA [Chemisches und Veterinär- Untersuchungsamt] Freiburg, S.8/27); die Konzentrationen liegen hier im Mittel bei ca. 15 bis 20 ng/g FW mit Maximalwerten von bis zu ca. 80 ng/g FW. Aus eigenen unveröffentlichten Untersuchungen, die derzeit an kleinen Oberflächengewässern im Raum Tübingen vorgenommen werden, liegen Werte zu Forellen, Döbel usw. vor (N > 100); bei Forellenfilets wurden im Mittel ca. 20 ng/g FW in höher belasteten Bereichen gefunden, in Oberläufen und unbelasteten Bächen lagen die PCB 6 -Konzentrationen in der Größenordnung von 5 10 ng/g FW. Ein Einfluss der einleitenden Kläranlagen ist bei den PCB nicht festzustellen. Des Weiteren liegen Werte zur Untersuchung von Brachsen aus dem Bodensee (N >100) vor; die Mediankonzentrationen der PCB lagen hier bei 22,2 ng/g FW (siehe Abschlussbericht FLABO, Flammschutzmittel in Bodenseeorganismen). Die PCB-Gehalte in der untersuchten Barbe sind im Vergleich als hoch einzuschätzen; zu berücksichtigen ist allerdings, dass Einzelexemplare untersucht und zudem verschiedene Fischarten verglichen werden. Die ermittelten Konzentrationen liegen noch unterhalb des von der EU für Süßwasserfische vorgeschlagenen Höchstgehaltes von 125 ng/g FW. Die Kongenermuster ( Prints ) sprechen für eine ubiquitäre Belastungsart. Bei den Forellen aus den Bypass-Systemen und den Laborkontrollen ist auffällig, dass bei vielen Fischen, v.a. den jeweils drei gemessenen Tieren aus den beiden Laborkontrollen die niederchlorieren Kongenere prozentual stark vertreten sind. Als Ursache könnte möglicherweise eine kurzfristige Anreicherung der eher wasserlöslichen niederchlorierten PCB oder ein kurzfristiger Eintrag derselben in Frage kommen. Hierzu müssen noch weitere Studien durchgeführt werden. Bei den polybromierten Diphenylethern wurden lediglich die Kongenere PBDE-47, -99 und 100 untersucht. Diese drei Kongenere stellen üblicherweise mehr als 90 % der PBDE in Fischen (das dekabromierte BDE-209 wird bei dieser Betrachtung nicht berücksichtigt). In der Umwelt (Sedimente, aber auch Klärschlämme usw.) weisen die Kongenerenverteilungen eine große Übereinstimmung mit einer technischen Flammschutzmittel-Mischung (Penta- BDE) auf. Diese besteht aus ca. 41 % BDE-99, ca. 40 % BDE-47 und ca. 7 % BDE-100. In 46

47 Chemische Analytik (Persistente Verbindungen) Fischen findet entweder durch kongenerenspezifische Aufnahme oder durch kongenerenspezifischen Abbau oft eine Verschiebung der Kongenerenverhältnisse statt. Im Allgemeinen erfolgt eine Verschiebung zu BDE-47; dieses dominiert die Gesamt-BDE zu bis zu 90 %. Bei manchen Fischarten wird BDE-99 entweder nicht akkumuliert oder isomerenspezifisch abgebaut. Interessant ist, dass bei den Expositionsproben Unterschiede bei den Verteilungen auftreten: so zeigen die Proben Gunzenhausen G3 und Labor negativ ein Verhältnis BDE47 zu BDE99 auf, bei dem 99 stärker vertreten ist. Dies könnte möglicherweise so interpretiert werden, dass die Fische eher mit einer direkten Quelle konfrontiert sind als die anderen; dies sollte aber noch genauer untersucht werden. Die Konzentrationen in Brachsen aus dem Bodensee lagen im Median bei ca. 2 ng/g FW (Median Fischmonitoring CVUA 0,9 ng/g FW), die Schussen-Fische weisen damit etwas höhere Konzentrationen der Verbindungen auf. Das Verhältnis der PCB zu den PBDE liegt in Größenordnungen, die auch bei Bodenseefischen beobachtet wurden. Beim CVUA-Fischmonitoring 2010 lagen die Gehalte an Gesamt-DDT (= Summe DDX) in der Größenordnung von ca. 5 bis 10 ng/g FW. Die Konzentrationen in Schneider und Döbel aus Schussen liegen mit < 10 ng/g FW im mittleren Bereich des Fischmonitorings, die untersuchte Barbe erreicht die Spitzenwerte des Monitorings. Die DDX-Gehalte hängen zusätzlich zu der diffusen Hintergrundbelastung letztlich von der landwirtschaftlichen Prägung und der ehemaligen gezielten Anwendung von DDT ab. Die Konzentrationen des Desinfektionsmittels Triclosan in Kläranlagenabläufen liegen in der Größenordnung von 10 bis zu 100 ng/l. Bei den oben genannten Untersuchungen im Raum Tübingen zeigte sich der eindeutige Einfluss der Abwassereinleitung. Die Gehalte in den Fischen aus der Schussen liegen deutlich über den Werten des CVUA-Fischmonitorings, allerdings ist hier auch der für verschiedene Gewässer unterschiedliche Verdünnungsfaktor des gereinigten Abwassers durch das Oberflächenwasser zu berücksichtigen. Bearbeitung des Teilprojektes: Dr. Bertram Kuch, Institut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und Abfallwirtschaft der Universität Stuttgart, Bandtäle 2, Stuttgart; ; bertram.kuch@iswa.uni-stuttgart.de 47

48 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Chemische Analytik: Zusammenfassung (Triebskorn) Vom TZW Karlsruhe wurden insgesamt 75 Parameter im Wasser, 128 Parameter im Sediment sowie 80 Parameter in Fischproben bestimmt (s. Anhang). Vom ISWA Stuttgart wurden in Fischen zwei zusätzliche persistente Verbindungen (PCB180 und Methyltriclosan) untersucht. Nachgewiesen wurden in wässrigen Proben insgesamt 29 Substanzen (Oberflächenwasser max. 21 zu einem Zeitpunkt, KA-Ablauf max. 29 zu einem Zeitpunkt), im Sediment 4 Stoffe sowie in Fischen vom TZW 13 und vom ISWA zusätzlich 9 Verbindungen. Abb : Anzahl untersuchter und maximal nachgewiesener Substanzen Folgende Chemikalien wurden untersucht: Oberflächenwasser und KA-Ablauf: Aliphatische Amine: Diethylamin, Dimethylamin, Ethanolamin, Ethylamin, Methylamin Alkylphenole/Bisphenole: Bisphenol A, 4-iso-Nonylphenol, iso-nonylphenoldiethoxylat, 4- tert.-oktylphenol, Tetrabrombisphenol A Aromatische Sulfonate: Naphthalin-2-sulfonat Halogenierte Kohlenwasserstoffe: Bromdichlormethan Komplexbildner: DTPA (Diethylentriaminpentaacetat), EDTA (Ethylendinitrilotetraacetat) Metalle: Cadmium, Kupfer, Nickel, Quecksilber, Zink 48

49 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Pharmazeutika und Metabolite: Carbamazepin, Chloramphenicol, Clarithromycin, Dehydrato-Erythromycin A, Diclofenac, Naproxen, Salicylsäure, Sulfamethoxazol, N-Acetyl- 4-aminoantipyrin, N-Formyl-4-aminoantipyrin, Coffein Pflanzenschutzmittel und Metabolite: Atrazin, Carbendazim, Diuron, 2,4-DP (Dichlorprop), Fenitrothion, Isoproturon, Malathion, MCPA, MCPP (Mecoprop), Pirimicarb, Propiconazol, Simazin, Terbutryn, Tolylfluanid, N,N-Dimethylsulfamid Polybromierte Diphenylether BDE-28, BDE-47, BDE-66, BDE-85, BDE-99, BDE-100, BDE-138, BDE-153, BDE-154, BDE-183, BDE-209 Steroidhormone/Phytohormone: 17α-Ethinylestradiol, 17β-Estradiol, Estron, β-sitosterol Süßstoffe: Acesulfam, Cyclamat, Saccharin, Sucralose Trialkylphosphate: 2-Ethylhexyldiphenylphosphat,Triethylphosphat, Trikresylphosphat (o-, m- u. p-isomer), Tri-n-butylphosphat, Triphenylphosphat, Tris(2-chlorethyl)phosphat, Tris(2- chlorpropyl)phosphat, Tris(2-ethylhexyl)phosphat Triazole: Benzotriazol, 4-Methylbenzotriazol, 5-Methylbenzotriazol Sedimentproben: Polybromierte Diphenylether: BDE-28, BDE-47, BDE-66, BDE-85, BDE-99, BDE-100, BDE-138, BDE-153, BDE-154, BDE-183, BDE-209 Trialkylphosphate: 2-Ethylhexyldiphenylphosphat, Triethylphosphat, Trikresylphosphat (o-, m- u. p-isomer), Tri-n-butylphosphat, Triphenylphosphat, Tris(2-chlorethyl)phosphat, Tris(2- chlorpropyl)phosphat, Tris(2-ethylhexyl)phosphat Metalle: Arsen, Cadmium, Kupfer, Nickel, Quecksilber, Zink PAH: Anthracen, Benz(a)anthracen, Benzo(b)fluoranthen, Benzo(k)fluoranthen, Benzo(a)pyren, Benzo(g,h,i)perylen, Chrysen, Dibenz(a,h)anthracen, Fluoranthen, Indeno(1,2,3-cd)pyren, Pyren Pharmazeutika: Amoxicillin, Bezafibrat, Carbamazepin, Chloramphenicol, Chlortetracyclin, Ciprofloxacin, Clarithromycin, Clofibrinsäure, Cloxacillin, Dapson, Dehydrato-Erythromycin A, Diazepam, Diclofenac, Dicloxacillin, Doxycyclin, Enoxacin, Enrofloxacin, Erythromycin A, Etofibrat, Fenofibrat, Fenofibrinsäure, Fenoprofen, Furazolidon, Gemfibrozil, Ibuprofen, Indomethacin, Ketoprofen, Meclocyclin, Metronidazol, Nafcillin, Naproxen, Norfloxacin, Ofloxacin, Oleandomycin, Oxacillin, Oxytetracyclin, Paracetamol, Penicillin G, Penicillin V, Pentoxifylline, Phenacetin, Ronidazol, Roxythromycin, Salicylsäure, Spiramycin, Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfamerazin, Sulfamethoxazol, Tetracyclin, Trimethoprim, Tylosin, Venlafaxin,Virginiamycin PCB: PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 118, PCB 138, PCB 153, (PCB180) Pflanzenschutzmittel: Aldrin, α-endosulfan, β-endosulfan, Dieldrin, Endrin, γ-hch, Isodrin, o,p-ddt, p,p-ddd, p,p-dde, p,p-ddt, Heptachlor, cis-heptachlorepoxid, trans- Heptachlorepoxid 49

50 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Steroidhormone/Phytohormone: β-sitosterol, 17α-Ethinylestradiol, 17β-Estradiol, Estriol, Estron, Mestranol, Norethisteron Alkylphenole/Bisphenole: Bisphenol A, 4-tert-Nonylphenol, 4-tert-Octylphenol, iso- Nonylphenolmonoethoxylat, iso-nonylphenoldiethoxylat, Tetrabrombisphenol A Halogenierte Kohlenwasserstoffe: HCB, Pentachlorbenzol Döbel und Schneider aus dem Freiland: Alkylphenole/Bisphenole: Bisphenol A, 4-iso-Nonylphenol, 4-tert-Octylphenol, iso- Nonylphenolmonoethoxylat, iso-nonylphenoldiethoxylat, Tetrabrombisphenol A Polybromierte Diphenylether: BDE-28, BDE-47, BDE-66, BDE-85, BDE-99, BDE-100, BDE-138, BDE-153, BDE-154, BDE-183, BDE-209 Trialkylphosphate: 2-Ethylhexyldiphenylphosphat,Triethylphosphat, Trikresylphosphat (o-, m- u. p-isomer), Tri-n-butylphosphat, Triphenylphosphat, Tris(2-chlorethyl)phosphat, Tris(2- chlorpropyl)phosphat, Tris(2-ethylhexyl)phosphat Halogenierte Kohlenwasserstoffe: HCB, Pentachlorbenzol Metalle: Arsen, Cadmium, Kupfer, Nickel, Quecksilber, Zink, PCB: PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 118, PCB 138, PCB 153, (PCB180) Pharmazeutika: Bezafibrat, Carbamazepin, Clofibrinsäure, Diazepam, Diclofenac, Etofibrat, Fenofibrat, Fenofibrinsäure, Fenoprofen, Gemfibrozil, Ibuprofen, Indomethacin, Ketoprofen, Naproxen, Paracetamol, Pentoxifylline, Phenacetin, Salicylsäure Pflanzenschutzmittel: Aldrin, alpha-endosulfan, beta-endosulfan, Dieldrin, Endrin, gamma- HCH, Isodrin, o,p-ddt, p,p-ddd, p,p-dde, p,p-ddt, Heptachlor, cis-heptachlorepoxid, trans-heptachlorepoxid Steroidhormone/Phytohormone: β-sitosterol, 17α-Ethinylestradiol, 17β-Estradiol, Estriol, Estron, Mestranol, Norethisteron Sonstige: Methyltriclosan Forellen, die in den Bypässen exponiert waren, wurden kostenneutral vom ISWA auf 7 PCB und Methyltriclosan untersucht. In Gammariden aus dem Freiland wurde ebenfalls kostenneutral vom TZW nach 6 Metallen sowie nach 11 PBDE gesucht. Folgende Spurenstoffe wurden nachgewiesen (>NWG): Oberflächenwasser: Acesulfam, N-Acetyl-4-aminoantipyrin, Benzotriazol, beta-sitosterol, Carbamazepin, Carbendazim, Coffein, Cyclamat, Diclofenac, Diethylamin, Dehydrato-Erythromycin A, 50

51 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Dimethylamin, N,N-Dimethylsulfamid, EDTA (Ethylendinitrilotetraacetat), Ethanolamin, N- Formyl-4-aminoantipyrin, 4-Methylbenzotriazol, 5-Methylbenzotriazol, Naphthalin-2-sulfonat, Nickel, Saccharin, Sucralose, Sulfamethoxazol, Tri-n-butylphosphat, Tris(2- chlorpropyl)phosphat Kläranlagenablauf Acesulfam, N-Acetyl-4-aminoantipyrin, Benzotriazol, β-sitosterol, Bisphenol A, Carbamazepin, Carbendazim, Clarithromycin, Cyclamat, Dehydrato-Erythromycin A, Diclofenac, Dimethylamin, N,N-Dimethylsulfamid, DTPA (Diethylentriaminpentaacetat), 2,4- DP (Dichlorprop), EDTA (Ethylendinitrilotetraacetat), N-Formyl-4-aminoantipyrin, MCPA, MCPP (Mecoprop), Methylamin, 4-Methylbenzotriazol, 5-Methylbenzotriazol, Naphthalin-2- sulfonat, Naproxen, Nickel, 4-tert.-Oktylphenol, Saccharin, Sucralose, Sulfamethoxazol, Terbutryn, Triethylphosphat, Tri-n-butylphosphat, Triphenylphosphat, Tris(2- chlorethyl)phosphat, Tris(2-chlorpropyl)phosphat Sediment β-sitosterol, Fluoranthen, Nickel, Zink Fische Arsen, β-sitosterol, Cadmium, BDE 28, BDE47, BDE100, BDE154, BDE209, pp-dde, Kupfer, Nickel, PCB138, PCB153, Quecksilber, 4-tert-Octylphenol, Zink Die nachfolgenden Abbildungen fassen die Resultate der chemischen Analytik und hierbei u.a. die Maximalwerte für ausgewählte Substanzen vor dem Hintergrund zentraler Fragen des Projektes an die chemische Analytik zusammen. 1. Wie viele Chemikalien wurden im Ablauf der KA Langwiese im Vergleich zum Oberflächenwasser in der Schussen oberhalb (P00) und unterhalb des KA (P3) bzw. in der Argen (P4) nachgewiesen? Mehr als zwei Drittel der Chemikalien, die im Kläranlagenablauf gefunden wurden, traten auch im Oberflächenwasser unterhalb der Kläranlage auf. Die Probestelle P00 oberhalb der Kläranlage Langwiese kann nicht als unbelastete Kontrollstelle angesehen werden, weil hier fast so viele Chemikalien nachgewiesen werden konnten wie unterhalb der Kläranlage. Grund hierfür ist mit großer Wahrscheinlichkeit der Eintrag über Kläranlagen oberhalb dieser Probestelle. Nach der ersten Beprobung im Mai 2010 wurde aus diesem Grunde die Probestelle P4 an der Argen als Kontrollstelle weitergeführt, weil hier deutlich weniger Chemikalien gefunden wurden als an P3. 51

52 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Abb : Anzahl nachgewiesener Substanzen 2. Wie unterscheiden sich die Konzentrationen nachgewiesener Chemikalien im Oberflächenwasser der Schussen oberhalb (P00) und unterhalb (P3) des Kläranlagenablaufs? In welchen Konzentrationen treten Spurenstoffe im KA-Ablauf, in der Schussen unterhalb der KA (P3) und in der Argen als Kontrollgewässer auf? Abb : Konzentrationen ausgewählter Substanzen oberhalb und unterhalb der KA Langwiese 52

53 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Abb : Konzentrationen ausgewählter Substanzen im KA-Ablauf, unterhalb der KA und in der Argen Für eine Reihe an Verbindungen (DMS, Benzotriazol, Carbamazepin, Sucralose) liegen die Werte im Oberflächenwasser unterhalb der KA Langwiese sehr viel höher als oberhalb, so dass von einem deutlichen Eintrag über die KA Langwiese auszugehen ist. Andere Chemikalien, wie z.b. Ethanolamin, Coffein oder Diclofenac liegen in ähnlicher Größenordnung oberhalb und unterhalb der KA vor, oder die Werte sind oberhalb sogar höher als unterhalb der KA, was dafür spricht, dass diese Stoffe auch über Kläranlagen oberhalb der KA Langwiese in vergleichbaren Mengen eingetragen werden. Die Konzentrationen der Spurenstoffe im Oberflächenwasser der Schussen liegen in der gleichen Größenordnung, wie sie in den letzten Jahren in zahlreichen durch Einträge aus Kläranlagen belasteten Gewässern nachgewiesen wurden (Brauch, 2011; Triebskorn & Hetzenauer, 2012). Die Messwerte für Diclofenac und Carbamazepin entsprechen in etwa den mit dem Stoffflussmodell der EAWAG ermittelten Werten für diese beiden Arzneimittel im Verlauf der Schussen (Hetzenauer, pers. Mitt.). Fast alle nachgewiesenen Chemikalien kamen in der Schussen unterhalb der KA Langwiese in deutlich höheren Konzentrationen vor als in der Argen (P4). Die Konzentrationen liegen im 53

54 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Oberflächenwasser der Schussen ungefähr um den Faktor 3-10 niedriger als die Werte im KA-Ablauf, was dem Verdünnungsverhältnis des gereinigten Abwassers durch das Oberflächenwasser der Schussen entspricht. Das Phytoöstrogen β-sitosterol, ein Phytosterin, das in der pflanzlichen Zellwand vorkommt, wurde in der Schussen, aber vor allem auch in der Argen im Oberflächenwasser, Sediment und in Fischen nachgewiesen. Im Oberflächenwasser der Argen übersteigt die Konzentration mit 1200 ng/l sogar die Werte, die im KA-Ablauf Langwiese gemessen wurden. Die Konzentration der Substanz im Oberflächenwasser der Schussen ist niedriger und entspricht derjenigen, die der Körsch bei Stuttgart gemessen wurde (Körner et al., 2001). In der Vergangenheit traten im Oberflächenwasser der Schussen allerdings wesentlich höhere Werte (bis zu 1760 ng/l) auf (Triebskorn & Hetzenauer, 2012). Wirkungen von -Sitosterol in Schnecken wurden von Czech et al. (2001) ab einer Konzentration von 0,1 µg/l gefunden, so dass die in Schussen und Argen gemessenen Konzentrationen als für mögliche Wirkungen relevant betrachtet werden müssen. Als mögliche Quellen für den Eintrag von -Sitosterol kommen Gülleeintrag, Viehhaltung auf Grünland, sowie Einträge aus dem Hopfenanbau oder der Verarbeitung von Hopfen (Brauereien) in Frage. Zudem kann ein Eintrag dieser Substanz auch über Papierindustrie erfolgen. So kann die Schließung einer Papierfabrik an der Schussen im letzten Jahr ggf. für die niedrigeren aktuellen Werte in der Schussen verantwortlich sein. β-sitosterol wird auch in zahlreichen Anti-Aging-Produkten eingesetzt und kommt zur Behandlung von Prostatahyperplasien und als Cholesterol-senkendes Arzneimittel zum Einsatz. Die maximal gemessene Konzentration von DMS (240 ng/l), einem Metaboliten des Fungizids Tolylfluanid, ist nach Brauch (2011) als hoch einzuordnen, da der im Oberflächenwasser gemessene Median bei 67 ng/l liegt. Der Metabolit ist problematisch, da er persistent ist und eine hohe Mobilität im Boden und Grundwasser zeigt. Durch Ozonung kann zudem aus DMS das cancerogene NDMA (n-nitrosodimethylamin) entstehen, für das im Trinkwasser ein gesundheitlicher Orientierungswert von 10 ng/l gilt. Die Konzentrationen der Arzneimittel Carbamazepin und Diclofenac liegen über dem im DMR-Memorandum der Wasserwerke an Donau, Maas und Rhein und vom DVGW formulierten Zielwert von 0,1 µg/l für Oberflächenwasser (Brauch, 2011). Der Wert für Diclofenac liegt zudem über dem im Vorschlag zur Änderung der WRRL genannten UQN- Wert von 0,1 µg/l (COM (2011)876 final). Die Messwerte für Sulfamethoxazol und Erythromycin sind im Vergleich zu den von Brauch (2011) gezeigten Werten als eher niedrig einzustufen. Das Fungizid Carbendazim, für das erbgutschädigende Eigenschaften nachgewiesen wurden, und das sehr toxisch für aquatische Organismen ist, liegt mit einer mittleren 54

55 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Konzentration von 0,01 µg/l in der Schussen im Sicherheitsbereich des Risk Assessments (NOEC Daphnia 1,5 µg/l; 3 Trophiestufen; SF 10; PNEC 0,15 µg/l). Die Konzentration von Benzotriazol, das in Korrosionsschutzmitteln, Bremsflüssigkeiten, Enteisungsmitteln für Flugzeuge sowie in Detergenzien (z.b. Geschirrspülmittel) zum Einsatz kommt, liegt im Oberflächenwasser der Schussen mit 380 ng/l im mittleren Bereich vorhandener Messwerte für z.b. Rhein, Main, Schweizer Gewässer oder für den englischen Fluss Erewash, die von Janna et al. (2011) diskutiert werden. Der Maximalwert im Kläranlagenablauf Langwiese (3600 ng/l) entspricht fast genau dem von Janna et al. (2011) in acht Kläranlagen gemessenen Maximalwert von 3605 ng/l. Da sich sowohl die akute als auch die chronische Toxizität von Benzotriazol für wasserlebende Organismen im unteren mg/l- bzw. oberen µg/l-bereich bewegt (Seeland et al., 2012), ist das mit dieser Substanz verbundene Risiko aktuell als eher niedrig einzuschätzen. Octylphenol, für das eine östrogene Wirksamkeit bekannt ist, wurde zwar im Kläranlagenablauf, nicht aber in den Oberflächenwasserproben nachgewiesen. In der Vergangenheit wurden in der Schussen maximal 0,098 µg/l Octylphenol gemessen (Triebskorn & Hetzenauer, 2012), was vor dem Hintergrund des im DMR-Memorandum und vom DVGW formulierten Zielwerts von 0,1 µg/l für endokrin wirksame Substanzen (Brauch, 2011) von Bedeutung ist. Von den nachgewiesenen Süßstoffen entsprechen die Abwasserkonzentrationen von Acesulfam, Saccharin und Sucralose den aus der Literatur bekannten Werten. Im Oberflächenwasser der Schussen liegen die Werte für diese Süßstoffe allerdings im Maximalbereich der von Scheurer et al. (2009) beschriebenen Konzentrationen. Obgleich von den Süßstoffen nicht unbedingt toxische Wirkungen zu vermuten sind, können osmotische Effekte sowie Interaktionen mit anderen Chemikalien nicht ausgeschlossen werden. 3. Welche Stoffe wurden in welchen Konzentrationen im Sediment nachgewiesen? Abb : Konzentrationen ausgewählter Substanzen im Sediment uh der KA und in der Argen 55

56 Chemische Analytik (Zusammenfassung) In den Sedimentproben wurden nur sehr wenige Chemikalien nachgewiesen. Die Werte liegen für Schussen und Argen in der gleichen Größenordnung. Das Sediment der Schussen ist, wohl bedingt durch die dichtere Besiedlung des Schusseneinzugsgebiets und der Herkunft des Metalls (Rohrleitungen, Regenrinnen) stärker mit Zink belastet. Dass insfgesamt nur wenige Stoffe gefunden wurden, kann einerseits an der Struktur des Sediments, aber auch an den relativ hohen Nachweisgrenzen für viele organische Spurenstoffe liegen. 4. Welche Metalle treten in Fischen und Gammariden auf? Abb : Konzentrationen von Metallen in Fischen und Flohkrebsen aus Schussen und Argen 56

57 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Cadmium-, Kupfer- und Quecksilberwerte in den Döbeln aus der Schussen unterhalb der KA Langwiese liegen deutlich höher als oberhalb der KA. Allerdings wurden Cadmium und Quecksilber in noch höheren Konzentrationen in Döbeln aus der Argen nachgewiesen. Mit max. 750 µg/kg TS (Döbel Schussen) bzw. 910 µg/kg TS (Döbel Argen) liegen die Werte für Quecksilber in Fischen an schussen und Argen deutlich über dem für Hg vorgeschlagenen UQN Biota der WRRL von 20 µg/kg. Für eine vorliegende Metallbelastung in der Argen spricht zudem das Vorkommen von Arsen in Schneidern. Sowohl oberhalb als auch unterhalb der KA Langwiese zeigten die Proben aus Döbeln sehr hohe Zinkwerte. Sowohl Kupfer- als auch Zinkkonzentrationen sind als extrem hoch einzustufen und liegen um den Faktor 4-10 höher als Werte, die in Döbeln aus der Mureş in Rumänien (wenig dicht besiedeltes Gebiet) auch unterhalb von Kläranlagen gemessen wurden (Triebskorn et al. 2008). Bachforellen, die in der Körsch bei Stuttgart exponiert waren, akkumulierten nur ein Drittel an Cadmium und Zink. Die Kupferwerte in Döbeln aus der Schussen sind mehr als 30x höher als entsprechende Werte aus Forellen aus der Körsch (Honnen et al., 2001). Bei Gammariden liegen die Werte für Kupfer, Zink und Arsen niedriger als in den Fischen, und es gibt keine Unterschiede zwischen der Probenahmestelle oberhalb und unterhalb der KA Langwiese sowie der Argenmündung (P5). 5. Wie unterscheiden sich die Schadstoff-Konzentrationen in verschiedenen Organen in Bezug auf Frisch- und Trockengewicht? Abb : Konzentrationen von PCB und PBDE in Geweben eines Döbels aus der Schussen bezogen auf Trocken- und Frischgewicht 57

58 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Abb : Konzentrationen von DDX und Methyltriclosan in Geweben eines Döbels aus der Schussen bezogen auf Trocken- und Frischgewicht Alle im Projekt erhobenen Daten zu Spurenstoffgehalten in Fischen sind auf Trockengewicht bezogen. Untersucht wurden von Döbeln primär Leberproben und Filet, in einigen Fällen auch Gonade, Darm und Gallenflüssigkeit, bei deren Entnahme die Gallenblase punktiert wurde. Von Schneidern wurde jeweils ein Pool aus 3-4 Fischen in toto analysiert. Aus den beiden Abbildungen ist ersichtlich, dass persistente Stoffe am stärksten in Eingeweiden akkumulieren. Die meisten Vergleichswerte in der Literatur liegen allerdings zu Werten in Filet/Muskel vor (Relevanz als Nahrungsmittel). In den folgenden Abschnitten werden die maximalen, in Fischproben einer Probestelle nachgewiesenen Spurenstoffgehalte zusammengestellt, unabhängig vom untersuchten Organ. Die Zuordnung der Werte zu den einzelnen Organen ist anhand der Tabelle im Anhang möglich. Vergleichswerte in der Literatur sind meist bezogen auf Frischgewicht und nicht auf Trockengewicht. Die beiden Abbildungen machen deutlich, dass die Messwerte für persistente Stoffe bezogen auf das Trockengewicht ungefähr um den Faktor 3-4 höher liegen als diejenigen bezogen auf das Frischgewicht. Dies wird bei der folgenden Diskussion berücksichtigt. 6. Wie hoch sind die Konzentrationen an persistenten Verbindungen in Freilandfischen und Gammariden aus Schussen und Argen? Die Werte für zahlreiche persistente Verbindungen liegen in Fischen aus der Schussen deutlich höher als in Fischen aus der Argen. Barbe und Döbel akkumulieren deutlich mehr persistente Verbindungen als Schneider, was mit dem höherem Fettgehalt dieser Arten zusammenhängen kann 58

59 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Abb : Konzentrationen von persistenten Verbindungen in Fischen aus Schussen und Argen Abb : Konzentrationen von PBDE in Gammariden aus Schussen und Argen. Der PCB-Gehalt im Filet des untersuchten Döbels liegt im Bereich der Werte, die für Döbel aus verschiedenen tschechischen Gewässern bestimmt wurden (Havelkova et al., 2008). Geht man davon aus, dass die Werte bezogen auf Frischgewicht ungefähr um den Faktor 3-4 niedriger liegen als diejenigen bezogen auf Trockengewicht, liegen die Werte für Döbel und Barbe aus der Schussen zwar noch unterhalb, allerdings auch fürs Filet bereits im Bereich des von der EU formulierten Höchstwerts von 125 ng/g FG (EG 1881/2006). Werte für Fische aus relativ unbelasteten Gewässern bewegen sich laut Kuch (pers. Mitt.) im Bereich von 5-10 µg/kg FG. Die Messwerte für alle drei untersuchten Fischarten liegen hier deutlich höher, wobei das Filet der Barbe mit einer Konzentration von ca. 100 µg/kg FG am stärksten belastet ist. 59

60 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Polybromierte Diphenylether wurden ebenfalls in den höchsten Konzentrationen in Geweben der Barbe nachgewiesen. Allerdings liegen auch die Messwerte für Döbel und Schneider weit über der von der EU vorgesehenen (extrem niedrigen) UQN für Biota von 0,0085 ng/g FG (COM 2011/876). Die Messwerte für Döbel liegen im mittleren Bereich der von Hajslova et al. (2007) erhobenen Werte für Döbel aus der Elbe. Durchschnittswerte für eine Belastung von Fischen mit DDX liegen laut Kuch (pers. Mitt.)in der Größenordnung von ca. 5 bis 10 ng/g FW. Die Konzentrationen in Schneider und Döbel aus der Schussen sind demnach als moderat, diejenigen in der Barbe als eher hoch zu bewerten. Allerdings liegen alle Werte für Fische aus der Schussen weit unterhalb der Höchstwerte, die in Döbeln aus tschechischen Gewässern gemessen wurden (Havelkova et al., 2008). Die Messwerte für das Desinfektionsmittel Methyltriclosan liegen im Bereich der aus der Umweltprobenbank für Brassen aus deutschen Fließgewässern zu entnehmenden Werte ( 100&sampling_areas=&sampling_years=&specimen_types=10007). Sie sind deutlich geringer als die Maximalwerte, die von Leiker et al. (2009) für Karpfen ermittelt wurden (596 µg/kg FG). Triclosan, die Muttersubstanz von Methyltriclosan, verursacht sowohl toxische (Lebertumoren), gentoxische als auch endokrine Effekte (Brausch & Rand, 2011; Ciniglia, 2005) Die Messwerte für PBDE in Gammariden, die unterhalb der KA Langwiese entnommen wurden, liegen in der Größenordnung der Werte für Fische an dieser Probestelle. Die Belastung der Tiere an der Probestelle oberhalb der KA ist deutlich geringer und ähnelt der Situation an der Argen. 7. Welche Kongenere der PBDE dominieren bei Fischen und Gammariden? 60

61 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Abb : PBDE-Kongenere in Fischen und Gammariden aus Schussen und Argen Deutliche Unterschiede zwischen Fischen und Gammariden findet man in der Verteilung der akkumulierten PBDE-Kongenere: Während bei Fischen BDE-47 mehr als 90% der Gesamt- BDE ausmacht, dominiert bei Gammariden aus der Schussen die wesentlich hydrophobere Verbindung BDE 209. Ob dies mit Kongener-spezifischer Aufnahme bzw. Akkumulation bei den beiden Arten zusammenhängt, wäre zu untersuchen. Insgesamt spricht das Kongenermuster von PBDE (sog. Print ) in Fischen aus der Schussen für eine diffuse Hintergrundbelastung, wobei bei Forellen aus dem Bypas Gunzenhaus und dem Labor eine aktuelle Punktbelastung nicht auszuschließen ist. 8. Wie stark akkumulieren hormonell wirksame Substanzen in Freilandfischen? 9. Abb : Hormonell wirksame Chemikalien in Fischen aus Schussen und Argen Die meisten der untersuchten endokrin wirksamen Verbindungen konnten nicht in den Fischen nachgewiesen werden. In hohen Konzentrationen trat das Phytoöstrogen β- Sitosterol, in sehr geringen Konzentrationen Octylphenol in Fischen aus Schussen und Argen auf. Die hohen Messwerte für β-sitosterol in Fischen aus der Argen lassen sich in 61

62 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Zusammenhang mit dem hohen Gehalt dieser Verbindung im Oberflächenwasser bringen (s.o.). Da das östrogene Potential dieses Phytoöstrogens allerdings im Vergleich zu synthetischen oder natürlichen Hormonen um den Faktor 10 4 geringer ist (Kuch, pers. Mitt.; Körner et al., 2001), sind von dieser Substanz ausgehende hormonelle Potentiale in Schussen und Argen als eher gering einzuschätzen. 10. Wie stark akkumulieren Forellen im Bypass PCB und das Desinfektionsmittel Methyltriclosan? Abb : Persistente Verbindungen in Fischen aus den Bypässen an Schussen und Argen Die in die Bypässe eingesetzten Forellen akkumulieren keine wesentlichen Mengen an PCB während ihrer Expositionszeit. Die Werte unterscheiden sich nicht wesentlich von dem in den Laborkontrollen bereits vorhandenen Konzentrationen. Das Desinfektionsmittel Methyltriclosan hingegen wird in der Schussen deutlich (um den Faktor 4) angereichert. Forellen aus dem Bypass an der Argen akkumulieren weniger als halb so viel dieser Substanz. Allerdings sind die Werte insgesamt als gering einzuschätzen. 11. Welche nachgewiesenen Substanzen lassen toxische bzw. endokrine Wirkungen erwarten? Tab Potentielle Wirkungen von regelmäßig im KA-Ablauf, OFW, Sediment oder in Biota nachgewiesenen Substanzen TOXISCHE WIRKUNGEN Gewebeschäden Neurotoxizität Gentoxizität, Cancerogenität Osmotische Wirkung Mechanismus nicht spezifiziert Diclofenac, Carbamazepin Methyltriclosan, Mecoprop Quecksilber, Arsen, Cadmium Coffein, DDX Dimethylsulfamid (DMS), TCPP Methyltriclosan, Carbendazim Acesulfam, Sucralose Ethanolamin, Benzotriazol EDTA, DPTA HORMONELLE WIRKUNGEN östrogen androgen/ anti-östrogen Octylphenol, Bisphenol A Benzotriazol, PBDE, ß-Sitosterol, PCB Methyltriclosan, DDX 62

63 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Literatur Brauch, H.-J. (2011): Organische Spurenstoffe in Gewässern. Vorkommen und Bewertung. Gwf- Wasser/Abwasser, Brausch, J.M., Rand, G.M. (2011). A review of personal care products in the aquatic environment: environmental concentrations and toxicity.chemosphere 82(11): Ciniglia, C., Cascone,C., Giudice, R.L., Pinto, G., Pollio, A. (2005). Application of methods for assessing the geno- and cytotoxicity of Triclosan to C. ehrenbergii. J Hazard Mater. 122(3): COM (2011) 876 final. Vorschlag für eine Richtlinie des Europäischen Parlaments und des Rates zur Änderung der Richtlinien 2000/60/EG und 2008/105EG in Bezug auf prioritäre Stoffe im Bereich der Wasserpolitik Czech, P., Weber, K., Dietrich, D. R. (2001). Effects of endocrine modulating substances on reproduction in the hermaphroditic snail Lymnaea stagnalis L. Aquat. Toxicol. 53(2): EG 1881/2006. Verordnung (EG) Nr. 1881/2006 der Kommission vom 19. Dezember 2006 zur Festsetzung der Höchstgehalte für bestimmte Kontaminanten in Lebensmitteln Hajslová, J., Pulkrabová, J., Poustka, J., Cajka, T., Randák, T (2007). Epub 2007 Jul 27.Brominated flame retardants and related chlorinated persistent organic pollutants in fish from river Elbe and its main tributary Vltava. Chemosphere 69(8): Havelková, M., Randak, T., Blahova, J., Slatinska, I., Svobodová, Z. (2008). Biochemical markers for the assessment of aquatic environment contamination. Interdiscip Toxicol 1(2): Honnen, W., Rath, K., Schlegel, T., Schwinger, A., Frahne, D. (2001): Chemical analyses of water, sediment and biota in two small streams in Southwest Germany, J. Aquat. Ecosys. Recov. 8, Janna, H., Scrimshaw, M.D., Williams, R.J., Churchley, J., Sumpter, J.P. (2011). From Dishwasher to Tap? Xenobiotic Substances Benzotriazole and Tolyltriazole in the Environment. Env. Sci. Technol. 45: Körner, W., Bolz, U., Triebskorn, R., Schwaiger, J., Negele, R.-D., Marx, A., Hagenmaier, H. ( 2001). Steroid analysis and xenosteroid potentials in two small streams in Southwest Germany. J. Aquat. Ecosyst. Stress. Recov. 8 (3/4): Leiker, T.J., Abney, S.R., Goodbred, S.L., Rosen, M.R. (2009). Identification of methyltriclosan and halogenated analogues in male common carp (Cyprinus carpio) from Las Vegas Bay and semipermeable membrane devices from Las Vegas Wash, Nevada. Sci Total Environ. 407(6): Scheurer, M., Brauch, H.-J., Lange, F.T. (2009). Analysis and occurrence of seven sweeteners in German waste water and in soil aquifer treatment. Anal. Bioan. Chem. 394 (6): Seeland, A., Oetken, M., Kiss, A., Fries, E., Oehlmann, J. (2012). Acute and chronic toxicity of benzotriazoles to aquatic organisms. Environ. Sci. Pollut. Res. 19(5): Triebskorn, R., Sandu, C., Telcean, I., Casper, H., Farkas, A., Colarescu, O., Dori, T., Köhler, H.-R. (2008): Monitoring Pollution in River Mures, Romania, Part II: Metal accumulation and histopathology. Environ. Monit. Ass. 141, Triebskorn R, Hetzenauer H (2012): Micropollutants in three tributaries of Lake Constance, Argen, Schussen and Seefelder Aach: a literature review. (Mikroverunreinigungen in den drei Bodenseezufluessen Argen, Schussen und Seefelder Aach - eine Literaturstudie). Environmental Sciences Europe 24. online available at: 63

64 Chemische Analytik (Zusammenfassung) Kurzzusammenfassung: Chemische Analytik Anzahl der nachgewiesenen Stoffe oberhalb der KA Langwiese ähnlich der Anzahl unterhalb Viele Stoffe unterhalb der KA in deutlich höheren Konzentrationen als oberhalb (z.b. Carbamazepin, DMS, Benzotriazol, Sucralose), manche aber auch in vergleichbarer oder niedrigerer Konzentration (z.b. Diclofenac, Coffein, Ethanolamin) Im OFW unterhalb der KA ca. 2/3 der Substanzen nachzuweisen, die im KA-Ablauf auftreten: Konzentrationen im KA-Ablauf um den Faktor 3-10 höher als im OFW unterhalb der KA (entspricht in etwa der Verdünnung des gereinigten Abwassers durch das Schussenwasser) Konzentration von Diclofenac (140 ng/l) im OFW höher als vorgeschlagene UQN der WRRL Maximalkonzentration von DMS im OFW (240 ng/l) über Orientierungswert für Trinkwasser (10 ng/l). Problematik: Persistenz, mobil, Abbauprodukt cancerogen Konzentration von -Sitosterol im OFW von Schussen und Argen im Wirkbereich Mehr Substanzen, für die toxische Wirkungen zu erwarten sind, als potentiell endokrin wirkende Stoffe im OFW und KA-Ablauf Wenige Substanzen im Sediment und in Fischen nachzuweisen (methodisch bedingt hohe Nachweisgrenzen) Hohe Konzentrationen an Metallen und persistenten Verbindungen (PBDE, PCB, Methyltriclosan) in Fischen; Werte für PCB im Bereich, aber noch unter dem EU-Grenzwert, Werte für Flammschutzmittel und Quecksilber über vorgeschlagener UQN der WRRL Probestelle an der Argen nicht unbelastet; Bedeutung von Quecksilber, Arsen, Cadmium und β-sitosterol 64

65 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) 4.3. Endokrine Potentiale und Wirkungen Östrogene Gesamtaktivität: E-Screen Hintergrund und Zielsetzung Als eine der Haupteintragsquellen einer Vielzahl von organischen Mikroverunreinigungen in die aquatische Umwelt wurde die Einleitung konventionell gereinigter kommunaler Abwässer in Oberflächengewässer identifiziert. Die Bewertung einer Wasserprobe hinsichtlich (öko)- toxikologischer Aspekte alleine durch die Untersuchung mittels instrumenteller Analytik ist nur bedingt möglich, da u.u. viele Substanzen derzeit noch unbekannt sind und sehr niedrige Konzentrationen vorliegen können, die im Bereich der analytischen Grenzen liegen. Dahingegen können biologische Testsysteme Wirkungen erfassen, die von der Gesamtheit der in einer Probe enthaltenen Verbindungen verursacht werden. Als Beispiel ist der E- Screen-Assay zu nennen, der auf der empfindlichen Antwort von menschlichen Brustkrebszellen (MCF-7) bei der Anwesenheit östrogen wirksamer Mikroverunreinigungen beruht. Mit dem Proliferationstest wird die Summe der Einzelaktivitäten aller in einer Probe enthaltenen aktiven Verbindungen erfasst, die in Konzentrationseinheiten der Bezugssubstanz 17β-Estradiol angegeben wird (EEQ in ng/l). Das robuste Testsystem bewährt sich seit mehreren Jahren bei der Bestimmung der östrogenen Gesamtaktivität in Abwässern, Klärschlämmen, Sedimenten und Oberflächengewässern. In gereinigten kommunalen Abwässern liegen östrogene Gesamtaktivitäten in der Größenordnung von ca. 1 ng/l bis 5 ng/l. Die in den als Vorfluter dienenden Oberflächengewässern zu erwartenden Konzentrationen werden durch die individuellen Verdünnungsfaktoren bei der Einleitung der gereinigten Abwässer bestimmt, liegen aber in der Regel in Konzentrationsbereichen von <1 ng/l bis maximal 2 ng/l (EEQ). Weitergehende Abwasserreinigungstechnologien wie z.b. der Einsatz von Pulveraktivkohle, Ozonung usw. führen zu einer erheblichen Steigerung der Eliminationsleistung; bei Pulveraktivkohle-Dosierungen in der Belebung bzw. in der Belebung nachgeschalteten Kontakt- und Sedimentationsbecken wird die östrogene Gesamtaktivität um bis zu weitere 90 % verringert. Natürliche und synthetische Sexualhormone (17β-Estradiol und 17α-Ethinylestradiol) weisen die höchste östrogene Potenz auf und werden als Bezugssubstanzen für die Einordnung östrogener Aktivitäten genutzt. Beim E-Screen-Assay wird z.b. 17β-Estradiol (E2) als Bezugssubstanz mit der Aktivität 1 verwendet, die Aktivität anderer östrogen wirksamer Verbindungen wird in EEF-Werten (17β-Estradiol-Äquivalenten) angegeben. Abbauprodukte von E2 wie Estron und Estriol weisen schon um ein bis zwei Zehnerpotenzen niedrigere 65

66 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Aktivitäten als E2 auf und Phytoöstrogene, wie z.b. Coumestrol und Genistein sind bereits um einen Faktor 10 3 bis 10 4 schwächer wirksam. Mit dem E-Screen-Assay können sehr geringe östrogene Potentiale bis zu 0,1 ng/l EEQ bestimmt werden. Konkrete Zielsetzung im Rahmen des Schussen-Projektes war der Einsatz des E-Screen- Assays zur Bestimmung des Summenparameters östrogene Gesamtaktivität im Kläranlagenablauf der Kläranlage Langwiese (AZV Mariatal) und in Gewässerproben aus der Schussen und der Argen. Methoden Die Bestimmung der östrogenen Aktivität in Wasserproben ist derzeit nicht normiert. Dies betrifft sowohl die Methoden zur Aufarbeitung und Anreicherung der Proben als auch die für den Nachweis der hormonellen Aktivität eingesetzten Testsysteme. Grenz- und Schwellenwerte sind zwar in der Diskussion, aber auch hier ist keine Vereinheitlichung vorhanden. Die im Folgenden vorgestellte Methodik zur Bestimmung der östrogenen Gesamtaktivität mit dem E-Screen-Assay ist seit mehr als 10 Jahren am ISWA etabliert; eine interne Validierung der Anreicherungsmethoden und der Bestimmung der Gesamtaktivität erfolgte über den Abgleich mittels instrumenteller Analytik. Vorbehandlung und Festphasenanreicherung der Wasserproben Vorbemerkung: Alle für die Probenaufarbeitung verwendeten Glasgeräte wurden nach der Behandlung in der Laborspülmaschine mit demineralisiertem Wasser gespült, getrocknet, anschließend aufeinanderfolgend mit Methanol und n-hexan gespült und im Trockenschrank getrocknet. Wenn möglich, erfolgte die Aufbewahrung der Glasgeräte im Trockenschrank bei 90 C oder im geschlossenen Zustand. Als Verschlüsse für Probenflaschen wurden Schraubdeckel mit teflonisierten Dichtungen, die ebenfalls den obengenannten Reinigungsschritten unterworfen sind, verwendet. Pasteurpipetten u.ä. wurden vier Stunden in einer Soxhlet-Apparatur behandelt und anschließend bis zur Verwendung im Trockenschrank aufbewahrt. Alle für die Vorbehandlung der Glasgeräte und für die Durchführung der Festphasenanreicherung notwendigen Lösemittel sind für die Rückstandsanalytik geeignet. Eine Kontrolle der Lösemittel erfolgte regelmäßig über GC/MS- Screening nach Einengen der Lösemittel um einen Faktor 1000 (100 ml auf 0,1 ml). Nach der Eingangskontrolle von ph-wert und Leitfähigkeit wurden die Wasserproben in Schraubdeckelflaschen (Deckeldichtung teflonisiert) überführt und mit Schwefelsäure (p.a. 96 %) ein ph-wert von 2,5 eingestellt. Bei kohlendioxidhaltigen Proben wurde das Kohlendioxid durch intensives Rühren (Rührfisch, Magnetrührer) ausgetrieben; der Vorgang 66

67 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) wurde ggfs. nach der ph-einstellung weitergeführt. Die Anreicherung der Proben erfolgte an C18-Festphasenanreicherungskartuschen (Varian, BondElut MEGA BE-C18, 1 g, 6 ml). Die Kartuschen wurden zweimal mit jeweils 5 ml Aceton und zweimal mit jeweils 5 ml Reinstwasser voreluiert. Nach der Durchführung der Festphasenanreicherung wurden die Kartuschen über Nacht gefriergetrocknet und mit zweimal 5 ml Methanol eluiert. Das methanolische Eluat wurde mit 50 µl Dimethylsulfoxid versetzt und im Stickstoffstrom bei 40 C auf 50 µl eingeengt. E-Screen-Assay Die Extrakte wurden mit einem von Soto et al. (1995) entwickelten in-vitro-testsystem (E- Screen-Assay) nach den Vorschriften von Körner et al. (1999) mit Modifikationen (Schultis, 2005) durchgeführt. Der rezeptorvermittelte Assay mit der menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7, die bei Gegenwart östrogenaktiver Verbindungen proliferiert, bestimmt im Gegensatz zu anderen Testsystemen auf Östrogenizität einen biologischen Endpunkt auf zellulärer Ebene: Für eine positive Antwort des Testystems müssen östrogenaktive Verbindungen nicht nur an den Östrogenrezeptor binden, sondern eine Folge aufeinander aufbauender biologischer Effekte aktivieren. Kultivierung der MCF-7-Zellen Die MCF-7-Zellen wurden bei 37 C, 5 % CO 2 und Wasserdampfsättigung in Medium (Dulbeccos modified Eagles Medium, 5 % fetales Kälberserum) kultiviert und wöchentlich passagiert. Für die Durchführung des Assays wurden die Zellen trypsiniert, gezählt und in 96-well-Zellkulturplatten plattiert (ca Zellen pro well). Einen Tag nach der Aussaat wurde das Kulturmedium durch Dulbeccos Experimentalmedium ohne Phenolrot (CDFCS- Medium) ersetzt. Das im Experimentalmedium enthaltene fetale Kälberserum wurde zur Entfernung von Steroidhormonen über Dextran/Aktivkohle gestrippt. Zur Erstellung der Standard-Dosis-Wirkungsfunktion wurden die Zellen einer Verdünnungsreihe des natürlichen Hormons 17β-Estradiol (10-14 mol L mol L -1, 8 wells pro Konzentration) ausgesetzt. Als Kontrolle diente eine Spalte der Platte (8 wells); hier werden die MCF-7-Zellen nur mit Experimentalmedium versetzt. Durchführung des Assays Für die Untersuchung der Proben wurden die Probenextrakte (in Dimethylsulfoxid, siehe oben) in 5 ml CDFCS-Medium aufgenommen und Verdünnungsreihen zu den Zellen gegeben (9 Verdünnungspunkte, 8-fach-Bestimmung pro Konzentration und Platte). Der auf die Zellen einwirkende Konzentrationsbereich liegt im Allgemeinen zwischen dem 0,1- bis 400-fachen Wert der nicht angereicherten Proben. Nach einer Inkubationszeit von 5 Tagen 67

68 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) wurden die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen, mit Trichloressigsäure (10 %, auf Eis, 30 min) fixiert, mit Wasser gewaschen und bei 40 C getrocknet. Das Zellprotein wurde mit Sulforhodamin B (SRB) nach der Vorschrift von Shekan et al (1990) angefärbt. Nach einer 10-minütigen Inkubation wurde der überschüssige Farbstoff mit Essigsäure (1 %) ausgewaschen. Nach einer erneuten Trocknung wurde der verbliebene Farbstoff in Tris- Puffer (10 mm, ph 10.5, 100 µl pro well) resuspendiert. Die Extinktionen wurden bei 550 nm und 630 nm gemessen, die Berechnung und Auswertung der Dosis-Wirkungsfunktionen erfolgte mit dem Programm TableCurve 2D. Bei jeder Probenserie wurden für die korrespondierende Dosis-Wirkungsfunktion der Bezugssubstanz 17β-Estradiol und die Einzelproben Doppelbestimmungen auf Einzelplatten (96 well) durchgeführt; bei den Einzelproben beinhaltete die Doppelbestimmung den kompletten Aufarbeitungsgang. Blindwertbestimmungen wurden regelmäßig mit Leitungswasser, das wie eine Probe behandelt wird, durchgeführt (Leitungswasser zeigt im Gegensatz zu technisch hergestellten demineralisiertem Wasser im Vergleich zu den Negativkontrollen keine vermehrte Proliferation). Berechnung der östrogenen Aktivität Prinzipiell können mit dem E-Screen-Assay Aktivitäten von Einzelsubstanzen, Mischungen von Einzelsubstanzen und von Umweltproben mit unbekannten Inhaltstoffen bestimmt werden. Bei der Untersuchung von Umweltproben, die unbekannte oder nicht identifizierte Verbindungen enthalten, wird eine 17β-Estradiol-Äquivalentkonzentration (EEQ) wie folgt bestimmt: EEQ = EC 50 (E2, ng/l)/ EC 50 (Probe) Die Ermittlung des EC 50 -Werts einer Probe erfolgte aus anhand einer Dosis- Wirkungsfunktion auf der Basis verschiedener Verdünnungen einer wässrigen Probe (Untersuchung einer Verdünnung bzw. Anreicherung des Probenextraktes der Probe). Der erhaltene EC 50 -Wert ist dimensionslos und stellt den Verdünnungs- bzw. Anreicherungsfaktor dar, bei dem der Probenextrakt die halbmaximale Proliferation verursachte. 68

69 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) MCF7-Zellen in zwei 96 well-platten Tag 1 Platte 1 Platte 2 Positivkontrolle Negativkontrolle Testreihe Verdünnungsreihe 17ß-Estradiol (9 Verdünnungsstufen) Experimentalmedium (hormonfrei) Verdünnungsreihen Probenextrakte bzw. Einzelsubstanzen (9 Verdünnungsstufen) Inkubation im Brutschrank (5 Tage) Zellfixierung Anfärben der Zellen mit Sulforhodamin-B Bestimmung der Zellzahl (Messung der Extinktion am Mikroplattenphotometer) Auswertung Tag 6 Positivkontrolle Negativkontrolle Testreihe Abb : Schematische Darstellung der Durchführung des E-Screen-Assays Die östrogene Aktivität einer Umweltprobe reflektiert die Summe aller Effekte, die von einer komplexen Mischung an Verbindungen verursacht werden. Der Parameter EEQ beinhaltet demzufolge die addierten östrogenen Effekte einzelner aktiver Verbindungen in der Probe, kann aber auch von anti-östrogenen oder verallgemeinert toxischen Effekten beeinflusst sein. Mit dem E-Screen bestimmte östrogene Gesamtaktivitäten geben keine Informationen über die Art und chemische Struktur von Verbindungen, die in einer Probe vorkommen. Der EEQ beschreibt ausschließlich die in einer Probe festgestellte Aktivität in Konzentrationseinheiten der Bezugssubstanz 17β-Estradiol (E2). Die Bestimmungsgrenze des EEQ liegt im Bereich von < 0,1 ng/l. Die Definition dieser Konzentrationsgrenze erfolgt über den EC 10 der Dosis-Wirkungsfunktion von E2 und spiegelt die erhöhte Messunsicherheit wider, die bei Unterschreitung dieses Konzentrationsbereichs erhalten wird. 69

70 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Ergebnisse Östrogene Gesamtaktivität Insgesamt wurde der E-Screen-Assay bei sieben Probenserien eingesetzt, wobei bei allen Serien Ablaufproben der Kläranlage AZV Mariatal (KA), Proben aus der Schussen bei Oberbaumgarten (P3) und an der Mündung (P6) und aus der Argen bei Karbach/Amtzell (P4) untersucht wurden. Proben aus der Schussen oberhalb der Probennahmestelle KA wurden nur einmal im Mai 2010 untersucht (P00). Bei der einmaligen Untersuchung dieser Probe wurde keine östrogene Aktivität festgestellt. Interessanterweise konnte über den gesamten Untersuchungszeitraum nur bei zwei Ablaufproben der Kläranlage Langwiese (AZV Mariatal) zweifelsfrei eine östrogene Aktivität ermittelt werden (Probenkampagnen 10/2010 und 12/2011, EEQ 4,6 ng/l bzw. 2,6 ng/l); bei den anderen Proben traten ausgeprägte das Zellwachstum beeinträchtigende Effekte (s.u.) auf; eine EEQ-Bestimmung war nicht möglich. Die in den zwei positiven Proben bestimmten Konzentrationsbereiche entsprechen dabei den typischerweise in Abläufen kommunaler Kläranlagen auftretenden EEQ-Werten. Im Jahr 2008 wurden 24h-Mischproben von Zu- und Ablauf der Kläranlage Langwiese mittels E-Screen untersucht. Bei den Zulaufproben vom und (eingesetzt wurde der Ablauf Vorklärbecken = Zulauf Biologie) wurde eine östrogene Gesamtaktivität von 103 ng/l bzw. 56 ng/l ermittelt, für die korrespondierenden Ablaufproben (= Ablauf Nachklärbecken) lag die östrogene Gesamtaktivität bei 1,38 ng/l bzw. 1,64 ng/l. Toxische Effekte, wie sie im Rahmen der aktuellen Untersuchungen auftraten, konnten bei diesen Proben erst bei höheren Anreicherungsfaktoren festgestellt werden. Bei den Oberflächenwasser-Proben aus der Schussen bei Oberbaumgarten (P3) war in allen Fällen eine Auswertung möglich, die östrogene Gesamtaktivität lag hier in einem Bereich von < 0,1 ng/l (EEQ) bis zu 1,7 ng/l (EEQ). Die östrogene Aktivität in den an der Schussenmündung genommenen Proben lag bei 5 von 7 Proben unterhalb von 0,1 ng/l (EEQ), bei zwei Proben (Oktober 2010 und Dezember 2012, wie bei den KA-Proben) konnte ein EEQ von 0,74 ng/l bzw. 1,1 ng/l ermittelt werden. Diese Probestelle ist direkt durch den Ablauf der KA Eriskirch beeinflußt, so dass an dieser Probestelle wachstumshemmende Effekte bei den Probenahmestellen 3 und 6 nicht ausgeschlossen werden können. Bei einer im September 2010 unabhängig vom Projekt vorgenommenen Untersuchung von Proben der KA Eriskirch, die zwischen den Probenahmestellen 3 und 6 in die Schussen einleitet, lagen die EEQ-Werte in zwei aufeinanderfolgenden 24h-Mischproben des Kläranlagenablaufs allerdings bei 1,6 ng/l und 1,5 ng/l (EEQ) und wachstumshemmende Effekte konnten hier nicht nachgewiesen werden. Die Proben aus der Argen konnten über den gesamten 70

71 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Untersuchungszeitraum einem Bereich von < 0,1 ng/l bis zu 1 ng/l (EEQ). ausgewertet werden; die östrogene Gesamtaktivität lag hier in Abb : Östrogene Gesamtaktivität (EEQ). Probenahmepunkte: 00: Schussen oberhalb KA; KA Ablauf AZV Mariatal, 3: Schussen bei Oberbaumgarten (unterhalb KA); 4: Argen bei Karbach/Amtzell, 6: Schussenmündung; Toxische Effekte Die Bestimmung der östrogenen Gesamtaktivität erfolgt wie beschrieben über den Wendepunkt-Abgleich der Dosis-Wirkungsfunktionen, die von einer Verdünnungsreihe der Referenzsubstanz 17β-Estradiol und von einer Verdünnungsreihe eines Probenextraktes erhalten werden. Diese Form der Auswertung wird gewählt, da die maximale Zellproliferation, die durch Einzelsubstanzen oder durch Probenextrakte verursacht wird, erheblich von der Art der verursachenden Substanzen beeinflusst wird. Die EC 50 -Werte der Dosis-Wirkungsfunktionen werden durch die absoluten Zellzahlen weniger beeinflusst. Für die Auswertung problematisch erweisen sich allerdings Überlagerungen der Dosis- Wirkungsfunktionen mit allgemein wachstumshemmenden oder toxischen Effekten. Diese führen zum einen zur einer Stauchung der Dosis-Wirkungsfunktionen (Verringerung der relativen Proliferation). Wird die Ausbildung eines Plateaus der maximalen Zellproliferation durch zu große toxische Effekte gestört, erfolgt eine Verschiebung der Wendepunkte hin zu höheren Konzentrationen, für die Probe wird u.u. eine zu hohe östrogene Aktivität berechnet. Verhindern toxische Effekte die Ausbildung des Plateaus der Dosis- Wirkungsfunktion, können keine Wendepunkte mehr bestimmt werden. 71

72 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Üblicherweise lassen sich bei Abläufen konventioneller kommunaler Kläranlagen bemerkbare toxische Effekte bei Anreicherungen um mindestens einen Faktor 5-6 beobachten (hoher Faktor = geringe Toxizität, kleiner Faktor = hohe Toxizität). Bei Oberflächengewässerproben können je nach Qualität des Wassers Faktoren von bis zu 100 erreicht werden. Je niedriger diese Faktoren werden, umso mehr erhöhen sich die Bestimmungsgrenzen des Testsystems; ein Faktor 10 entspricht einer Bestimmungsgrenze von < 0,1 ng/l (EEQ), ein Faktor 1, also die Konzentration der originalen Probe, entspricht einer Bestimmungsgrenze von < 1 ng/l (EEQ). Die wachstumshemmenden bzw. unterbindenden Effekte von Proben lassen sich prinzipiell ebenfalls als Bewertungsparameter heranziehen. Zu beachten ist allerdings, dass keine kausale Zuordnung der Effekte möglich ist, die sowohl auf dem Vorhandensein zelltoxischer oder anti-östrogen wirkender Substanzen als auch von Verbindungen, die die Anhaftung der Zellen in den Kulturgefäßen verhindern, beruhen können. Die im Rahmen des Projektes untersuchten Proben aus der Argen wiesen die geringsten toxischen Effekte auf, die Ergebnisse sind hier größtenteils mit Gewässerproben guter Qualität vergleichbar. Bei weitem stärker ausgeprägte Effekte konnten in den Proben aus der Schussen gemessen werden. Bei den Abläufen der KA Mariatal führten bei den meisten Proben bereits Aufkonzentrierungen um einen Faktor 2 zu Hemmungen des Zellwachstums. Bei zeitgleich zur Probenkampagne E untersuchten Kläranlagenabläufen (24h-Mischproben KA Eriskirch, KA Merklingen und LFKW Büsnau) traten wachstumshemmende Effekte erst bei Anreicherungsfaktoren von 4 bis 10 auf. Die bei Oberbaumgarten genommenen Proben wiesen eine drei- bis elffach geringere Toxizität als die Kläranlagenablaufproben auf (Mittelwert Faktor 6,3), tendenziell erhöhte sich die Toxizität des Schussenwassers im Abschnitt zwischen Oberbaumgarten und der Mündung wahrscheinlich verursacht durch die Einleitung der Abwässer der KA Eriskirch wieder geringfügig. Die stärksten Effekte, die in den Oberflächengewässern bei den Probennahmen E und H (Oktober 2010 und September 2011) auftraten, lassen eine saisonale Abhängigkeit vermuten. Zusammenfassung und Bewertung Die Bestimmung der östrogenen Gesamtaktivität mit dem E-Screen-Assay erwies sich insbesondere im Ablauf der KA Langwiese an der Schussen als problematisch, da bei verschiedenen Probenserien ausgeprägte toxische Effekte auftraten. Eine Zuordnung dieser Effekte auf bestimmte Substanzen oder Substanzgruppen ist nicht ohne weiteres möglich; 72

73 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Abb : Toxische Effekte dargestellt als 1/Anreicherungsfaktor. Probenahmepunkte: 00: Schussen oberhalb KA; KA: Ablauf AZV Mariatal, 3: Schussen bei Oberbaumgarten (unterhalb KA); 4: Argen bei Karbach/Amtzell, 6: Schussenmündung; denkbar sind u.a. anti-östrogen oder allgemein zelltoxisch wirkende Verbindungen, aber auch Substanzen, die lediglich das für die Bestimmung der östrogenen Aktivität notwendige Anhaften der menschlichen Brustkrebszellen in den Untersuchungsplatten stören. Die Erfassung und Zuordnung der obengenannten Effekte ist prinzipiell nur mit weitergehenden Untersuchungen von fraktionierten Proben und parallel durchgeführter instrumenteller Analytik möglich, die im Rahmen dieses Projektes nicht durchgeführt werden konnte. Die Betrachtung der ermittelten toxischen Effekte erlaubt aber ein Ranking der untersuchten Probenahmestellen. Die Proben des Oberflächengewässers Argen verursachten überwiegend sehr geringe toxische Effekte, wie sie auch bei anderen Gewässern mit guter Wasserqualität auftreten. Sehr ausgeprägte Effekte konnten in den Abwasserproben der Kläranlage AZV Mariatal festgestellt werden. Schwächer ausgeprägte Effekte im Unterlauf der Schussen werden wahrscheinlich durch das Abwasser der KA Eriskrich verursacht. Die bei den Proben der KA Mariatal festgestellten Effekte waren zumindest bei den aktuell vorgenommenen Untersuchungen im Vergleich zu anderen kommunalen Kläranlagen signifikant höher. Aufgrund der geringen Probenanzahl kann bei Betrachtung des gesamten Untersuchungszeitraum nur vermutet werden, dass die beschriebenen toxischen Effekte saisonalen Schwankungen unterworden sind. Nicht auszuschließen ist, dass die Schussen schon oberhalb der KA Mariatal erheblich belastet ist. 73

74 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) Tabelle : E-Screen-Assay Darstellung der Gesamtergebnisse. Probenahmestellen: 0: Probenahme Schussen ober AZV Mariatal, 3 - Oberbaumgarten unterhalb Kläranlage; 4 - Argen bei Karbach/-Amtzell, 6 Schussenmündung, KA: Ablauf Kläranlage AZV Mariatal, C I: Probenahmekampagnen Probenkampagne C (Juni 2010) D (August 2010) E (Oktober 2010) PN-Stelle EEQ RPE TOX EEQ RPE TOX EEQ RPE TOX 0 < 0,1 0 11,8 n.g. - - n.g. n.g. - 3 < 0,1 0 16,8 1, ,6 < 0,1 0 12,8 KA < 0,1 0 1,5 < 0,1 0 4,0 4,6 19 1,9 6 < 0,1 0 15,9 < 0,1 0 6,1 0, ,9 4 0, , ,1 < 0,1 0 12,5 Probenkampagne F (Mai 2011) G (Juli 2011) H (September 2011) I (Dezember 2011) PN-Stelle EEQ RPE TOX EEQ RPE TOX EEQ RPE TOX EEQ RPE TOX 0 n.g. - - n.g. - - n.g. - - n.g < 0, ,6 0,91 20,8 11,2 < 0,1 0 7,94 0,86 16,2 17,78 KA < 0,1 4 2,3 < 0,1 0 1,26 < 0,1 0 1,99 2,9 27 3,98 6 < 0, ,7 < 0,1 0 7,94 < 0,1 11,5 7,80 1, ,8 4 < 0, ,8 < 0, ,6 < 0,1 0 6,86 0, EEQ: Äquivalentkonzentration in Konzentrationseinheiten der Bezugssubstanz 17ß-Estradiol TOX: Anreicherung bei EC 50(tox): Probenanreicherung, bei der der Wendepunkt überlagernder Toxizitätsfunktionen erreicht wird. Die toxischen Funktionen können sowohl durch echte toxische Effekte als auch durch andere Effekte (z.b. Störungen bei der Anhaftung der Zellen in den 96-well-Platten) verursacht werden. RPE: Relativer Proliferationseffekt; Maximal durch die Probe induzierte Proliferation im Vergleich zur maximal durch 17ß-Estradiol verursachten Proliferation (= 100 %). n.g.: keine Proben erhalten Literatur Körner W, Schuller W, Hagenmaier H, Hanf V (1999a): Entwicklung und Erprobung eines einfachen Screening-Systems für östrogenartig wirkende Umweltchemikalien. Forschungsbericht Projekt Umwelt und Gesundheit (PUG ). Körner W, Hanf V, Schuller W, Kempter C, Metzger J, Hagenmaier H (1999b): Development of a sensitive E-Screen assay for quantitative analysis of östrogenic activity in municipal sewage treatment plants. Sci Total Environ 225 (1-2), Körner W (2000): Nachweis von östrogen- und androgenartig wirkenden Substanzen in der Umwelt durch Kombination von chemischer und biologischer Analytik. Habilitationschrift, Universität Tübingen. Schultis T (2005): Erfassung der östrogenen Wirksamkeit von Umweltproben und Reinsubstanzen durch biologische Testsysteme Entwicklung und Vergleich von in-vitro Assays. Dissertation, Universität Stuttgart, Oldenburg Industrieverlag GmbH (Stuttgarter Berichte zur Siedlungswasserwirtschaft, Band 181), München. Shekan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D (1990): New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. J. Natl. Cancer Inst. 82(13): Soto AM, Chung KL, Sonnenschein C (1994): The pesticides Endosulfan, Toxaphene and Dieldrin 74

75 Endokrine Potentiale und Wirkungen (E-Screen) have Östrogenic Effects on Human Östrogen-sensitive Cells. Environ. Health Perspect. 102(4): Soto AM, Sonnenschein C, Chung KL, Fernandez M.F, Olea N, Serrano FO (1995): The E-Screen Assay as a Toy to identify Östrogens: An Update on Östrogenic Environmental Pollutants. Environ. Health Perspect. 103: Kurzzusammenfassung: E-Screen Hohe Variabilität zwischen den einzelnen Probenahmen KA Langwiese: cytotoxische Effekte maskieren endokrine Wirkungen Oberflächenwasser Schussen: P00 oberhalb KA keine messbare östrogene Aktivität Alle anderen Probestellen: ca. 1/3 der östrogenen Gesamtaktivität des KA- Ablaufs, um Faktor 3-11 geringere toxische Effekte Bearbeitung des Teilprojektes: Dr. Bertram Kuch, Institut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und Abfallwirtschaft der Universität Stuttgart, Bandtäle 2, Stuttgart; , bertram.kuch@iswa.uni-stuttgart.de 75

76 Endokrine Potentiale und Wirkungen (Reportergenassays zu endokrinen Potentialen) (Anti)-östrogene und anti-androgene Potentiale: Reportergenassays Methoden: Test auf östrogene und anti-östrogene Potentiale Für diese Tests wurde 2009 die humane Mammakarzinomzelllinie (MVLN), 2010 und 2011 die Zelllinie HeLa-9903 verwendet. Beide Zelllinien sind stabil mit einem Luciferasegen unter Kontrolle der Östrogen-Rezeptoren alpha und beta (über Bindung an transgene estrogen regulated elements aus dem Krallenfrosch Xenopus) transfiziert (Pons et al., 1990). Die Aktivität des Reportergenproduktes Luciferase wird luminometrisch gemessen und ist proportional zum östrogenen Potential der Probe, welches als Östrogenäquivalent (EE) in Relation zu 17β-Östradiol angegeben wird. Anti-östrogene Potentiale wurden mit den gleichen Tests erfasst, wobei die Probe mit der Standardsubstanz 17β-Östradiol versetzt wird. Luminometrisch gemessen wird die Kompetition möglicher anti-östrogen wirkender Stoffe mit diesem Standard um die ERα-Bindungsstelle. Eine Verringerung des Signals quantifiziert die anti-östrogenen Potentiale. Dieser Test ist als standardisierter, schneller und hochsensitiver Assay anerkannt und detektiert Östrogenäquivalente bis in den ng/l-bereich. Die Tests mit den HeLa-9903-Zellen wurden angelehnt an das Protokoll der US EPA ( durchgeführt Test auf anti-androgene Potentiale mittels MDA-kb2-Zellen Der Test wird bei allen o.g. wässrigen Proben bzw. Sedimenten eingesetzt und basiert auf einer stabil mit einem Luciferasegen transfizierten Mammakarzinomzelllinie, hier die Linie MDA-kb2. Das Luciferasegen steht unter Kontrolle des Androgen-Rezeptors (AR). Die Aktivität der AR-abhängigen Luciferase ist als Maß für androgene Potentiale anzusehen, und die Resultate werden als Äquivalente des Modell-Androgens Dehydrotestosteron (DHT) angegeben. Über einen kompetitiven Assay mit Mischungen aus zu testender Probe und dem Standard-Induktor DHT wird die Verringerung des luminometrisch detektierten Luciferase-Signals in Relation zum von DHT alleine ausgehenden Signal quantifiziert. Diese Reduktion ist äquivalent zum anti-androgenen Potential in der Probe. 76

77 Endokrine Potentiale und Wirkungen (Reportergenassays zu endokrinen Potentialen) Untersucht wurden Ablaufproben der Kläranlage Langwiese von (PN C-I) sowie Sedimentproben zu diesen Probenahmezeitpunkten sowie 2009 (PN A und B) von der Probestelle P3 (Schussen unterhalb KA) und P4 (Argen). Resultate Östrogene Potentiale Kläranlagenablauf Im Ablauf der KA Langwiese wurden lediglich bei der PN D im August 2010 östrogene Potentiale mit einem EEQ von 0,878 nachgewiesen. Nachfolgende Tabelle zeigt, dass dieser Wert im Bereich der üblichen, in KA-Abläufen vorkommenden Östrogenaktivitäten liegt. Tab : Vergleichswerte zu östrogenen Potentialen in KA-Abläufen KA-Zulauf EEQ (ng/l) KA-Ablauf EEQ (ng/l) Land Ref. 0, ,05-2,6 Niederlande Vethaak et al ,2-75 1,7-3,4 Niederlande Murk et al ,3-81 <LOD Neuseeland Leusch et al ,6-5,2 0,6-5,2 Japan Nakada et al ,1-3,9 Tschechien Jarasova et. Env. Poll. einger. Sedimentproben Abb : Östrogene Potentiale in Sedimentproben 2009 sowie Die mit den HeLa-9903-Zellen analysierten Proben von 2010 und 2011 zeigten absolut gesehen niedrigere östrogene Potentiale als die Proben aus 2009, die mit MVLN-Zellen 77

78 Endokrine Potentiale und Wirkungen (Reportergenassays zu endokrinen Potentialen) untersucht wurden. Mit beiden Testsystemen konnten eindeutig geringere östrogene Potentiale an P4 (Argen) im Vergleich zu P3 (Schussen) nachgewiesen werden. Die für 2009 gemessenen Werte entsprechen Literaturdaten zu belasteten Sedimenten (z.b. Hilscherova et al., 2010, Abb ). Abb : Vergleichswerte zu östrogenen Potentialen in Sedimenten aus Hilscherová et al. (2010) Anti-östrogene Potentiale Kläranlagenablauf Im Ablauf der KA Langwiese wurden lediglich bei der PN I ein schwaches anti-östrogenes Potential nachgewiesen (IC25 ~ 2,5x aufkonzentrierte Probe). Sedimentproben Abb : Anti-östrogene Potentiale in Sedimentproben 78

79 Endokrine Potentiale und Wirkungen (Reportergenassays zu endokrinen Potentialen) Auch anti-östrogene Potentiale sind in der Schussen deutlich höher als in der Argen, liegen aber, absolut gesehen, ebenfalls im eher niedrigen Bereich. Anti-androgene Potentiale Kläranlagenablauf Im Ablauf der KA Langwiese wurden keine anti-androgenen Potentiale nachgewiesen. Sedimentproben Abb : Anti-androgene Potentiale in Sedimentproben In Sedimenten der Schussen konnten 2010 und 2011 anti-androgene Potentiale nachgewiesen werden, die als relativ niedrig einzustufen sind. Zu drei Zeitpunkten waren die Werte für Schussen und Argen vergleichbar, zu zwei Zeitpunkten lagen die Werte für die Schussen deutlich über denjenigen der Argen. Vergleichswerte für IC25-Werte liegen für belastete Sedimente aus Tschechien vor. Diese waren immer höher als 200 g/ml. Hilscherová et al. (2010) beschreibt Werte bis zu ca. 7000g/ml für belastete Sedimente. Literatur Hilscherová et al. (2010). Seasonally and Regionally Determined Indication Potential of Bioassays in Contaminated River Sediments. Environ. Toxicol. Chem. 29(3):

80 Endokrine Potentiale und Wirkungen (Reportergenassays zu endokrinen Potentialen) Kurzzusammenfassung: Reportergenassays endokrine Potentiale Mittlere östrogene und niedrige anti-östrogene Potentiale im Ablauf der KA Langwiese Geringe östrogene, anti-östrogene und anti-androgene Potentiale in den Sedimenten unterhalb der KA Langwiese Deutlich niedrigere Werte in den Sedimenten der Argen Um Faktor differierende Werte zwischen 2009 und 2010/11 Bearbeitung des Teilprojektes: Prof. Dr. Ludek Blaha, RECETOX, Masaryk University, Brno, Czech Republic; ; 80

81 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Endokrine und reproduktionstoxische Wirkung bei Potamopyrgus antipodarum Hintergrund und Zielsetzung Das Sediment von Oberflächengewässern stellt für viele Schadstoffe eine Senke für über die Wasserphase eingetragene Schadstoffe dar (Prosi & Müller, 1987; Calmano, 2001), so dass Sedimentuntersuchungen eine zeitlich integrierende Bewertung der Gewässerbelastung ermöglichen. Treffenderweise werden Sedimente daher auch als "Gedächtnis des Gewässers" bezeichnet. Gleichzeitig sind Sedimente eine Quelle für Schadstoffe, da eine Remobilisierung sedimentgebundener Substanzen, z.b. durch Hochwasserereignisse oder beim Ausbaggern von Wasserstraßen bzw. bei Veränderungen der physiko-chemischen Bedingungen (ph-wert, Redoxpotential, Salinität, Huminstoffgehalt), jederzeit wieder erfolgen kann (Calmano, 2001). Zudem kann eine direkte Aufnahme und bei ausreichend persistenten und lipophilen Substanzen gegebenenfalls eine Bioakkumulation der Schadstoffe in Benthosorganismen erfolgen, so dass Schadstoffe in die Nahrungskette gelangen und sich dort anreichern (Ingersoll et al., 1995). Die Überwachung der Sedimentqualität, ähnlich der Wasserqualität, mit geeigneten Bewertungsverfahren ist daher für die Erfassung des ökologischen Zustands von Gewässern im Allgemeinen und der Schadstoffbelastung im Besonderen unerlässlich (Long & Chapman, 1985; Förstner et al., 1987). Die Erfassung toxischer Substanzen in Sedimenten basierte in der Vergangenheit vor allem auf chemisch-analytischen Messungen. Diese Untersuchungen geben zwar Aufschluss über das Auftreten von Umweltschadstoffen, liefern jedoch keine Information über die Wirkung der vorgefundenen Chemikalien in den ermittelten Konzentrationsbereichen auf wasser- und sedimentbewohnende Organismen. Ökotoxikologische Wirkungsuntersuchungen, die Effekte von Umweltproben auf Biota in den Vordergrund stellen, bieten in besonderem Maße eine sinnvolle Ergänzung. Derzeit existieren jedoch nur wenige biologische Testverfahren zur Erfassung chronischer, vor allem aber reproduktionstoxischer Wirkungen von Sedimenten. Zwar kann im Rahmen ökotoxikologischer Untersuchungen auf eine Reihe von Akut- und Reproduktionstests zurückgegriffen werden, kaum eines dieser Standardverfahren bedient sich dabei aber typischer sedimentbewohnender Arten mit hoher Ökosystemrelevanz (Chapman & Hollert 2006). Die Mollusken (Weichtiere) stellen nach den Arthropoden (Gliedertiere mit Insekten, Krebsen, etc.) den artenreichsten Stamm im Tierreich dar, wobei allein 80% der Molluskenarten auf die Gastropoden (Schnecken) entfallen. Speziell die 81

82 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Vorderkiemerschnecken (Prosobranchier) sind ein wichtiger Bestandteil der aquatischen Lebensgemeinschaften und besitzen eine hohe Relevanz für marine und limnische Ökosysteme. Die Tatsache, dass die Mollusken als Standardtestsysteme in der Ökotoxikologie bisher eine nur untergeordnete Rolle gespielt haben, hängt primär mit der in der Vergangenheit feststellbaren Fixierung dieser Wissenschaftsdisziplin auf Akuttests zusammen. Gerade Effekte, die über Steroid- oder Xenohormone vermittelt werden, lassen sich durch Akuttests nicht oder nur schwer erfassen. Vor dem Hintergrund, dass seit Jahren eine spezielle Gruppe reproduktionstoxischer Substanzen in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen und öffentlichen Interesses getreten ist, welche sich durch eine geschlechtshormonähnliche Wirkung auszeichnet, ist dies von besonderer Wichtigkeit. Diese als endokrine Disruptoren bezeichneten Substanzen beeinflussen, im Gegensatz zu den allgemein reproduktionstoxisch wirkenden Stoffen, direkt oder indirekt das Hormonsystem von Mensch und Tier und können somit die endokrine Kontrolle des Organismus stören. Die verdächtigen Substanzen gehören sehr unterschiedlichen chemischen Verbindungsklassen an, so etwa Herbizide, Fungizide, Insektizide, Nematizide und unterschiedliche Industriechemikalien (z.b. Phthalate, Alkylphenole und Bisphenol A) (Colborn et al. 1993). Da zahlreiche dieser Verdachtsstoffe in erheblichem Umfang produziert werden und in die Umwelt gelangen, ist nicht a priori auszuschließen, dass sie zu einer Beeinträchtigung der endokrinen Kontrolle von Mensch und Tier beitragen können. Bereits vor zehn Jahren wurden Vorderkiemerschnecken neben den Insekten als die aussichtsreichsten Kandidaten für die Entwicklung von neuen Testsystemen zur Ermittlung endokriner Wirkungen unter den Wirbellosen identifiziert (defur et al. 1999). Zum Monitoring werden sie aufgrund des Imposexphänomens, das als gut dokumentiertes Beispiel einer endokrinen Disruption mit weitreichenden Folgen für die betroffenen Schneckenpopulationen gilt, in Küstengewässern seit 15 Jahren routinemäßig eingesetzt. Das Imposexphänomen und sein Einsatz in großen internationalen Monitoringprogrammen zeigen, dass Schnecken auch im Rahmen internationaler Messprogramme große Bedeutung beigemessen wird. Speziell bezüglich endokrin vermittelter Effekte haben sich Vorderkiemerschnecken als sensitiv erwiesen (Oehlmann & Schulte-Oehlmann 2003; Oetken et al. 2004; Oehlmann et al. 2007). Im Rahmen des OECD-Programms zur Entwicklung neuer Richtlinien für die Chemikalientestung wird derzeit ein Reproduktionstest mit der Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum standardisiert (Duft et al. 2007), der die Ermittlung östrogenartiger und allgemein reproduktionstoxischer Effekte von Einzelsubstanzen und Substanzgemischen in Wasser-, Abwasser- und Sedimentproben ermöglicht (Schulte- Oehlmann et al. 1999, 2001; Duft et al. 2003a, b; Jobling et al. 2004; Schmitt et al. 2008b; Stalter et al. 2010). Der Test wurde von Galluba & Oehlmann (2012) für die Ermittlung des 82

83 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) endokrinen Potentials von Sedimenten aus kleineren hessischen Fließgewässern eingesetzt. Dabei zeigte sich in rund drei Viertel der Testsedimente eine signifikant erhöhte Embryonenzahl von P. antipodarum, was eine östrogene Belastung indiziert. Auch im Yeast Estrogen Screen (YES) bzw. im Yeast Androgen Screen (YAS) mit wässrigen Sedimenteluaten erwiesen sich knapp 70% der Sedimente als östrogen und/oder androgen aktiv. Für 70% der im Schneckentest positiv getesteten Sedimente war der Befund im YES ebenfalls positiv. Dieser Test wird im Projekt SchussenAktiv eingesetzt, um das endokrine Potenzial von nativen Sediment- und Abwasserproben aus dem Einzugsbereich des Bodensees zu untersuchen, wobei eine laboreigene SOP (standard operation procedure Standardarbeitsanweisung; Schmitt et al. 2008a) angewendet wird, die Grundlage der OECD-Richtlinienentwicklung ist. Dieses Versuchsdesign wurde auch von Galluba & Oehlmann (2012) eingesetzt. Methoden Potamopyrgus antipodarum (GRAY 1843), die Zwergdeckelschnecke, wird systematisch dem Stamm Mollusca, der Klasse Gastropoda, der Unterklasse Prosobranchia, der Ordnung Mesogastropoda und der Familie Hydrobiidae zugeordnet. P. antipodarum stammt ursprünglich aus Neuseeland, wurde jedoch in den letzten Dekaden durch menschliche Aktivitäten in fast alle Teile der Welt eingeführt. Das typische Habitat der Art umfasst langsam fließende Gewässer von kleinen Bächen bis hin zu Strömen, aber auch Seen und Ästuarbereiche, wo aufgrund der hohen Reproduktionsleistung schnell große Populationsdichten erreicht werden können (Kinzelbach 1995; Cope & Winterbourn 2004). Die Schalenhöhe der Adulten beträgt im Schnitt 4,3 mm. P. antipodarum lebt bevorzugt im Süßwasser, wird jedoch regelmäßig im Ästuarbereich von Flüssen sowie im östlichen Teil der Ostsee angetroffen, da die Art selbst bei Salinitäten von bis zu 15 überlebt und sich erfolgreich fortpflanzt (Jacobsen & Forbes 1997). P. antipodarum bevorzugt Weichsedimente in stehenden und langsam fließenden Gewässern. Die Zwergdeckelschnecke ernährt sich von Detritus, Algen und Bakterien, die von der Oberfläche von Pflanzen, Hartsubstraten und vom Sediment abgeweidet werden. In ihrem ursprünglichen Verbreitungsgebiet weisen die Populationen ein weitgehend ausgeglichenes Geschlechterverhältnis auf, wobei biparentale (mit Männchen und Weibchen) und parthenogenetische (nur weibchen) Populationen sympatrisch (d.h. im gleichen Lebesraum) auftreten. Die europäischen Populationen bestehen dagegen praktisch ausschließlich aus sich parthenogenetisch fortpflanzenden Weibchen. Ein einzelnes Exemplar ist daher in der Lage, eine neue Population nach einer Verfrachtung in ein anderes Habitat aufzubauen. In Europa werden männliche Schnecken außerordentlich selten 83

84 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) gefunden (Wallace 1979; Ponder 1988) und traten bei mehr als analysierten Exemplaren aus der hier verwendeten Laborzucht bisher nicht auf. Abb : Potamopyrgus antipodarum. Weichkörper nach Entfernung der Schale (verändert nach Fretter & Graham 1994); ag = Eiweißdrüse, bp = Bruttasche, dg = Mitteldarmdrüse, em = Embryo, fo = weibliche Geschlechtsöffnung (Vagina), me = Mantelrand, op = Operculum, ov = Ovar, sn = Schnauze, st = Magen. Die Zwergdeckelschnecke pflanzt sich zwar ganzjährig fort, jedoch wird das Maximum der Reproduktionsleistung im Frühjahr und ein Minimum vom Spätsommer bis frühen Winter erreicht. Zudem zeigt P. antipodarum mit der Ooviviparie eine spezielle Form der Brutpflege (Fretter & Graham 1994). Die Eier entwickeln sich im vorderen Abschnitt des pallialen Eileiters, der sich zu einer Bruttasche entwickelt hat. Dort befinden sich die älteren Embryonen, die bereits eine sichtbare Schale entwickelt haben, im vorderen Teil, während die jüngeren, noch unbeschalten Embryonen posterior liegen. Die Jungschnecken werden schließlich mit dem Aufreißen der Eihülle über die weibliche Geschlechtsöffnung und die Mantelhöhle entlassen. Wenn die Schale der Weibchen entfernt wird, können die in der Bruttasche liegenden Embryonen erkannt werden (Abb ). Wird die Bruttasche eröffnet und werden danach alle Embryonen daraus entfernt, kann der individuelle Fortpflanzungserfolg der Weibchen durch Auszählen der Embryonen ermittelt werden (Abb ). Für die Testung wurden Schnecken aus der laboreigenen Kultur von P. antipodarum eingesetzt. Der Test wurde gemäß der Standardarbeitsanweisung (SOP Part III: Reproduction test using sediment exposure) der Abteilung Aquatische Ökotoxikologie der Universität Frankfurt/Main durchgeführt (Schmitt et al. 2008a). Die ermittelten Endpunkte sind die Mortalität über den 28-tägigen Expositionszeitraum, die durchschnittliche Zahl aller Embryonen bei den exponierten Weibchen sowie die durchschnittliche Zahl der Embryonen mit und ohne Schale. 84

85 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Embryo mit Schale Embryo ohne Schale 0,2 mm Abb : Potamopyrgus antipodarum. Embryonen mit und ohne Schale nach Entfernung aus der Bruttasche. Insgesamt wurden 15 Sediment- und sieben Abwasserproben aus den Probenahmekampagnen vom Juni (Kodierung: "C"), August ("D") und Oktober 2010 ("E") sowie vom Mai ("F"), Juli ("G"), September ("H") und Oktober 2011 ("J") analysiert (Tab. 1). Die Proben wurden von der Universität Tübingen, Physiologische Ökologie der Tiere, kodiert und tiefgefroren verschickt und bis zum Beginn der Testung in Frankfurt tiefgefroren gelagert. Tab : Übersicht der im Reproduktionstest mit Potamopyrgus antipodarum getesteten Sediment- und Abwasserproben. Kampagne Code Sediment Abwasser C (Juni 2010) D (August 2010) E (Oktober 2010) F (Mai 2011) G (Juli 2011) H (September 2011) J (Oktober 2011) C KA C0 C3 C4 D KA D3 D4 E KA E3 E4 F KA F3 F4 G KA G3 G4 H KA H3 H4 J KA J3 J4 X X X X X X X X X X X X X X X 85 X X X X X X X

86 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Die Proben der Sammelkampagne C wurden unmittelbar nach Erhalt getestet. Da bei diesem Test in der Positivkontrolle keine Erhöhung der Embryonenzahl im Vergleich zur Negativkontrolle ermittelt wurde (vgl. Kap. 3.1), wurde der Test im November 2010 mit den Rückstellproben der drei Sedimente zusammen mit der Testung der Proben aus den Sammelkampagnen D und E wiederholt; die Abwasserproben aus dem Juni wurde bei der ersten Testung verbraucht und konnte daher nicht bei der Testwiederholung eingesetzt werden Die im Folgenden wiedergegebene Testdurchführung bezieht sich auf die vergleichende Testung der Proben aus den drei Kampagnen des Jahres 2010 im November 2010 sowie auf die Testung der vier Kampagnen aus dem Jahr Vor Testbeginn wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut, die Sedimente mit einem Edelstahlspatel durchmischt und ein Aliquot von je 100 g Nassgewicht in die Testgefäße (1 L-Schraubgläser aus Borosilikatglas) überführt. Von den aufgetauten Abwasserproben wurden je 800 ml in 1 L-Schraubgläser aus Borosilikatglas überführt. Zusätzlich wurde für die Negativkontrolle (K) und die Positivkontrolle (PK) ein Kunstsediment aus 95% Quarzsand (Korngröße µm) und 5% getrocknetem Buchenlaub (Fagus sylvatica) mit 50 g Trockenmasse pro Replikat verwendet. Für die PK wies das Kunstsediment eine Nominalkonzentration von 30 µg/kg an 17α-Ethinylestradiol (EE2) auf, um die Sensitivität der eingesetzten Organismen für eine Östrogenkontamination überprüfen zu können. Bei der Testung der Proben aus dem Jahr 2010 wurde für jede Expositionsgruppe, einschließlich der Negativkontrolle, zwei Replikate angesetzt, für die Positivkontrolle vier Replikate. Für die Proben aus den Probenahmekampagnen des Jahres 2011 wurden für jede Expositionsgruppe zwei Replikate, für die Positiv- und Negativkontrolle jedoch jeweils vier Replikate eingesetzt. Alle Sedimentproben, einschließlich K und PK, wurden mit 800 ml rekonstituiertem Wasser (vollentsalztes Wasser, hergestellt über eine Umkehrosmoseanlage, anschließend versetzt mit 1,5 g Tropic Marin Meersalz und 0,9 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3 ) pro 10 L und für mindestens 24 h vor der Verwendung belüftet) vorsichtig überschichtet, um eine Verwirbelung des Sediments zu vermeiden. Die Gefäße wurden über eine durch den Schraubdeckel eingeführte Pasteurpipette belüftet. Anschließend wurden pro Replikat 20 adulte Tiere mit einer Schalenhöhe von 3,5 bis 4,3 mm eingesetzt. Der Versuch wurde im statischen System (ohne Erneuerung des Wassers) bei 16 C und einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 16:8 h in einem klimatisierten Tierhaltungsraum an der Universität Frankfurt/Main durchgeführt. Während des 4-wöchigen Versuchszeitraums lag die Temperatur in den Testgefäßen bei 16 ± 1 C, der ph-wert bei 8,0 ± 0,5, der Sauerstoffgehalt bei über > 8 mg/l, die Sauerstoffsättigung bei mehr als 80% und die Leitfähigkeit bei 770 ± 100 µs/cm. Lediglich in den Abwasserproben wich die Leitfähigkeit ab (D: µs/cm; E: µs/cm; F: µs/cm; G: µs/cm; H: µs/cm; J: µs/cm). Die Wasserparameter wurden zu 86

87 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Versuchsbeginn, während des Experiments wöchentlich und am Ende des Versuchs überprüft. Zusätzlich wurden am Versuchsende der Ammonium-, Nitrit- und Nitratgehalt überprüft. Die Versuchstiere wurden dreimal wöchentlich mit fein gemahlenem TetraPhyll (rund 0,2 mg Trockenmasse pro Schnecke; 6 mg je Replikat) gefüttert. Nach 28 Tagen wurden alle überlebenden Schnecken eines Replikats aus dem Sediment entfernt und für 45 bis 90 Minuten in einer 2,5%-igen Magnesiumchloridhexahydrat-Lösung (MgCl 2 x 6 H 2 O, gelöst in vollentsalztem Wasser) narkotisiert. Die individuellen Schalen- und Mündungshöhen wurden auf 0,1 mm genau vermessen, die Schale mit einer Kombizange vorsichtig angebrochen, und die Schalenbruchstücke unter einem Stereomikroskop entfernt. Die Geschlechtsreife der Tiere wurde auf Basis der Textur und Färbung des Ovars sowie der Füllung des gonadialen und renalen Eileiterabschnitts mit Eizellen überprüft und die Bruttasche mit Feinpinzetten eröffnet. Anschließend wurde die Zahl der Embryonen mit und ohne Schale sowie die Gesamtembryonenzahl bestimmt. Bei der Untersuchung traten weder nicht geschlechtsreife Tiere noch parasitierte Exemplare auf, so dass alle analysierten Weibchen für die Auswertung herangezogen werden konnten. Bei der Testung der Proben aus den drei Kampagnen des Jahres 2010 wurde eines der in der SOP (Schmitt et al. 2008a) festgelegten Validitätskriterien nicht erfüllt: Die Mortalität in der Negativkontrolle betrug 42,5% und überstieg damit den maximal zulässigen Wert von 20%; alle anderen Validitätskriterien wurden 2010 dagegen eingehalten. Bei der Testung der Proben aus den vier Kampagnen des Jahres 2011 wurden alle Validitätskriterien eingehalten. Die statistische Auswertung der Daten und Absicherung der Befunde erfolgte mit Hilfe des Programms Prism, Version 4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Normalverteilte Daten (überprüft mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnow- und D'Agostino- Pearson-Tests) mit gleichen Varianzen (überprüft mit dem Bartlett-Test) wurden mit einer einseitigen ANOVA mit Dunnett-Posttest auf signifikante Unterschiede zur Negativkontrolle (K) überprüft, andernfalls wurde der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test mit dem Posttest nach Dunn verwendet. Die Mortalitäten als quantale Daten wurden mit Hilfe des Fishers Exact Test analysiert. Ergebnisse und Diskussion Erster Test mit den Proben vom Juni 2010 (Sammelkampagne C) Keine der Proben zeigte eine akuttoxische Wirkung: Die Mortalität war in allen Versuchsansätzen, einschließlich der beiden Kontrollen, gering und lag unter 10%. In den Sedimentproben C0 und C3 wurden keine signifikanten Unterschiede der Embryonenzahlen 87

88 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) gegenüber der Negativkontrolle ermittelt. In der Sedimentprobe C4 zeigte sich eine signifikante Zunahme der Gesamtzahl der Embryonen und der Embryonen ohne Schale um 25% (ANOVA mit Dunnett-Posttest, p < 0,01), was auf eine Exposition der Testorganismen gegenüber östrogenartig wirkenden Substanzen im Testsediment hindeutet. Dagegen wurde im Kläranlagenablauf (C Wasser) eine deutliche reproduktionstoxische Wirkung ermittelt (ANOVA mit Dunnett-Posttest, p < 0,01). Die Zahl der beschalten und unbeschalten Embryonen sowie die Gesamtembryonenzahl lagen deutlich unter dem Kontrollniveau. Letztere erreichte in der Summe lediglich 40% der Gesamtembryonenzahl der Kontrolle. In der eingesetzten Positivkontrolle wurde keine signifikant erhöhte Embryonenzahl ermittelt. Stattdessen war im Vergleich zur Kontrolle ein signifikanter reproduktionstoxischer Effekt feststellbar (ANOVA mit Dunnett-Posttest, p < 0,01 für Embryonen mit Schale; p < 0,05 für Gesamtembryonen und p > 0,05 für Embryonen ohne Schale). Dieser Befund ist ungewöhnlich und möglicherweise auf eine Verunreinigung der Positivkontrollsubstanz zurückzuführen. In Absprache mit der Projektleitung wurde daher festgelegt, die C-Proben zusammen mit der Testung der Proben aus den folgenden beiden Sammelkampagnen erneut zu testen und für die Positivkontrolle neue Reinsubstanz zu beschaffen. Vergleichende Testung der Proben vom Juni, August, Oktober 2010 (PN C, D, E und Mai, Juli, September, Oktober 2011 (PN F, G, H, J) Mortalität Mit 42,5% lag die Mortalität in der Negativkontrolle in der Sammelkampagne 2010 deutlich über dem Validitätskriterium von 20% (Abb a), ohne dass eine Ursache identifiziert werden konnte. Die Mortalität in den Umweltproben schwankte zwischen 12,5% (Sediment C0) und 65% (Abwasser aus dem Oktober). Gegenüber der Negativkontrolle waren lediglich für die Proben C0 und D4 mit ihrer geringeren Mortalität von 12,5 bzw. 15,3% die Unterschiede statistisch signifikant. Unabhängig davon bleibt festzuhalten, dass in den beiden Abwasserproben (D Wasser und E Wasser) die höchsten Mortalitäten von 52,5 bzw. 65% zu verzeichnen waren, ohne dass sich diese statistisch von der Mortalität in der Negativkontrolle unterschieden (Fishers Exact Test; p > 0,05). In der Sammelkampagne 2011 hingegen lag die Mortalität in allen untersuchten Proben deutlich unter dem Validitätskriterium von 20% (Abb b). Die Mortalität in den Umweltproben schwankte zwischen 0% (Sedimente F vom Mai 2011) und maximal 10% (Proben vom September 2011). Gegenüber den Kontrollgruppen traten keine statistisch signifikanten Unterschiede auf. 88

89 K PK F KA F3 F4 G KA G3 G4 H KA H3 H4 J KA J3 J4 Mortalität [%; Mw ± SEM] K PK C0 C3 C4 D KA D3 D4 E KA E3 E4 Mortalität [%; Mw ± SEM] Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Embryonenzahl Da die Embryonenzahl in der Bruttasche von Potamopyrgus antipodarum positiv mit der Schalenhöhe korreliert ist, wurden zu Versuchsbeginn Tiere einer definierten Größenklasse (3,5 bis 4,3 mm Schalenhöhe) zufällig auf alle Testgefäße verteilt. Am Versuchsende waren die minimalen Unterschiede in der Schalenhöhe zwischen den Behandlungsgruppen und der Negativkontrolle in beiden Sammelkampagnen statistisch nicht signifikant (ANOVA, p > 0,05). Das geringfügig stärkere Wachstum der Schnecken in den Sedimentproben der ersten Sammelkampagne im Jahr 2010 mit maximal 0,174 mm (D4 vs. K) ist wahrscheinlich die Folge der besseren Nahrungsversorgung, da die Versuchstiere zusätzlich zum TetraPhyll auf Detritus im natürlichen Sediment als Nahrungsquelle zurückgreifen konnten. Dieses Phänomen wird im Labor der Abt. Aquatische Ökotoxikologie der Universität Frankfurt/Main häufiger bei der Testung von Freilandsedimenten mit fehlender oder geringer akuttoxischer Wirkung beobachtet. Die geringfügig größere Schalenhöhe der Tiere in den getesteten Umweltproben im a signifikant vs. K Fisher's exact test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe b keine signifikanten Unterschiede zur Kontrolle Fisher's exact test ( p > 0,05) Behandlungsgruppe bzw. Probe Abb : Potamopyrgus antipodarum. Mortalität in der Negativ- (K) und Positivkontrolle (PK) sowie in Testsedimenten und Abwasserproben aus den Sammelkampagnen im Juni ("C"), August ("D"), Oktober ("E") 2010 (a) und aus den Sammelkampagnen im Mai ("F"), Juli ("G") September ("H") und Oktober ("J") 2011 (b). Die Sterne geben statistisch signifikante Unterschieden zur Negativkontrolle wieder (Fishers Exact Test: * p < 0,05; ** p < 0,01). 89

90 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Vergleich zur Negativkontrolle hat einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Embryonenzahl in der Bruttasche. Die in Schulte-Oehlmann (1997) wiedergegebene Korrelation würde bei einer Zunahme der Schalenhöhe von 0,174 mm, wie sie als Maximalwert für das Sediment D4 ermittelt wurde, zu einer durchschnittlichen Zunahme der Gesamtembryonenzahl von 0,24 pro Weibchen führen. Die durchschnittliche Embryonenzahl in der Bruttasche der Weibchen in den Negativkontrollen beider Sammelkampagnen (6,97 gesamt, 2,17 ohne und 4,81 mit Schale in 2010 und 9,1 gesamt, 3,7 ohne und 5,4 mit Schale in 2011) entspricht den Erwartungen im frühen Winter, wenn sich die saisonale Phase der geringeren Fortpflanzungsleistung dem Ende zuneigt (Abb ). Dagegen zeigte sich in der Positivkontrolle der Sammelkampagne in 2010 (Abb a, 5a, 6a), die gegenüber einer Nominalkonzentration von 30 µg EE2/kg exponiert wurde, eine signifikante Zunahme der Gesamtembryonenzahl von 76,6%. Die durchschnittliche Anzahl der Embryonen mit Schale stieg im Vergleich zur Kontrolle um 64,7% an. Die Zahl der Embryonen ohne Schale erhöhte sich in der PK sogar um 103%, wobei dieser Unterschied aufgrund der Standardabweichungen jedoch nicht signifikant ist (Abb a, 5a, 6a). Für die Positivkontrolle der Sammelkampagnen in 2011 (Abb b, 5b, 6b) sind die Resultate vergleichbar. Auch hier war für die Versuchsgruppe, die gegenüber 30 µg EE2/kg exponiert war, eine signifikante Zunahme der Gesamtembryonenzahl von 85,2% zu verzeichnen. Die durchschnittliche Anzahl der Embryonen mit Schale stieg im Vergleich zur Kontrolle um 69,1% an. Die Zahl der Embryonen ohne Schale erhöhte sich in der PK um 110% (Abb b, 5b, 6b). Die prozentuale Zunahme an Nachkommen in den Positivkontrollen war im Vergleich zu früheren Versuchsreihen etwas geringer. Die experimentellen Daten aus beiden Sammelkampagnen (2010 und 2011) zeigen jedoch eindeutig, dass die eingesetzten Testorganismen gegenüber einer östrogenartig wirkenden Substanz sensitiv sind. Die Wirkungen endokriner Substanzen auf P. antipodarum wurden kürzlich durch Duft et al. (2007) in einem Übersichtsartikel zusammengefasst. Eine Exposition gegenüber Xenoandrogenen (z.b. Triphenylzinn- und Tributylzinnverbindungen, Methyltestosteron) verursacht bei der Zwergdeckelschnecke einen Rückgang der Embryonenzahl in der Bruttasche. In Experimenten mit einer Expositionsdauer von bis zu 56 Tagen erwies sich die Zahl der Embryonen ohne Schale als der sensitivste Endpunkt. Dagegen verursachte eine Exposition gegenüber Xenoöstrogenen (z.b. Bisphenol A BPA, Octylphenol, Nonylphenol, EE2) einen Anstieg der Embryonenzahl in der Bruttasche von P. antipodarum. Für BPA lag die EC 50 für die Stimulation der Fortpflanzungsleistung in einem Sedimenttest nach vier Wochen bei 5,67 µg/kg und die EC 10 bei 0,19 µg/kg (Duft et al. 2003b). Bei einer Exposition gegenüber BPA und EE2 über das Umgebungswasser konnte ebenfalls eine Stimulation der 90

91 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Embryonenproduktion beobachtet werden, wobei signifikante Effekte bei einer Konzentration von 5 µg BPA/L bzw. 25 ng EE2/L auftraten (NOEC: 1 µg BPA/L bzw. 5 ng EE2/L). Die Konzentrations-Wirkungsbeziehung für beide Substanzen war jedoch biphasisch mit einem invertiert U-förmigen Verlauf (Schulte-Oehlmann et al. 2001; Jobling et al. 2004). Dieser Befund ist für die Interpretation der Ergebnisse bei P. antipodarum in Tests mit endokrin wirksamen Umweltchemikalien und Umweltproben insofern relevant, da bei sehr hohen Östrogenaktivitäten die Stimulation der Fortpflanzungsleistung wieder rückläufig ist und sogar auf das Niveau der Negativkontrolle zurückfallen kann. Entsprechende Beobachtungen konnten bereits in mehreren Studien mit Schnecken gemacht werden (Oehlmann et al. 2000; Schulte-Oehlmann et al. 2001; Duft et al. 2003b; Jobling et al. 2004; Weltje et al. 2005, Schmitt et al. 2008b). Sie werden unter anderem mit dem dominierenden östrogenartigen Effekt und einer resultierenden erhöhten Reproduktionsleistung bei niedrigen Konzentrationen bzw. einem Rückgang der Embryonenproduktion aufgrund der generellen Toxizität bei höheren Konzentrationen der Xenoöstrogene erklärt. Nach einer 4-wöchigen Exposition der Zwergdeckelschnecken gegenüber den Testsedimenten war die Gesamtembryonenzahl (Abb ) in allen Sedimenten (C, D, E, F, G, H und J) statistisch hochsignifikant (p < 0,01) bzw. signifikant (p < 0,05: Sediment E4) gegenüber der Negativkontrolle erhöht. Die beobachtete Zunahme an Nachkommen lag für die Proben der ersten Sammelkampagnen in 2010 sogar deutlich über dem Niveau der Positivkontrolle. Nur die im Mai 2011 entnommene Ablaufprobe der KA führte zu signifikant höherer Gesamtembryonenzahl. Signifikant mehr Embryonen ohne Schale (Abb ) bildeten ebenfalls alle Tiere, die 2010 gegenüber den Sedimenten C, D, und E (p < 0,01; Ausnahme Sediment E4: p < 0,05) und 2011 gegenüber den Abwasser- und Sedimentproben F und Sedimentproben H sowie J4 (p < 0,01) exponiert waren. Eine im Vergleich zu Negativkontrolle signifikant geringere Anzahl früher Embryonalstadien ohne Schale trat in den Sedimentproben G3 (p < 0,05) und den Abwasserproben HKA und JKA (p < 0,01) auf. Keine signifikanten Unterschiede zur Negativkontrolle bezüglich dieses Parameters waren in den Proben GKA, G4 und J3 vorhanden. Verglichen mit der Negativkontrolle war bei allen Tieren, die gegenüber Sedimentproben exponiert waren, eine signifikant höhere Anzahl (p < 0,01; Ausnahme Sediment E4: p < 0,05) an in ihrer Entwicklung differenzierteren Embryonen mit Schale (Abb ) zu verzeichnen. Auf die Abwasserprobe JKA traf dies ebenfalls zu (Abb b). Die Zunahme für die Probe C0 war jedoch nicht signifikant (Abb a). Die Befunde sprechen für eine hohe östrogene Aktivität aller Testsedimente und sind zudem zwischen den Probenahmekampagnen für die Sedimente 3 und 4 replizierbar; beide Proben zeigen eine vergleichbare Aktivität mit einer Zunahme der Gesamtembryonenzahl gegenüber K um 91

92 K PK F KA F3 F4 G KA G3 G4 H KA H3 H4 J KA J3 J4 Embryonen gesamt [Mw ± SD] K PK C0 C3 C4 D KA D3 D4 E KA E3 E4 Embryonen gesamt [Mw ± SD] Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) 89% (E4) bis 229% (C4) für die Sammelkampagnen in 2010 und 35% (G3) bis 110% (H3) in Die Unterschiede zwischen den Freilandsedimenten sind nicht statistisch signifikant. Bei derart hohen Östrogenaktivitäten ist der bereits diskutierte biphasische Verlauf der Konzentrations-Wirkungsbeziehung zu berücksichtigen, der zu einer geringeren Stimulation der Embryonenproduktion bei sehr hohen Östrogenaktivitäten führen kann. In früheren Studien wurde bereits darauf hingewiesen, dass eine Zunahme der Reproduktionsleistung a signifikant vs. K ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe b 35 signifikant vs. K 30 ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe Abb : Potamopyrgus antipodarum. Gesamtembryonenzahl in der Negativ- (K) und Positivkontrolle (PK) sowie in Testsedimenten und Abwasserproben aus den Sammelkampagnen im Juni ("C"), August ("D") und Oktober ("E") 2010 (a) und aus den Sammelkampagnen im Mai ("F"), Juli ("G") September ("H") und Oktober ("J") 2011 (b). Die Sterne geben statistisch signifikante Unterschieden zur Negativkontrolle wieder (einseitige Varianzanalyse mit Dunnett-Posttest: * p < 0,05; ** p < 0,01). bei Vorderkiemerschnecken als adverser Effekt auch für die Population zu werten ist (Duft et al. 2003b; Weltje et al. 2005; Schmitt et al. 2008b). Eine östrogene Exposition außerhalb der Hauptfortpflanzungsperiode kann die Reproduktion in einem Umfang verstärken, dass 92

93 K PK F KA F3 F4 G KA G3 G4 H KA H3 H4 J KA Embryonen ohne Schale [Mw ± SD] J3 J4 K PK C0 C3 C4 D KA D3 D4 E KA Embryonen ohne Schale [Mw ± SD] E3 E4 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Eileitermissbildungen auftreten können, wie von Oehlmann et al. (2000) für Marisa cornuarietis gezeigt wurde. Außerdem belastet die Stimulation der Reproduktion außerhalb der Fortpflanzungsperiode die Energiereserven des betroffenen Organismus, so dass nicht nur das somatische Wachstum reduziert sein kann, sondern auch während der eigentlichen Fortpflanzungsperiode die Reproduktionsleistung sinkt (Oehlmann et al. 2006). Die außerhalb der eigentlichen Fortpflanzungsperiode produzierten Nachkommen treffen zudem in der Regel auf suboptimale Bedingungen (z.b. hinsichtlich Temperatur und Nahrungsangebot) (Andersen et al. 1999; Giesy et al. 2000). a signifikant vs. K ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe b 20 signifikant vs. K ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe Abb : Potamopyrgus antipodarum. Zahl der Embryonen ohne Schale in der Negativ- (K) und Positivkontrolle (PK) sowie in Testsedimenten und Abwasserproben aus den Sammelkampagnen im Juni ("C"), August ("D") und Oktober ("E") 2010 (a) und aus den Sammelkampagnen im Mai ("F"), Juli ("G") September ("H") und Oktober ("J") 2011 (b). Die Sterne geben statistisch signifikante Unterschieden zur Negativkontrolle wieder (einseitige Varianzanalyse mit Dunnett-Posttest: * p < 0,05; ** p < 0,01). 93

94 K PK F KA F3 F4 G KA G3 G4 H KA H3 H4 J KA J3 J4 Embryonen mit Schale [Mw ± SD] K PK C0 C3 C4 D KA D3 D4 E KA E3 E4 Embryonen mit Schale [Mw ± SD] Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Mit Ausnahme der Probe FKA konnte für keine Versuchsgruppe, die gegenüber Abwasserproben (DKA, EKA, GKA, HKA und JKA) exponiert war, ein statistisch signifikanter Unterschied zur Negativkontrolle in der Zahl der Gesamtembryonenzahl beobachtet werden. Diese lag, ausgenommen für die Probe FKA, in allen Fällen auf dem Niveau der Negativkontrolle. Dieser Befund darf jedoch nicht als Beleg für eine fehlende östrogenartige Wirkung der Abwässer interpretiert werden. In komplexen Umweltproben ist das Auftreten reproduktionstoxischer Substanzen, die zu einem Rückgang der Embryonenproduktion und gleichzeitiger Maskierung östrogenartiger Wirkungen führen, nicht auszuschließen. Auch ist nicht auszuschließen, dass bei sehr hohen Östrogenaktivitäten der Abwässer aufgrund des bereits diskutierten biphasischen Verlaufs der Konzentrations-Wirkungsbeziehung die a 18 signifikant vs. K 15 ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe b 18 signifikant vs. K 15 ANOVA mit Dunnett-Test ( p < 0,05-0,01) Behandlungsgruppe bzw. Probe Abb : Potamopyrgus antipodarum. Zahl der Embryonen mit Schale in der Negativ- (K) und Positivkontrolle (PK) sowie in Testsedimenten und Abwasserproben aus den Sammelkampagnen im Juni ("C"), August ("D") und Oktober ("E") 2010 (a) und aus den Sammelkampagnen im Mai ("F"), Juli ("G") September ("H") und Oktober ("J") Die Sterne geben statistisch signifikante Unterschieden zur Negativkontrolle wieder (einseitige Varianzanalyse mit Dunnett-Posttest: * p < 0,05; ** p < 0,01). 94

95 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Embryonenzahlen wieder auf das Kontrollniveau zurückgehen. Diese Frage kann nur durch eine parallele Bestimmung der Östrogenaktivität mit robusten In-vitro-Systemen (z.b. yeast estrogen screen) beantwortet werden. Tiere, die in Abwasserprobe FKA gehältert wurden, zeigten hingegen eine signifikant höhere Reproduktionstätigkeit (p < 0,05) als Tiere der Negativkontrolle, die jedoch 30% unter dem Niveau der Positivkontrolle lag. Während bei der Testung der Abwasser- und Sedimentproben in 2010 in der Regel Embryonen mit und ohne Schale gleichermaßen zur Erhöhung der Gesamtembryonenzahlen beitrugen (Tab ), waren diese Werte für die in 2011 getesteten Proben z.t. sehr unterschiedlich (Tab ). Tab : Verhältnis beschalter und unbeschalter Embryonen in den Proben der Sammelkampagnen in Probe K PK CO C3 C4 DKA D3 D4 EKA E3 E4 Quotient 2,22 1,83 0,76 0,8 0,84 0,48 0,83 1,3 1,04 1,43 1,14 Tab Verhältnis beschalter und unbeschalter Embryonen in den Proben der Sammelkampagnen in Probe K PK FKA F3 F4 GKA G3 G4 HKA H3 H4 JKA J3 J4 Quotient 1,44 1,16 0,53 1,35 1,06 1,23 4,8 2,37 3,59 1,85 1,5 6,1 2,4 1,8 So ging die signifikante Erhöhung der Gesamtembryonenzahl der Sedimentproben G und J3 ausschließlich auf erhöhte Werte für die in ihrer Entwicklung differenzierteren Embryonen mit Schale zurück. Ein ähnlicher Effekt trat in den Abwasserproben HKA und JKA auf. So war z.b. der Anteil an Embryonen mit Schale in Probe JKA gegenüber der Negativkontrolle um 64% erhöht, der Anteil an Embryonen ohne Schale hingegen um 61% niedriger als in der Negativkontrolle. Eine Verschiebung des Quotienten von beschalten und unbeschalten Embryonen auf Werte deutlich <1 deutet auf viele in ihrer Entwicklung undifferenzierte Embryonalstadien hin. Ausgeprägte Abweichungen von der Negativkontrolle könnten auch Hinweise auf Substanzen mit hemmender Wirkung auf die Embryonalentwicklung geben. Mit Ausnahme der Proben DKA und FKA erscheinen die untersuchten Proben unauffällig. In keiner untersuchten Probe wurde jedoch eine erhöhte Lysis von Embryonalstadien oder eine Missbildung von Embryonen beobachtet. 95

96 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Zusammenfassung Die Testung der Proben mit der Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum erfolgte gemäß der laboreigenen Standardarbeitsanweisung, die Grundlage einer OECD- Richtlinienentwicklung ist. Die Testsedimente und Abwasserproben wurden über einen Zeitraum von 28 Tagen in zwei Replikaten gegenüber je 20 Schnecken exponiert. Zudem wurde eine Kunstsediment-basierte Negativkontrolle (K) und eine Positivkontrolle (PK mit 30 µg Ethinylöstradiol/kg Trockenmasse) mit zwei (K) bzw. vier Replikaten (PK) und 20 Tieren pro Replikat eingesetzt. Für alle Testsedimente wurden eine starke Stimulation der Embryonenbildung und damit Hinweise auf ein östrogenes Wirkpotential beobachtet. Die Steigerung der Reproduktionsleistung war für die Gesamtembryonenzahl und die Zahl der Embryonen ohne Schale deutlich höher als in der PK. Die Unterschiede zwischen den Freilandsedimenten waren nicht signifikant. Diese Befunde sprechen für eine östrogene Aktivität der Freilandsedimente, die 30 µg Östradioläquivalente/kg Trockenmasse übersteigt. Für die Abwasserproben wurden, ausgenommen für Probe FKA (Gesamtembryonenzahl und Embryonen ohne Schale) sowie JKA (Embryonen mit schale) keine statistisch signifikanten Unterschiede zur Negativkontrolle gefunden. Dieser Befund darf jedoch nicht als Beleg für eine fehlende östrogenartige Wirkung der Abwässer interpretiert werden. Vielmehr kann diese durch das Auftreten toxischer Substanzen maskiert werden; auch ist nicht auszuschließen, dass bei sehr hohen Östrogenaktivitäten der Abwässer aufgrund des biphasischen Verlaufs der Konzentrations-Wirkungsbeziehung die Embryonenzahlen wieder auf das Kontrollniveau zurückgehen. Literaturverzeichnis Andersen, H.R., Halling-Sorensen, B. & Kusk, K.O. (1999): A parameter for detecting estrogenic exposure in the copepod Acartia tonsa. Ecotox. Environ. Saf. 44: Calmano, W. (2001): Untersuchung und Bewertung von Sedimenten Ökotoxikologische und chemische Testmethoden. 551 S., Springer, Berlin. Colborn, T., vom Saal, F.S. & Soto, A.M. (1993): Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans. Environ. Health Perspect. 101: Cope, N.J. & Winterbourn, M.J. (2004): Competitive interactions between two successful molluscan invaders of freshwater: An experimental study. Aquatic Ecology 38: Chapman, P.M. & Hollert, H. (2006): Should the sediment quality triad become a tetrad, a pentad, or possibly even a hexad? J. Soil Sedim. 6: 4-8. defur, P.L., Crane, M., Ingersoll, C.G. & Tattersfield, L. (Hrsg.) (1999): Endocrine disruption in invertebrates: endocrinology, testing and assessment. SETAC Press, Pensacola. Duft, M., Schulte-Oehlmann U., Tillmann, M., Markert, B. & Oehlmann, J. (2003a): Toxicity of triphenyltin and tributyltin to the freshwater mudsnail Potamopyrgus antipodarum in a new sediment biotest. Environ. Toxicol. Chem. 22: Duft, M., Schulte-Oehlmann, U., Weltje, L., Tillmann, M. & Oehlmann, J. (2003b): Stimulated embryo production as a parameter of estrogenic exposure via sediments in the freshwater mudsnail Potamopyrgus antipodarum. Aquat. Toxicol. 64:

97 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) Duft, M., Schmitt, C., Bachmann, J., Brandelik, C., Schulte-Oehlmann, U. & Oehlmann, J. (2007): Prosobranch snails as test organisms for the assessment of endocrine active chemicals - an overview and a guideline proposal for a reproduction test with the freshwater mudsnail Potamopyrgus antipodarum. Ecotoxicology 16: Förstner, U., Ackermann, F., Albert, J., Calmano, W., Frimmel, F.H., Kornatzki, K.H., Roßkneckt, H., Schleichert, U. & Tent, L. (1987): Qualitätskriterien für Gewässersedimente - Allgemeine Problematik und internationaler Standard der Diskussion. Z. Wasser Abwass.-Forsch. 20, Fretter, V. & Graham, A. (1994). British prosobranch molluscs. Their functional anatomy and ecology. Ray Society, London. Galluba, S. & Oehlmann, J. (2012). Widespread endocrine activity in river sediments in Hesse, Germany, assessed by a combination of in vitro and in vivo bioassays. J. Soils Sedim. 12: Giesy, J.P., Pierens, S.L., Snyder, E.M., Miles-Richardson, S., Kramer, V.J., Snyder, S.A., Nichols, K.M. & Villeneuve, D.A. (2000): Effects of 4-nonylphenol on fecundity and biomarkers of estrogenicity in fathead minnows (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 19: Ingersoll, C.G., Ankley, G.T., Benoit, D.A., Brunson, E.L., Burton, G.A., Dwyer, F.J., Hoke, R.A., Landrum, P.F., Norberg-King, T.J. & Winger, P.V. (1995): Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, Jacobsen, R. & Forbes, V.E. (1997): Clonal variation in life-history traits and feeding rates in the gastropod, Potamopyrgus antipodarum: Performance across a salinity gradient. Functional Ecology 11: Jobling, S., Casey, D., Rodgers-Gray, T., Oehlmann, J., Schulte-Oehlmann, U., Pawlowski, S., Braunbeck, T., Turner, A.P. & Tyler, C.R. (2004): Comparative responses of molluscs and fish to environmental estrogens and an estrogenic effluent. Aquat. Toxicol. 66: Kinzelbach, R. (1995): Neozoans in European waters exemplifying the worldwide process of invasion and species mixing. Experientia 51: Long, E.R. & Chapman, P.M. (1985): A sediment quality triad: measures of sediment contamination, toxicity and infaunal community composition in Pudget Sound. Mar. Pollut. Bull. 16, Oehlmann, J. & Schulte-Oehlmann, U. (2003): Endocrine disruption in invertebrates. Pure Appl. Chem. 75, Oehlmann, J., Schulte-Oehlmann, U., Tillmann, M. & Markert, B. (2000): Effects of endocrine disruptors on prosobranch snails (Mollusca: Gastropoda) in the laboratory. Part I: Bisphenol A and octylphenol as xeno-estrogens. Ecotoxicology 9: Oehlmann, J., Schulte-Oehlmann, U., Bachmann, J., Oetken, M., Lutz, I., Kloas, W. & Ternes, T.A. (2006): Bisphenol A induces superfeminization in the ramshorn snail Marisa cornuarietis (Gastropoda: Prosobranchia) at environmentally relevant concentrations. Environ. Health Persp. 114 (Suppl. 1): Oehlmann, J., Di Benedetto, P., Tillmann, M., Duft, M., Oetken, M. & Schulte-Oehlmann, U. (2007): Endocrine disruption in prosobranch molluscs: Evidence and ecological relevance. Ecotoxicology 16, Oetken, M., Bachmann, J., Schulte-Oehlmann, U. & Oehlmann, J. (2004): Evidence for endocrine disruption in invertebrates. Int. Rev. Cytol. 236, Ponder, W.F. (1988): Potamopyrgus antipodarum a molluscan coloniser of Europe and Australia. Journal of Molluscan Studies 54: Prosi, F. & Müller, G. (1987): Bedeutung der Sedimente als Schwermetallfalle; Bioverfügbarkeit und Mobilität von Metallen in Sedimenten in Bezug auf den Biotransfer in limnischen Organismen. In: Lillelund, K., De Haar, U., Elster, H.J., Karbe, L., Schwoerbel, I., Simons, W. (Hrsg.): Bioakkumulation in Nahrungsketten - Zur Problematik der Akkumulation von Umweltchemikalien in aquatischen Systemen. VCH, Weinheim. S Schmitt, C., Duft, M., Brandelik, C., Schulte-Oehlmann, U. & Oehlmann, J. (2008a): SOP for testing of chemicals: Reproduction test with the prosobranch snail Potamopyrgus antipodarum for testing endocrine active chemicals. Part III: Reproduction test using sediment exposure. Goethe University Frankfurt am Main. Department Aquatic Ecotoxicology. Schmitt, C., Oetken, M., Dittberner, O., Wagner, M. & Oehlmann, J. (2008b): Endocrine modulation and toxic effects of two commonly used UV screens on the aquatic invertebrates Potamopyrgus antipodarum and Lumbriculus variegatus. Environ. Pollut. 152: Schulte-Oehlmann, U (1997): Fortpflanzungsstörungen bei Süß- und Brackwasserschnecken Einfluss der Umweltchemikalie Tributylzinn. Berlin, Wissenschaft und Technik Verlag. 208 Seiten. Schulte-Oehlmann, U., Oehlmann, J., Bauer, B., Fioroni, P., Oetken, M., Heim, M., & B. Markert (1999): TBT effects monitoring in freshwater ecosystems: Reduced fertility of limnic prosobranch 97

98 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Reproduktions-Tests mit Potamopyrgus antipodarum) snails. In: Oehlmann, J. & B. Markert (eds.): Ecotoxicology ecosystem approaches and methods. Ecomed, Landsberg: [in German]. Schulte-Oehlmann, U., Tillmann, M., Casey, D., Duft, M., Markert, B. & Oehlmann, J. (2001): Xenoestrogenic effects of bisphenol A in prosobranchs (Mollusca: Gastropoda: Prosobranchia). UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 13: [in German]. Stalter, D., Magdeburg, A. & Oehlmann, J. (2010): Comparative toxicity assessment of ozone and activated carbon treated sewage effluents using an in vivo test battery. Water Res. 44: Wallace, C. (1979): Notes on the occurrence of males in populations of Potamopyrgus jenkinsi. J. Moll. Stud. 45: Weltje, L., Vom Saal, F.S. & Oehlmann, J. (2005): Reproductive stimulation by low doses of xenoestrogens contrasts with the view of hormesis as an adaptive response. Human Exp. Toxicol. 2 Kurzzusammenfassung: Reproduktionstests mit der Zwergdeckelschnecke Starke Stimulation der Embryonenbildung (östrogene Wirkung) durch alle Testsedimente, auch Sedimente von oberhalb KA und aus Argen Verstärkte Embryonenbildung im Vergleich zum Blindwert durch Exposition gegenüber den im Mai und Oktober 2011 gesammelten Ablaufproben der KA Langwiese Entwicklungstoxische Potentiale in den Ablaufproben wahrscheinlich Bearbeitung des Teilprojektes: Agnes Sieratowicz, Simone Ziebart, Katrin Bender, Prof. Dr. Jörg Oehlmann Goethe-Universität Frankfurt am Main, Abteilung Aquatische Ökotoxikologie, Siesmayerstraße 70, Frankfurt am Main; , oehlmann@bio.unifrankfurt.de 98

99 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Vitellogenin-Induktion bei Forellen) Vitellogenin-Nachweise an in den Bypass-Systemen exponierten Bachforellen Hintergrund Endokrine Disruptoren können mit der Produktion, dem Metabolismus, der Bindung oder der Elimination von körpereigenen Hormonen interferieren und so die Homöostase bzw. hormonell gesteuerte Regulationsmechanismen in exponierten Organismen stören (Kavlok et al. 1996). Ihre Wirkungen im Tier können sich zu unterschiedlichen Zeiten (während, kurz oder lange nach der Exposition) manifestieren (Colborn et al. 1993). Besondere Aufmerksamkeit wurde in der Vergangenheit endokrin aktiven Subtanzen gewidmet, die östrogenartige Wirkung zeigen. Zu diesen Chemikalien gehören neben Industriechemikalien, wie z.b. Bisphenol A auch Kontrazeptiva, wie sie in der sog. Antibabypille eingesetzt werden. Solche Chemikalien können bereits im Konzentrationsbereichen von ng/l wirken. Die Präsenz östrogen wirkender Chemikalien in Umweltkompartimenten kann durch Messungen des Eidottervorläuferproteins Vitellogenin (Vtg), das normalerweise nur bei weiblichen Tieren während der Eireifung zu finden ist, in juvenilen oder männlichen Fischen gezeigt werden (Burki et al. 2006; Vethaak et al 2005). Der Nachweis erfolgt entweder auf Proteinebene mittels ELISA oder auf Ebene der mrna durch RT-PCR-Analysen. Da Vtg- Messungen Rückschlüsse auf die Belastung von Umweltkompartimenten mit östrogenartig wirkenden Chemikalien erlauben, ist dieser Biomarker als Expositionsmarker mittlerweile von der OECD akzeptiert und standardisiert (OECD 2004b) Methodik Der Nachweis von Vitellogenin als Biomarker für die Präsenz östrogenartig wirkender Chemikalien kann in Fischen entweder im Blut adulter Männchen (Bierregaard et al., 2008) oder in Jungfischen erfolgen (Stalter et al., 2010). In beiden wird unter unbelasteten Voraussetzungen kein Vtg gebildet, so dass der Nachweis des Eidotterproteins in diesen Proben auf die Präsenz von Östrogenen in der Umwelt rückschließen lässt. Der Nachweis des Vtg in Blut und Gewebehomogenaten erfolgte mit einem Testkit (Biosense, Prod. No.:V ) basierend auf einem ELISA. Das Testkit ist für Regenbogenforellen validiert, so dass die Kreuzreaktivität (Bindungsstärke) der Antikörper mit Vtg der Bachforelle zunächst im Laborversuch überprüft werden musste. Hierfür wurden 99

100 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Vitellogenin-Induktion bei Forellen) 11 Monate alte Bach- und 6 Monate alte Regenbogenforellen für 16 Tage im Labor gegenüber 40ng/l EE 2 exponiert. Als Blindkontrolle diente Leitungswasser. Zum Nachweis von Vtg im Blut männlicher Bachforellen wurden von in den Bypass- Systemen an Schussen und Argen sowie im Labor (Negativ- und Positivkontrolle mit EE 2 ) gehaltenen Fischen vor Ort im Bereich der Seitenlinie Blutproben entnommen. Diese wurden sofort in mit Heparin beschichtete Reaktionsgefäße mit Proteasehemmer überführt und zentrifugiert (3500 rpm). Anschließend wurde das Blutplasma (Überstand) in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Im Jahr 2012 wurden zwei Gruppen juveniler Bachforellen, die in den beiden Bypass- Systemen an der Schussen und der Argen vom Ei auf exponiert waren, angelehnt an die Methodik von Stalter et al. (2010) auf ihren Vtg-Gehalt hin untersucht. Zum Zeitpunkt der Probenahme waren die Tiere für 99 Tage (PN12) bzw. 140 Tage (PN14) gegenüber Flusswasser exponiert. Da die Tiere zu den beiden Probenahmezeitpunkten bereits relativ groß waren, konnten nicht, wie bei Stalter et al.(2010) Ganzkörperhomogenate hergestellt werden. Es musste deshalb überprüft werden, welche Gewebe am besten für die Vtg- Analyse geeignet sind. Die Tiere wurden hierfür aus den Expositionsbecken entnommen, getötet und entweder wurde der mittlere Teil des Körpers (Schnitt nach der Kieme und vor der Afterflosse) bei PN12 oder die herauspräparierte Leber bei PN14 unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren. Von den Geweben wurden Homogenate hergestellt, die für die Vtg-Analyse verwendet wurden. Weitere Details zu den jeweiligen Expositionen sind in Kap.3.3. beschrieben. Ergebnisse und Diskussion Vergleich Bach- und Regenbogenforellen Die 11 bzw. 6 Monate alten Bach- und Regenbogenforellen (Leberhomogenat), die beide 16d gegenüber 40ng/l Ethinylestradiol exponiert waren, unterschieden sich signifikant in ihrem Vtg-Level (Abb ). In den Regenbogenforellen konnten Vtg-Konzentrationen von bis zu 300 µg/ml gemessen werden, die Werte für die Bachforellen lagen um etwa den Faktor 100 niedriger. Dies ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf die geringere Kreuzreaktivität des Antikörpers mit dem Vtg der Bachforelle zurückzuführen, da Bjerregaard et al. (2008) sehr ähnliche Sensitivitäten von Bach- bzw. Regenbogenforellen für EE 2 (LOEC Bachforelle 5,1 ng/l und LOEC Regenbogenforelle zwischen 1 und 7,6 ng/l) beschreiben, wenn artspezifische Antikörper zum Einsatz kommen. Bjerregaard (2008) benutzen für den Vtg- Nachweis bei Bachforellen einen polyklonalen gegen Bachforellenvitellogenin gerichteten 100

101 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Vitellogenin-Induktion bei Forellen) Antikörper. Die im vorliegenden Fall in Bachforellen gemessenen Werte dürfen aufgrund dessen nicht als Absolutwerte für den realen Vtg-Gehalt betrachtet werden, sondern liegen real mit großer Wahrscheinlichkeit um den Faktor 100 höher als die eigentlichen Messwerte. Abb : Ergebnisse der Laborversuche zur Induktion von Vtg durch EE2 in juvenilen Bach- und Regenbogenforellen. Im Blutserum der männlichen Bachforellen aus dem Jahr 2011 konnte nach einer Expositionszeit von 43 Tagen kein Vtg nachgewiesen werden. Mit großer Wahrscheinlichkeit war die Expositionszeit zu kurz, so dass, zusätzlich noch durch die geringere Kreuzreaktivität des Antikörpers bedingt, kein positiver Nachweis des Vtg möglich war. Hinzu kamen Schwierigkeiten bei der Hälterung der adulten männlichen Fische, die starkes Revierverhalten zeigten und sich gegenseitig Verletzungen zufügten. Aus diesem Grunde wurde 2011 versucht, die Methodik von Stalter et al. (2010) mit juvenilen Forellen anzuwenden. Die höchsten Vtg-Level zeigten 99 Tage alten Fische, die im Bypass Gunzenhaus an der Schussen exponiert waren, und von denen der mittlere Teil des Körpers untersucht wurde (Abb ). Zu diesem Zeitpunkt (PN12) war der Vtg-Gehalt derjenigen Tiere, die im Bypass an der Argen exponiert waren, deutlich geringer. Zum Probenahmezeitpunkt 14 waren keine Unterschiede zwischen den Vtg-Werten bei Forellen aus den beiden Bypässen nachzuweisen. Zudem war der Wert bei den an der Schussen exponierten Fischen deutlich geringer als bei der PN 12. Mögliche Gründe hierfür können sein: (1) Unterschiedliche Expositionssituation zum Probenahmezeitpunkt 14 aufgrund hoher Variabilität der Einträge 101

102 Vtg-Konzentration [ng/ml] Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Vitellogenin-Induktion bei Forellen) östrogenartig wirkender Substanzen, oder (2) bessere Eignung der mittleren Körperhälfte von juvenilen Fischen als der herauspräparierten Leber als Gewebe zum Nachweis von Vtg bei juvenilen Fischen. Aufgrund des begrenzten einzigen Zeitfensters im Jahr, in welchem Eier der Bachforelle zu erhalten sind, konnten leider bislang keine Versuche wiederholt werden, so dass diese Aufgabenstellung erst im Winter 2012 erneut experimentell bearbeitet werden kann Labor neg. Argen Schussen Labor neg. Argen Schussen PN 12 PN 14 Abb : Vtg-Konzentrationen. PN12/PN14: Probenahme am / PN12: Labor neg. n=6; Argen n=10; Schussen n=10; PN14:Labor neg. n=5; Argen n=8; Schussen n=8; Literatur Bjerregaard, P., Hansen, P.R., Larsen, K.J., Erratico, C., Korsgaard, B., Holbech, H. (2008): Vitellogenin as a biomarker for estrogenic effects in brown trout, Salmo trutta: Laboratory and field investigations. Env.Toxicol. Chem. 27 (11): Burki, R., Vermeirssen, E., Körner, O., Joris, C., Burkhardt-Holm, P., Segner, H. (2006): Assessment of estrogenic exposure in brown trout (Salmo trutta) in a swiss midland river:integrated analysis of passive samplers, wild an caged fish, and vitellogenin mrna and protein. Environ. Toxicol. Chem. 25: Colborn, T., vom Saal, F.S., Soto, A.M. (1993): Developmental Effects of Endocrine- DisruptingChemicals in Wildlife and Humans Environ. Health Perspect.101(5): Kavlok, R, Ankley, T, (1996). A Perspective on the Risk Assessment Process for Endocrin-Disruptive Effects on Wildlife and Human Health. Risk Analysis 16 (6): OECD (2004b): Detailed review paper in fish screening assays for the detection of endocrine active substances. OECD Series on Testing and Assessment No. 47. Paris. 170 S. Stalter, D., Magdeburga, A., Weilb, M., Knacker, T., Oehlmann, J. ( 2010):Toxication or detoxication? In vivo toxicity assessment of ozonation as advanced wastewater treatment with the rainbow trout. Water Res. 44: Vethaak, A.D., Lahr, J., Schrao, M., Belfoid, A., Rijs, G., Gerritsen, A., De Boer, J., Bulder, A., Grinwis, G.C.M., Kuiper, R.V., Legler, J., Murk, T.A.J., Peijnenburg, W., Verhaar, H.J.M., De Voogt, P. (2005): An integrated assessment of estrogenic contamination and biological effects in the aquatic environment of The Netherlands. Chemosphere 59:

103 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Vitellogenin-Induktion bei Forellen) Kurzzusammenfassung: Vitellogenin Der Antikörper bindet deutlich besser mit Vitellogenin von Regenbogen- als von Bachforellen Juvenile Bachforellen erwiesen sich als geeigneter zum Nachweis von Vitellogenin als adulte männliche Bachforellen Ergebnisse zeigen tendenziell stärkere östrogene Wirkungen in juvenilen Bachforellen, die an der Schussen unterhalb der KA Langwiese exponiert wurden als in Fischen, die im Bypass-System an der Argen gehalten wurden Die durch E-Screen und den Reportergenassay nachgewiesenen östrogenen Potentiale führen zu realen Wirkungen bei Fischen, die unterhalb der KA exponiert waren Bearbeitung des Teilprojektes Anja Henneberg, Sebastian Kindermann, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; ; 103

104 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Geschlechterverhältnis, Reifezustand und gonado- somatischer Index (GSI) bei Freilandfischen Hintergrund Vor dem Hintergrund, dass bestimmte Umweltchemikalien in das Hormonsystem von Fischen eingreifen und dadurch Veränderungen der Tiere sowohl im Verhalten als auch in ihrer Physiologie, Morphologie und Entwicklung hervorrufen können (z.b. Jobling & Tyler, 2003), wurden bei an Schussen und Argen entnommenen Döbeln und Schneidern drei Parameter untersucht, die mögliche Einflüsse endokriner Disruptoren auf die Geschlechtsentwicklung und Fertilität der Tiere sichtbar machen können. Über den Reifezustand der Gonaden und den mit diesem zusammenhängenden gonadosomatischen Index lässt sich ein direkter Einfluss auf die Gonadenentwicklung bzw. die Fertilität der Tiere erkennen. Die Erhebung des Geschlechterverhältnisses bei den entnommenen Tieren kann Hinweise auf hormonelle Einflüsse geben, ist allerdings sehr stark vom Fangerfolg und von saisonalen Einflüssen abhängig und wird deshalb nur unter Vorbehalt in die Diskussion einbezogen. Methoden Die Fische wurden im Freiland nach Betäubung gewogen und vermessen. Danach wurde zunächst makroskopisch das Geschlecht bestimmt. Die Gonade wurde entnommen, gewogen und Teile davon für histologische Untersuchungen in Fixans (2% Glutardialdehyd) überführt. Nach Entwässerung und Einbettung in Paraffin wurden 3 µm dicke Schnitte hergestellt. Das Geschlecht wurde histologisch nachbestimmt und der Reifezustand der Gonaden wurde folgendermaßen klassifiziert (Tab ): Tab : Einteilungskriterien für weibliche und männliche Gonaden Reifegrad Weibliche Gonade 1 nur Oogonien oder % prävitellogene bzw. frühe perinukleoläre Oozyten, < 10% vitellogene Oozyten bzw. Dottervesikelstadien 2 > 10% vitellogene Oozyten bzw. Dottervesikel-Stadien, < 50% reife Oozyten mit Dotter und/oder Lipid 3 > 50% reife Oozyten mit Dotter und/oder Lipid Der gonadosomatische Index (GSI) wurde wie folgt errechnet: (Gonadengewicht x 100) / Gesamtgewicht = GSI Männliche Gonade 80% Spermatogonien, keine Spermien < 30% Spermien, Rest Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden > 30% Spermien, Rest Spermatozyten und Spermatiden 104

105 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Resultate und Diskussion Geschlechterverhältnis Abb : Geschlechterverhältnis bei Döbeln Abb : Geschlechterverhältnis bei Schneidern Die in der Schussen 2009 und 2011 gefangenen Schneider waren vorwiegend weiblich, während an der Argen zwischen 50%-70% männliche Tiere gefangen wurden. An beiden Flüssen wurden insgesamt etwas mehr männliche als weibliche Döbel entnommen. Ein Einfluss östrogener Chemikalien auf die Geschlechterverteilung beim Schneider ist nicht auszuschließen. Allerdings kann auch die natürliche Varabilität für die Dominanz der Weibchen in der Schussen unterhalb der Kläranlage verantwortlich sein. Hierzu müssen noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Gonadenreife In Abb und sind die das Reifestadium der weiblichen und männlichen Gonaden bestimmenden Stadien der Geschlechtszellen zu erkennen. Abb zeigt 105

106 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Eizellen im Hoden eines Döbels, der an Probestelle 1 (oberhalb der KA Langwiese, unterhalb RÜB Mariatal) gefangen wurde. Mischgonaden traten an dieser Probestelle auch bei einem Schneider sowie an P4 an der Argen bei einem Döbel auf. Abb : Ovar eines Döbels mit prävitellogenen (p), vitellogenen (v) und reifen (m) Oozyten Abb : Hoden eines Döbels (Stadium 3) mit Spermatocyten (sc), Spermatiden (st) und Spermien (sp) Abb : Mischgonade bei einem männlichen Döbel 106

107 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Abb Gonadenreife bei weiblichen Schneidern Abb : Gonadenreife bei männlichen Schneidern Abb : Gonadenreife bei weiblichen Döbeln Abb : Gonadenreife bei männlichen Döbeln 107

108 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Bei weiblichen Schneidern aus der Argen war die Reife der Gonaden 2010 und 2011 im Sommer geringfügig weiter fortgeschritten als bei Fischen aus der Schussen. Im Winter sowie bei den männlichen Tieren konnte kein solcher Trend erkannt werden. Weibliche Döbel aus der Argen waren sowohl im Sommer als auch im Winter deutlich weiter in ihrer Gonadenreifung fortgeschritten als Tiere aus der Schussen. Bei männlichen Tieren war dieser Effekt nicht nachweisbar. Gonadosomatischer Index Die im Herbst 2010 und 2011 gefangenen männlichen und weiblichen Döbel aus der Argen zeigen einen signifikant höheren gonadosomatischen Index als die Fische aus der Schussen. Der GSI der Döbel aus der Schussen lag bei weiblichen Fischen deutlich unter dem niedrigsten von Mert et al. (2011) beschriebenen Wert für Döbel. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass in der Schussen Stoffe und Belastungen vorhanden sind, die die Entwicklung hemmen und zu einer verzögerten Reife der Tiere führen. Auch von Escher et al. (2002) und Bernet (2003) wurde bei Bachforellen unterhalb von Kläranlagen ein niedrigerer GSI nachgewiesen als oberhalb. Im Sommer konnte der gleiche Trend bei Männchen nur im Jahr 2010 beobachtet werden; Im Sommer 2011 hatten die männlichen Döbel an der Schussen einen höheren GSI als an der Argen. Weibliche Döbel wurden im Sommer an der Argen nicht gefangen. Im vorliegenden Fall ist ein Einfluss der Temperatur auf die Entwicklung auszuschließen, da die Wassertemperatur der Argen im Schnitt niedriger liegt als die der Schussen, und somit eine Verzögerung der Entwicklung eher in der Argen zu erwarten wäre. Abb : Gonadosomatischer Index weiblicher und männlicher Döbel im Herbst 2010 und 2011, n = Anzahl untersuchter Proben Die Hemmung der Gonadenreife und der reduzierte GSI bei Fischen aus der Schussen können einerseits mit den durch Reportergen-Assays nachgewiesenen anti-östrogenen 108

109 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Geschlechterverhältnis, Reife und GSI Fische) Potentialen in der Schussen zusammenhängen. Als solche Effekte verursachende Chemikalien, die in der Schussen oder in Fischen aus der Schussen nachgewiesen wurden, kommen Methytriclosan oder DDT in Frage. Andererseits können aber auch toxisch wirkende Substanzen zu geringerem Wachstum von Organen führen, da Energie in Entgiftungsprozesse investiert werden muss, und diese folglich für Wachstumsvorgänge nicht mehr zur Verfügung steht. Ein Zusammenspiel von toxischen und endokrinen Wirkungen ist bei Fischen aus der Schussen wahrscheinlich. Literatur Bernet, D. (2003). Biomonitoring in Fließgewässern des Kantons Bern: Synthesebericht. Teilprojekt Fischnetz Nr. 99/16. Escher, M., Lovas, R., Stadelmann, P. (2002). Fischbiologische Untersuchungen in der Ron: oberhalb und unterhalb der Kläranlagen Rain und Hochdorf. Mitt. Naturf. Ges. Luzern 37: 184 ff. Mert, R., Bulut, S., Solak, K. (2011). Some biological properties of the Squalius cephalus (L.,1758) population inhabiting Apa dam lake in Konya (Turkey). Afyon Koactepe University J. Sci. 6(2): Jobling, S., Tyler, C.R. (2003). Endocrine disruption in wild freshwater fish. Pure Appl. Chem. 75(11-12): Kurzzusammenfassung: Geschlechterverhältnis, Reife, GSI Fische Schneider an Schussen 2009 und 2011 vorwiegend weiblich: Hinweis auf östrogenartig wirkende Chemikalien oder natürliche Variabilität? Tendenziell verzögerte Gonadenentwicklung bei weiblichen Schneidern an der Schussen im Sommer und deutlich verzögerte Gonadenentwicklung bei weiblichen Döbeln an der Schussen im Sommer und Winter Signifikant geringerer gonadosomatischer Index v.a. im Herbst bei weiblichen und männlichen Döbeln an der Schussen im Vergleich zur Argen Möglicher Einfluss anti-östrogen wirkender Chemikalien; Zusammenhang zu durch Reportergenassays nachgewiesenen anti-östrogenen Potentialen Zusammenspiel von endokrinen und toxischen Wirkungen (Hemmung des Organwachstume) Bearbeitung des Teilprojektes Diana Maier, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad- Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; 109

110 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Fertilität und Geschlechterverhältnis bei zwei Vertretern der Gattung Gammarus* *Die Personalmittel dieses Projektteils wurde nicht durch Projektmittel, sondern durch ein persönliches Stipendium der MTU-Stiftung finanziert Einleitung Neben Wirbeltieren eignen sich auch Invertebraten hervorragend, um eine Schadstoffbelastung der Gewässer zu dokumentieren. Insbesondere Gammariden sind ausgezeichnete Monitororganismen. Sie sind weit verbreitet, leicht zu fangen und treten in so großer Individuenzahl auf, dass eine Entnahme größerer Stichproben ökologisch unbedenklich ist. Zudem reagieren sie sehr sensibel auf Veränderungen ihrer Umwelt, haben eine relativ kurze Generationszeit und sind somit optimale Testorganismen für ökotoxikologische Untersuchungen. Aufgrund ihrer Ernährungsweise sind sie als Zerkleinerer und Aufarbeiter eingetragenen pflanzlichen Materials für ein Gewässer von hoher ökologischer Bedeutung (Schwoerbel, 1999) und bilden aufgrund der hohen Individuendichten vor allem für Fische eine bedeutende Nahrungsquelle (Meijering und Pieper, 1982). An drei Probestellen in der Schussen (P00 bei Staig, P0 bei Weißenau und P3 bei Oberbaumgarten) sowie einer Probestelle in der Argen (P5 bei Gohren), wurden mehrmals im Jahr Gammariden (Abb.1 und Abb.2) gesammelt. Durch Untersuchung des Geschlechterverhältnisses und der Fekundität können Effekte von Mikroschadstoffen in den beiden Gewässern dokumentiert werden. Abb : ( Gemeiner Flohkrebs Gammarus pulex (Linné 1758), Präkopula. Abb : Flussflohkrebs Gammarus roeseli ( Gervais 1835 ), Präkopula. 110

111 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Geschlechterverhältnis Schon Watts et al. (2002) konnten im Labor nachweisen, dass sich das Geschlechterverhältnis von Gammarus pulex unter dem Einfluss von 17α-Ethinylöstradiol zugunsten der Weibchen verschiebt. Die Bestimmung des Geschlechterverhältnisses ist somit eine gute Methode, um in Fließgewässern mögliche östrogene Potentiale nachzuweisen. An einigen Probestellen der Schussen und Argen konnten bereits östrogene Potentiale durch anderweitige Untersuchungsmethoden nachgewiesen werden (Triebskorn, 2010). Fekundität Als Biomarker für eine Gewässerbelastung dient auch die Bestimmung der Fekundität. Durch den Einfluss östrogener Potentiale kann die Fekundität erhöht werden (Watts et al., 2002); eine erhöhte Schadstoffbelastung kann sich bei allgemein toxischer Wirkung jedoch auch in einer Verringerung der Fekundität manifestieren. Bereits vor zwei Jahren hat Geburzi (2010) die Fekunditätsindizes bei zwei Vertretern der Gattung Gammarus an ausgewählten Probestellen der Schussen und Argen bestimmt und konnte Unterschiede zwischen den einzelnen Probestellen feststellen. Methodik Geschlechterverhältnis und Artenverteilung Zur Bestimmung des Geschlechterverhältnisses wurden an jeder Probestelle 100 Gammariden (Gammarus pulex und Gammarus roeseli) gefangen. Diese wurden vor Ort vermessen, auf Parasitierungen hin untersucht und auf Artniveau bestimmt. Anschließend wurden die Individuen in Schnappdeckelgläsern in 2% Glutardialdehyd (gelöst in 0,005M Cacodylatpuffer, ph 7,4) fixiert und bis zur weiteren Verwendung gekühlt aufbewahrt. Im Labor wurden an den fixierten Gammariden die Geschlechter bestimmt und in vier Kategorien eingeteilt: Weibchen Männchen Intersex unbestimmbar/juvenil. Männchen sind an zwei Penispapillen am siebten Peraeon-Segment erkennbar (Abb.3). Weibliche Flohkrebse weisen am ersten bis vierten Peraeon-Segment vier Paar Brutlamellen (Oostegite) auf (Abb.4). Intersexindividuen sind durch das Auftreten beider äußeren Geschlechtsmerkmale charakterisiert. Erst nach etwa 9-10 Häutungen (bei einer Körperlänge zwischen 6 und 9 mm) erreichen Gammariden ihre Geschlechtsreife (Pöckl, 1993). Davor können die Flohkrebse nur als juvenil determiniert werden, da die äußeren Geschlechtsorgane für eine Geschlechtsbestimmung noch nicht ausgeprägt sind. 111

112 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Abb : Gammarus pulex. Männchen. Peraeon, ventrale Aufsicht. Abb : Gammarus pulex. Weibchen. Peraeon, ventrale Aufsicht. Für jede Probestelle wurde das Verhältnis zwischen Männchen und Weibchen ermittelt. Anschließend wurden die Frequenzen der beiden Geschlechter mit einem eindimensionalen Frequenztest (Likelihood Ratio Test) auf signifikante Abweichungen von einem 1:1 Verhältnis getestet, das nach einem Vergleich von Literaturdaten vereinfachend als Idealzustand angenommen wird. Neben Bestimmung des Geschlechterverhältnisses wurde an denselben 100 gesammelten Individuen die Artenverteilung bestimmt. Um die unterschiedlichen Probestellen hinsichtlich der Artenverteilung miteinander vergleichen zu können, wurden die Artenzahlen der einzelnen Probenahmen zusammengerechnet und statistisch auf signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Probestellen hin getestet (nicht parametrische Daten, one-way ANOVA, Wilcoxon-Test mit Bonferroni-Korrektur). Fekundität Zur Bestimmung der Fekundität wurden an jeder Probestelle 20 brütende Weibchen (Gammarus pulex und Gammarus roeseli) entnommen. Diese wurden vor Ort vermessen, auf Parasitierung hin untersucht und auf Artniveau bestimmt. Anschließend wurden die Weibchen einzeln in Schnappdeckelgläsern in 2% Glutardialdehyd (gelöst in 0,005M Cacodylatpuffer, ph 7,4) fixiert. Als Maß für die Fekundität wurde die Anzahl der im Marsupium eines brütenden Weibchens vorhandenen Eier und/oder Jungtiere verwendet. Im Labor wurde unter einem Stereomikroskop das Marsupium der brütenden Weibchen vorsichtig mit einer Federstahlpinzette geöffnet. Eier und Jungtiere wurden herauspräpariert und gezählt. 112

113 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Abb : Gammarus roeseli. Brütendes Weibchen. Peraeon mit Eiern im Marsupium, ventrale Aufsicht. Abb : Gammarus roeseli. Brütendes Weibchen. Ansicht lateral. Mit herauspräparierten Eiern. Anschließend wurde der Fekunditätsindex (FI) berechnet (FI = Anzahl Eier bzw. Juvenile / Körperlänge). Die Normierung erlaubt sowohl einen Vergleich zwischen unterschiedlich großen Weibchen einer Art, als auch einen Vergleich zwischen den zwei Arten, da diese zwar unterschiedliche Durchschnittsgrößen haben, die Fekundität bei gleich großen Weibchen unterschiedlicher Art aber gleich groß ist (Pöckl, 1993). Somit können die Fekunditätsindizes der beiden Arten an jeder Probestelle zusammengefasst werden. Um einen Vergleich zwischen den einzelnen Probestellen zu erhalten, wurde für jede Probestelle der Mittelwert sämtlicher Fekunditätsindizes der einzelnen Probenahmen gebildet und statistisch auf signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Probestellen hin getestet (nicht parametrische Daten, one-way ANOVA, Wilcoxon-Test, Bonferroni-Korrektur). Resultate Geschlechterverhältnis und Artenverteilung Die Artenverteilung (Abb. 7) war an den einzelnen Probestellen unterschiedlich. Während an P5 nur G. pulex vorkam, traten an den Probestellen der Schussen G. pulex und G. roeseli auf, wobei die Anzahl der Individuen der beiden Arten an diesen Probestellen signifikant unterschiedlich war. Abb.8 zeigt deutlich saisonale Schwankungen in der Geschlechter- und Altersstruktur der Proben. Der Anteil juveniler Gammariden in den Sommer- und Herbstproben war an den meisten Probestellen höher als während der Frühlingsprobenahmen. An vielen Probestellen war bei der Anzahl der Weibchen ein leichter Trend zu einer Abnahme zum Herbst hin zu erkennen. 113

114 Individuen Individuen Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Artenverteilung * ** 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% PS 00 PS 0 PS 3 PS 5 Probestellen G. roeseli G. pulex Schussen Argen Abb : Artenverteilung ( ). P0, P3 und P5: n=800; P00: n=600. Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). Daten der Probenahmen B, B*, C: Jonas Geburzi (im Diagramm miteinbezogen). Signifikante Testergebnisse (one-way ANOVA, Wilcoxon-Test, Bonferroni-Korrektur): * - p 0,016, ** - p 0,003. Geschlechterverteilung 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Frühling 2010 Sommer 2010 Herbst 2010 Frühling 2011 Sommer 2011 Herbst 2011 Probenahmezeitpunkt / Probestelle weiblich juvenil männlich Abb : Anteile von weiblichen, juvenilen und männlichen Tieren an allen Probestellen zu verschiedenen Jahreszeiten (2010 und 2011). Frühling und Herbst: n=100; Sommer: n=200. Daten Probenahmen B*, C : Jonas Geburzi (im Diagramm miteinbezogen). Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). 114

115 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Tab : Verhältnis von Männchen zu Weibchen an allen Probestellen zu verschiedenen Jahreszeiten (2010 und 2011). Frühling und Herbst: n=100; Sommer: n=200. Daten Probenahmen B*, C: Jonas Geburzi (in Tabelle miteinbezogen). Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). Abweichungen von der 1:1 Verteilung zugunsten der Weibchen: signifikante Testergebnisse (Maximum Likelihood Ratio): * - p 0,05, ** - p 0,01, *** - p 0,001. P00 P0 P3 P5 Frühling :1,04 1:2,52 *** 1:1,16 Sommer :4,00 *** 1:1,63 *** 1:2,62 *** 1:1,42 * Herbst :1,28 1:1,04 1:1,66 * 1:1,17 Frühling :4,43 *** 1:1,45 1:2,63 *** 1:2,81 *** Sommer :1,71 *** 1:1,62 ** 1:1,56 ** 1:1,45 * Herbst :1,13 1:1,19 1:1,23 1:0,98 Das Geschlechterverhältnis (Tab ) von Männchen und Weibchen war vor allem an Probestelle P3 häufiger (immer außer im Herbst 2011) und meist signifikanter zugunsten der Weibchen verschoben als an Probestelle P0, P00 und P5. Fekundität Die ermittelten Fekunditätsindizes (Tab ) zeigen einen Trend zu abnehmender Fekundität von Frühjahr (PN-B*, April 2010) zu Herbst (PN-J, Oktober 2011). Zudem sind Unterschiede zwischen den einzelnen Probestellen erkennbar (Abb ). An Probestelle P00 und P3 ist der Fekunditätsindex signifikant geringer als an Probestelle P0. Die großen Standardabweichungen erklären sich durch die Integration sämtlicher Fekunditätsindizes (FI) im Jahresverlauf (niedrige FI im Herbst und hohe FI im Frühling) in einem einzigen Datensatz. Tab : Arithmetische Mittelwerte (n=20) der Fekunditätsindizes an allen Probestellen der Probenahmen 2010 und Daten der Probenahmen B*, C: Jonas Geburzi. Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). P00 P0 P3 P5 B* (April 10) 3,822 2,750 2,963 F (Mai 11) 2,735 3,045 2,570 2,935 C (Juli 10) 2,773 2,822 1,751 G (Juli 11) 1,925 2,495 1,795 1,

116 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) D (August 10) 1,811 2,428 1,768 2,269 H (September 11) 1,580 2,005 1,560 1,625 E (Oktober 10) 1,450 1,893 1,426 1,940 J (Oktober 11) 1,578 2,045 1,692 1,997 Abb : Fekunditätsindizes ( ). P0, P3 und P5: n=160; P00: n=120. Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). Daten der Probenahmen B, B*, C: Jonas Geburzi (im Diagramm miteinbezogen). Mittelwerte und Standardabweichungen. Signifikante Testergebnisse (one-way ANOVA, Wilcoxon-Test, Bonferroni-Korrektur): ** - p 0,002. Diskussion Geschlechterverhältnis und Artenverteilung Die Unterschiede in der Artenverteilung an der Schussen können bisher noch nicht genau erklärt werden. Oberhalb P00 liegen drei Regenüberlaufbecken (LUBW 2009) und P3 liegt unterhalb der Kläranlage Langwiese. Möglicherweise wirkt sich der Eintrag aus diesen Anlagen auf das Verhältnis der Arten zueinander aus. An der Oberen und auch an der Unteren Argen konnten bisher noch keine Gammariden gefunden werden. Lediglich im Unterlauf der Vereinigten Argen tritt Gammarus pulex auf. Die Gründe hierfür sind bislang noch unklar. Der erhöhte Anteil an juvenilen Individuen in den Sommer- und Herbstprobenahmen kann durch den natürlichen Fortpflanzungsrhythmus der Gammariden erklärt werden. Im Spätherbst (Oktober) beginnt wegen der sinkenden Wassertemperaturen eine Fortpflanzungspause, die bis März/April anhalten kann (Pöckl, 1993). Über den Frühjahr/Sommerzeitraum pflanzen sich Gammariden fort (hoher Anteil an Präkopula in der Population) und somit sind juvenile Individuen vermehrt in den Probenahmen des 116

117 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Spätsommers/Herbsts zu finden. An vielen Probestellen verringert sich die Anzahl der Weibchen leicht zum Herbst hin. Da die Fortpflanzungsphase für die Weibchen sehr energiezehrend ist, könnte eine erhöhte Mortalität der Weibchen nach der Fortpflanzungsphase eine Erklärung für die Abnahme des Anteils der Weibchen sein. Beim Vergleich des Geschlechterverhältnisses weicht das Verhältnis der Männchen zu Weibchen an P00 und P3 etwas häufiger und signifikanter von einem 1:1-Verhältnis ab als an P0 und P5. In allen signifikanten Fällen ist das Geschlechterverhältnis zugunsten der Weibchen verschoben. Dies könnte auf östrogene Potentiale an diesen Probestellen hindeuten. Auffällig ist auch, dass bis auf P3 (Herbst 2010) alle Probestellen während der Herbstprobenahme keine signifikanten Unterschiede im Geschlechterverhältnis aufweisen, da sich die Anzahl der Weibchen vermutlich durch die erhöhte Mortalität nach der Fortpflanzungsphase verringert hat. Der immer noch hohe Anteil von Weibchen an der Schussen (P3) im Herbst 2010 könnte möglicherweise auf östrogene Potentiale zurückzuführen sein, welche mit saisonalen Schwankungen interagieren. Fekundität Die Abnahme der Fekundität vom Frühjahr zum Sommer ist in der Literatur belegt (Ladewig et al., 2006 und Pöckl, 1993). Die Unterschiede zwischen P0 und P3 können mit der unterschiedlichen Belastung an den beiden Probestellen erklärt werden. An P3 ist die Belastung mit Schadstoffen um einiges höher als an P0 (Triebskorn, 2010). Eine erhöhte Schadstoffbelastung an P3 kann zu einer Verringerung der Fekundität führen. Allerdings sprechen die erzielten Ergebnisse auch für eine erhöhte Schadstoffbelastung an P00, da die Fekundität an dieser Probestelle im Vergleich zu P0 signifikant geringer ist. Literatur Geburzi, J. (2010): Mikroschadstoff-Monitoring in zwei Bodenseezuflüssen mit drei Vertretern der Gattung Gammarus. Geschlechterverhältnis, Reproduktion und Parasitierung als Endpunkte der Toxizität. Bachelorarbeit der Fakultät für Biologie, Universität Tübingen. Ladewig, V., Jungmann, D., Köhler, H.-R., Schirling, M., Triebskorn, R. & Nagel, R. (2006): Population Structure und Dynamics of Gammarus fossarum (Amphipoda) Upstream and Downstream from Effluents of Sewage Treatment Plants. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 50: LUBW (2009): Schussenprogramm Erfolgskontrolle und Maßnahmeoptimierung. Abschlussbericht. Pöckl, M. (1993): Beiträge zur Ökologie des Bachflohkrebses (Gammarus fossarum) und Flußflohkrebses (Gammarus roeseli), Entwicklungszyklus und Fortpflanzungskapazität. Natur und Museum 123 (4), Frankfurt am Main. Triebskorn, R. (2010): Modellstudie zur Effizienz der Reduktion der Gehalte an anthropogenen Spurenstoffen durch Aktivkohle in Kläranlagen: Begleitende biologische und chemische Erfolgskontrolle an der Kläranlage Langwiese (AZV Mariatal) und an der Schussen im Bodensee- Einzugsgebiet. Ergebnisbericht an das Umweltministerium Baden-Württemberg. Watts, M. M., Pascoe, D. & Carroll, K. (2002): Population responses of the freshwater amphipod Gammarus pulex (L.) to an environmental estrogen, 17α-ethinylestradiol. 117

118 Endokrine Potentiale und Wirkungen: (Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden) Kurzzusammenfassung: Fertilität und Geschlechterverhältnis Gammariden Artenverteilung: An P5 (Argenmündung) ausschließlich Gammarus pulex, an den Probestellen der Schussen vorwiegend Gammarus roeseli Geschlechterverteilung: Unterhalb KA Langwiese häufiger mehr Weibchen als oberhalb der KA und in der Argen: möglicher Einfluss östrogenartig wirkender Chemikalien; Zusammenhang mit nachgewiesenen östrogenen Potentialen durch E-Screen und Reportergenassays Unterhalb der KA geringere Fekundität (Fruchtbarkeit) als oberhalb der KA: Einfluss toxischer Chemikalien Wie bei den Fischen in der Schussen: Zusammenspiel von endokrinen und toxischen Wirkungen wahrscheinlich Bearbeitung des Teilprojektes Katharina Peschke, Physiologische Ökologie der Tiere, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; 118

119 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Dioxinähnliche Potentiale) 4.4. Toxische Potentiale und Wirkungen Reportergenassays zu Dioxinähnlichen Potentialen Hintergrund und Methodik Zum Nachweis von toxischen Potentialen, die analog zur Wirkung von Dioxinen - auf der Bindung der Wirksubstanz an einen cytoplasmatischen Rezeptor, den Ah-Rezeptor, basieren, wurden in vitro Studien mit Reportergen-Assays durchgeführt. Der Test basiert auf einer Ratten-Hepatokarzinom-Zelllinie (H4IIE.luc-Zellen), die stabil mit einem Luciferase- Reportergen unter Kontrolle des Arylhydrocarbon-Rezeptors (AhR) transfiziert wurde. Die Aktivierung des AhR durch Dioxine und andere Ah-Rezeptor-aktivierende Chemikalien (coplanare PCBs, PAHs und ihrer Derivate) wird durch Messungen der AhR-abhängigen Lumineszenz quantifiziert. Die Effekte werden als TEQbio (toxische Äquivalente) in Bezug auf das toxische Potential von 2,3,7,8-TCDD angegeben. Untersucht wurden Ablaufproben der Kläranlage Langwiese von (PN C-I) sowie Sedimentproben zu diesen Probenahmezeitpunkten von der Probestelle P3 (Schussen unterhalb KA) und P4 (Argen). Resultate und Interpretation Im Ablauf der KA Langwiese wurden nur 2010 sehr schwache Dioxin-ähnliche Potentiale nachgewiesen (Abb ). Diese liegen um mehr als das Zehnfache unter den Werten, die für das Sediment an P3 unterhalb der KA ermittelt wurden. Für die Belastung der Sedimente können diffuse Einträge von persistenten Verbindungen über die Luft oder Abdrift verantwortlich sein, die, da es sich um schlecht abbaubare Verbindungen handelt, auch schon lange zurückliegen können. Die Messwerte für das Sediment der Argen liegen im Bereich der Werte für den KA-Ablauf. Generell wurden 2011 geringere TCDD-Äquivalente gemessen als 2010, was witterungsbedingt sein könnte. Im Vergleich mit Messwerten zu belasteten Sedimenten (Abb ) sind jedoch auch die Werte für die Sedimente der Schussen als eher niedrig bzw. wenig belastet zu bewerten. Literatur Hilscherová et al. (2010). Seasonally and Regionally Determined Indication Potential of Bioassays in Contaminated River Sediments. Environ. Toxicol. Chem. 29(3):

120 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Dioxinähnliche Potentiale) Abb : Dioxin-ähnliche Potentiale im Ablauf der KA Langwiese und in Sedimenten von Schussen und Argen Abb : Aus Hilscherová et al. (2010). Spannbreite der Werte für Dioxin-ähnliche Potentiale im Sediment Kurzzusammenfassung: Dioxin-ähnliche Potentiale Sehr geringere Dioxin-ähnliche Potentiale im KA-Ablauf und im Sediment der Argen Um etwa den Faktor 10 höhere Werte für Sedimente der Schussen als der Argen, aber immer noch Werte im Bereich unbelasteter Sedimente Bearbeitung des Teilprojektes: Prof. Dr. Ludek Blaha, RECETOX, Masaryk University, Brno, Czech Republic; ; 120

121 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Potentiale - Reportergenassays) Reportergenassays zu gentoxischen Potentialen Hintergrund und Methoden Zum Nachweis gentoxischer Potentiale in Ablaufproben der KA Langwiese sowie in Sedimenten von Schussen (P3) und Argen (P4) wurden zu sieben Zeitpunkten (2010 und 2011) Proben mit dem SOS-Chromotest untersucht. Dieser von Fish et al. (1987) entwickelte colorimetrische Test weist Gentoxizität indirekt dadurch nach, dass er die Aktivität von DNA- Reparaturmechanismen (SOS Reparaturgen suia) sichtbar macht, die anspringen, wenn Mutationen oder Schädigungen der DNA auftreten. Die Visualisierung erfolgt über die gleichzeitige Aktivierung eines -Galaktodidase-Gens. Die Werte sind angegeben als MGC (minimum genotoxic concentration), d.h. als der geringste Anreicherungsfaktor (für Abwasserproben) bzw. die geringste Sedimentmenge, bei dem/der signifikante Mutagenität gemessen werden konnte. Die Abwasserproben wurden 1,5x, 3x, 6x und 12x aufkonzentriert gemessen, Testkonzentrationen bei den Sedimenttests waren: 0,125 g/ml, 0,25 g/ml und 0,5 g/ml. Ergebnisse und Interpretation In Abwasserproben konnten gentoxische Potentiale in dreifach bzw. sechsfach konzentrierten Proben zu fünf Zeitpunkten festgestellt werden. Bei den Sedimenten wurden Effekte lediglich bei den Sedimenten der Schussen (P3, unterhalb Kläranlage) zweimal bei jeweils 0,25 g/ml nachgewiesen. Tab : Genotoxizität gemessen mit dem SOS-Chromotest. Werte sind angegeben als minimale genotoxische Konzentration (MGC). - n.e. kein Effekt bis zur höchsten Testkonzentration (d.h. 12x Konzentration für Abwasserproben; 0,5 g Sediment dw/ml für Sedimentproben) KA-Ablauf [MGC - Konzentrationsfaktor] C D E F G H I MGC 3x n.e. 6x n.e. 6x 6x 3x Sedimente (MGC - g Sediment / ml) Schussen C D E F G H I P3 MGC 0,25 n.e. n.e. 0,25 n.e. n.e. n.e. Argen P4 C D E F G H I MGC n.e. n.e. n.e. n.e. n.e. n.e. n.e. 121

122 IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity IF beta-galactosidase activity Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Potentiale - Reportergenassays) C 2.0 * * * 1.5 D NK 1, NK 1, E 2.0 * * F 2.0 * * NK 1, NK 1, G 2.0 * * H 2.0 * * NK 1, NK 1, I * * 2.0 * NK 1,5 Abb : Konzentrations-Wirkungskurven für den SOS-Chromotest mit Abwasserproben. Die Konzentrationen sind angegeben als Anreicherungsfaktoren (z.b. 12 bedeutet eine 12fach konzentrierte Proben) In keiner der nicht aufkonzentrierten Proben konnten gentoxische Potentiale nachgewiesen werden. Allerdings waren Effekte in 3-6fach aufkonzentrierten Abwasserproben sowie in Sedimenten der Schussen regelmäßig zu finden. Obwohl in nativem Abwasser keine signifikant erhöhte Gentoxizität nachweisbar war, ist die Präsenz gentoxischer Potentiale 122

123 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Potentiale - Reportergenassays) (Nachweis in aufkonzentrierten Proben) in Umweltproben generell als problematisch anzusehen. Literatur Fish, F., Lampert, I., Halachmi, A., Riesenfeld, G., Herzberg, M. (1987). The SOS chromotest kit: a rapid method for the detection of genotoxicity. Toxicity Assessment 2: Kurzzusammenfassung: Gentoxische Potentiale Nachweis gentoxischer Potentiale in konzentrieren KA-Ablaufproben und in Sedimenten der Schussen Kein Nachweis gentoxischer Potentiale in Sedimenten aus der Argen Bearbeitung des Teilprojektes: Prof. Dr. Ludek Blaha, RECETOX, Masaryk University, Brno, Czech Republic; ; blaha@recetox.muni.cz 123

124 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Wirkungen - Mikrokerntest) Nachweis gentoxischer Wirkungen bei Döbeln aus Schussen und Argen mit dem Mikrokern-Test Zielsetzung Mittels Mikrokern-Tests kann das gentoxische Potential von Substanzen ermittelt werden, da es sich bei Mikrokernen um DNA-haltige Fragmentationsprodukte des Zellkerns handelt. Sie dienen als Indikator für Zellteilungsfehler, weil fehlgebildete Spindelapparate oder DNA- Fragmente während der Anaphase nicht in die Tochterzellen übertragen werden und im Zytoplasma zurück bleiben. Diese können später mittels DNA-Färbung quantifiziert werden. Blutzellen von Fischen verfügen über einen Zellkern und sind damit sehr gut für den Mikrokern-Test geeignet. Es sollte ermittelt werden, ob in Blutzellen von an Schussen und Argen entnommenen Döbeln Zellteilungsfehler in den roten Blutzellen sichtbar sind, bzw. inwiefern sich die beiden Bodenseezuflüsse in ihrem gentoxischen Potential unterscheiden. Dieser Test wird vielfach eingesetzt, ist gut geeignet für die Anwendung im Feld (Llorente et al. 2002) und der Endpunkt Anzahl der Mikrokerne hat sich als sensitiver Biomarker erwiesen (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Bolognesi, Hayashi 2011). Methoden Vor Ort wurde den gefangenen Döbeln (Leuciscus cephalus) Blut entnommen, auf mit Ethanol entfette Objektträger aufgetragen und ausgestrichen. Diese mussten an der Luft trocknen und wurden schließlich in Methanol fixiert und getrocknet. Im Labor erfolgte die DNA-Färbung mittels GIEMSA Stammlösung (ROTH, Karlsruhe). Es erfolgten mehrere Waschschritte mit Leitungs- und destilliertem Wasser, um den Farbüberschuss abzuspülen, bis nur noch eine leichte Färbung erkennbar war. GIEMSA färbt DNA dunkler gegenüber dem Rest der Zelle, somit sind die Zellkerne bzw. Mikrokerne davon leicht zu erkennen. Die Mikrokernauszählung erfolgte am Mikroskop (ZEISS Axiostar plus) bei 100x Vergrößerung. Pro Objektträger wurden 2000 Erythrozyten gezählt (verändert nach De Flora et al. 1993) und die prozentuale Mikrokernanzahl festgehalten. Überlappende oder unregelmäßig geformte Zellen wurden dabei nicht berücksichtigt, da keine genaue Bestimmung der Mikrokerne möglich war. Resultate und Diskussion Mikrokerne können zwischen 1/5 und 1/40 der Größe des eigentlichen Zellkernes haben. In Abb. 1 sind Mikrokerne in Erythrozyten eines Döbels erkennbar, der an der Schussen 124

125 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Wirkungen - Mikrokerntest) gefangen wurde. Das Erbgut erscheint nach der DNA-Färbung dunkelblau, das Zytoplasma rosa. Die Blutzellen sind generell gleichmäßig elliptisch geformt, mit einem mittig liegenden Zellkern. Mikrokerne liegen oft an der Peripherie der Zellen. Abb : Mikrokern in einem Erythrozyten aus Döbel (Pfeil), Probestelle 3 Schussen, Probenahme September 2011, 100x Vergrößerung In Abb ist die Anzahl der Mikrokerne von allen untersuchten Fischen zusammengestellt. An der Probestelle 3 an der Schussen wurden 8 Tiere, an der Probestelle 4 an der Argen wurden 11 Tiere entnommen. Für die Schussen variieren die Werte zwischen 15 und 49 erfassten Mikrokernen pro Objektträger. An der Argen schwanken die Werte zwischen 8 und 27 gezählten Mikrokernen. Die Mittelwerte für die beiden Flüsse Schussen und Argen sind in Abb dargestellt. Diese liegen bei mit einer Standardabweichung von für die Schussen und bei Mikrokernen mit einer Standardabweichung von 4.98 bei der Argen. Eine statistische Analyse mit dem Wilcoxon Test hat ergeben, dass die Daten normalverteilt sind und ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Flüssen vorliegt (p=0.016*). 125

126 Mikrokerne pro 2000 Zellen Mikrokerne pro 2000 Zellen Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Wirkungen - Mikrokerntest) Anzahl von Mikrokernen der einzelnen Proben Schussen (n= 8) Argen (n=11) Abb : Anzahl der Mikrokerne bei Döbeln von der Schussen und Argen, September 2011 Mittelwerte Mikrokerne im Vergleich 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Schussen (n=8) * Argen (n=11) Abb : Mittelwerte der Mikrokernauszählung, Standardabweichungen und Signifikanz Die Untersuchung zeigt, dass in Döbeln aus der Schussen signifikant mehr Mikrokerne in den Blutzellen auftraten als bei Tieren aus der Argen. In der Schussen traten durchschnittlich 1.48 % Mikrokerne pro Tier auf, in der Argen hingegen nur 0.79 %. In der Literatur gibt es bisher nur wenige Vergleichswerte für Karpfenartige. Meist wurde der Karpfen Cyprinus carpio untersucht. Die Zahl spontan induzierte Mikrokerne für den Karpfen variiert zwischen 0,002% und 0,62%. Diese Schwankungen wurden auch für andere Fischarten festgestellt und können auf interspezifische Variabilität sowie auf biotische Faktoren wie Alter oder Geschlecht der Tiere zurückgeführt werden (Bolognesi & Hayashi, 126

127 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Gentoxische Wirkungen - Mikrokerntest) 2011). Die vorliegenden Werte müssen aus diesem Grunde noch dahingehend überprüft werden, ob ein Zusammenhang mit Alter oder Geschlecht der untersuchten Fische besteht. Allerdings erscheint der für Döbel aus der Schussen ermittelte Wert vor der o.g. Spannbreite der prozentualen Anteile an Mikrokernen beim Karpfen als relativ hoch. Da zudem in der Schussen bzw. in Fischen aus der Schussen sowohl potentiell gentoxische Chemikalien (DMS, TCPP, Methyltriclosan, Carbendazim) als auch über Reportergenassays gentoxische Potentiale nachgewiesen wurden, erscheinen die erzielten Ergebnisse trotz der geringen Stichprobenzahl von 19 Individuen plausibel. Literatur De Flora, S., Vigano, L., D Agostini, F., Camoirano, A., Bagnasco, M., Benicelli, C., Melodia, F., Arillo, A. (1993). Multiple genotoxicity biomarkers in fish exposed in situ to polluted river water. Mut. Res. 319: Bolognesi, C., Hayashi, M. (2011). Micronucleus assay in aquatic animals. Mutagenesis 26 (1): Llorente, M. T., Martos, A., Castaño, A. (2002). Detection of Cytogenetic Alterations and Blood Cell Changes in Natural Populations of Carp. Ecotoxicology 11: Al-Sabti, K., Metcalfe, C. D. (1995). Fish micronuclei for assessing genotoxicity in water. Mut. Res. 343: Kurzzusammenfassung: Gentoxische Wirkungen bei Fischen Signifikant mehr Mikrokerne in Blutzellen von Döbeln aus der Schussen Kausaler Zusammenhang mit der Präsenz gentoxischer Potentiale in der Schussen (gezeigt durch Reportergenassays) wahrscheinlich Bearbeitung des Teilprojektes Lisa Hanslik, Krisztina Vincze, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; lisa.hanslik@gmx.de 127

128 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) Acetylcholinesterase im Gehirn von Döbel und Schneider aus Schussen und Argen* *Dieser Projektteil wurde im Rahmen einer Kooperation zwischen der Universität Tübingen und der Universität Avignon ohne Finanzierung durchgeführt. Hintergrund Der am besten untersuchte Biomarker, um neurotoxische Wirkungen von Pflanzenschutzmitteln (Organophosphaten oder Carbamaten) in der Umwelt nachzuweisen, ist die Acetylcholinesterase [AChE] (de la Torre et al., 2002). Obgleich dieser Biomarker als relativ spezifisch für die genannten Expositionen gilt, ist zu beachten, dass der Grundlevel zusätzlich z.b. durch die Temperatur oder die Größe der Tiere beeinflusst werden kann (Flammarion et al., 2002; Durieux et al., 2011). Ziel dieses Teilprojektes ist es, eine mögliche Hemmung der Acetylcholinesterase durch Pflanzenschutzmittel in den Hirnen von Döbel und Schneider aus Schussen und Argen nachzuweisen. Zusätzlich zur AChE wurde in den Hirnen die Aktivität der ebenfalls durch o.g. Insektizide hemmbaren Carboxylesterase pnpa (Substrat ist 4-Nitrophenylacetat) bestimmt, die ebenfalls als Biomarker für Neurotoxizität vielfach gemessen wurde (z.b. Xing et al., 2010) und der eine protektive Funktion für AChE zugesprochen wird (Wheehlock et al., 2008) Methoden Probenvorbereitung Die Hirne von Döbel und Schneider aus PN F, G, H und J wurden auf Eis mittels eines Ultra Turrax IKA T18 bei 14,000 U/min für 4 x 10s (mit je 1 min Intervall) in 20% (w/v) low-salt Puffer (10 mm Tris-HCl ph 7.3, 10 mm NaCl, supplementiert mit Proteaseinhibitoren) homogenisiert und anschließend bei 5000g für 10 min bei 4 C zentrifugiert, um unlösliche Zellbestandteile aus dem Zellextrakt zu entfernen. Der Überstand nach Zentrifugation stellt den Rohextrakt der jeweiligen Proben dar. Jeder Rohextrakt wurde bei -20 C mit 10% Glycerin bis zur Analyse eingefroren. Esterasenachweise Für alle Proben wurde zunächst der Gesamt-Proteingehalt jedes Rohextraktes mit der Lowry-Methode, modifiziert nach Markwell et al. (1978) mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt. Die Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivität wurde spektralphotometrisch bei 412 nm und 25 C nach Ellman et al. (1961) mittels eines Synergy HAT Mikropatten-Readers (Bio-Tek) 128

129 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) gemessen. Der Standard-Reaktionsmix (200 µl Endvolumen) enthielt 0,375 mm DTNB, 3 mm AcSCh, 0.1 M Natriumphosphatpuffer (ph 7.0). Die enzymatisch bedingte Produktion von Thionitrobenzoesäure wurde mittels einer Standardkurve mit Dithiothreitol als Standard quantifiziert. Carboxlesterase (CaE)-Aktivität wurde spektralphotometrisch mittels eines Mikroplatten- Readers (Synergy HAT, Bio-Tek) gemessen. Hierbei wurden die Substrate 4-NPA (Nitrophenylacetat) und 4-NPV (Nitrophenylvalerat) verwendet. Die Hydrolyse von 4-NPV oder 4-NPA durch CaE wurde wie von Carr & Chambers (1991) bzw. Chanda et al. (1997) beschrieben (bei kleineren Modifikationen des Mikroplatten-Readers) quantifiziert, In den Standard-Assays wurden jeweils 250 µl Endvolumen der folgenden Lösungen eingesetzt: 1mM 4-NPV, 50mM Tris-HCl (ph7.5) bzw. 5mM 4-NPA, 20 mm Tris-HCL, 1 mm EDTA (ph 8). Die Produktion von 4-Nitrophenol (4-NP) wurde spektralphotometrisch für 5 min bei 405 nm und 25 C erfasst und mittels einer für 4-NP erstellten Standard-Kurve quantifiziert. Negativkontrollen (Reaktionsmix ohne Zusatz von Rohextrakt) wurden regelmäßig zur Überprüfung nicht-enzymatischer Hydrolyse von 4-NPV bzw. 4-NPA durchgeführt. Alle Enzymaktivitätsuntersuchungen erfolgten in dreifacher Wiederholung. Die Esteraseaktivitäten wurden entweder als Einheiten pro mg Gesamt-Protein oder als Einheiten pro g Gewebe angegeben. Eine Einheit Enzymaktivität wurde als diejenige Menge Enzym definiert, welche 1 µmol Substrat innerhalb 1 min unter den oben beschriebenen Laborbedingungen hydrolysierte. Der Gesamt-Proteingehalt jedes Rohextraktes wurde mit der Lowry-Methode, modifiziert nach Markwell et al. (1978) mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt. Ergebnisse und Diskussion Proteingehalt Der Gesamtproteingehalt im Gehirn von Döbeln, welche der Argen entnommen wurden, lag höher als der in Hirnen von Döbeln aus der Schussen. Bei Schneidern wurden diesbezüglich keine signifikanten Unterschiede festgestellt (Abb ). Ob hier eine negative Korrelation mit der Körpergröße besteht, wie der Vergleich von Abb und vermuten lässt, d.h. ob größere Fische einen geringeren Proteingehalt im Gehirn aufweisen als kleinere, muss noch individuell überprüft werden. Aktivität der Acetylcholinesterase Die spezifischen AChE-Aktivitäten, die in den beiden untersuchten Fischarten gemessen wurden, lagen in der gleichen Größenordnung wie diejenigen für Döbel aus 129

130 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) südfranzösischen Flüssen (Flammarion et al. 2002), aber auch wie diejenigen, die für den Felsenbarsch Morone saxatilis bekannt sind (Durieux et al. 2011). Bei Döbeln wurden in der vorliegenden Studie in Abhängigkeit von der Probenstelle unterschiedlich hohe AChE-Aktivitäten beobachtet. Im Mittel lag die spezifische AChE- Aktivität für Döbel aus der Argen niedriger als für Döbel aus der Schussen (P3). Dieser Effekt trat auch auf, wenn die AChE-Aktivität nicht auf den Gesamtproteingehalt der Probe (wie in Abb ), sondern auf das Frischgewicht des analysierten Hirngewebes bezogen wurde. Dies zeigt, dass nicht alleine der unterschiedliche Gesamtproteingehalt der Proben für diesen Befund verantwortlich gemacht werden kann. Auch die von Flammarion et al. (2002) beschriebene negative Korrelation von AChE-Aktivität und Körperlänge konnte für Döbel an beiden Probestellen nicht nachgewiesen werden (Döbel Argen: P=0,63; Döbel Schussen: P=0,1). Der Vergleich der Abb und zeigt diese fehlenden Zusammenhang auch für die Mittelwerte der Körperlängen und AChE-Aktivitäten im Gehirn von Döbeln zu den drei Probenahmezeitpunkten. Die in Abb dargestellten Mittelwerte der AChE-Aktivität im Gehirn der Schneider von Schussen und Argen unterscheiden sich nur minimal. Betrachtet man jedoch die Einzelwerte für die drei Probenahmezeitpunkte wird deutlich, dass zu jedem Zeitpunkt der Wert bei Tieren aus der Argen geringer ist als bei Schneidern aus der Schussen. Außer für die Argen zum Probenahmezeitpunkt G, an dem zwei extrem große Tiere mit extrem geringer AChE- Aktivität im Gehirn analysiert wurden, lässt sich auch für Schneider keine negative Korrelation zwischen Körperlänge und AChE-Aktivität nachweisen. Es ist aus diesem Grunde davon auszugehen, dass die geringeren AChE-Aktivitäten in den Gehirnen der meisten an der Argen gefangenen Fische mit einer spezifischen Hemmung des Enzyms durch Pestizide (Organophosphate oder Carbamate) zu erklären ist. Da Referenzwerte fehlen, ist allerdings auch für die den Fische an der Schussen eine (evtl. geringere) Hemmung des Enzyms nicht auszuschließen, zumal die bekannten Korrelationen zwischen Körperlänge und Enzymaktivität nicht nachzuweisen sind bzw. ggf. überdeckt werden. Carboxylesterasen (CaE) bilden eine Gruppe von Proteinen, die in Detoxifikationswegen von Organophosphat- [OP]-Pestiziden involviert sind (Wheelock et al. 2008, Sogorb & Vilanova 2002). Hierbei determinieren die Anzahl der zur Verfügung stehenden CaE-Moleküle sowie deren Affinität zu der betreffenden Verbindung aus der OP-Gruppe die Effizienz dieses biochemischen Detoxifikationsmechanismus (Chanda et al. 1997). Der protektive Effekt von CaE auf AChE kann dem zu Folge in einem effizienten Abfangen von OP durch AcE bestehen, welches wiederum vor allzu großer AChE-Hemmung schützt (Wheehlock et al 2008). In der aktuellen Studie lagen die gemessenen CaE-Aktivitäten bei Döbeln aus der 130

131 Protein (mg/g tissue) Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) Argen höher als bei Tieren aus Schussen (Abb ), was die Vermutung stützen würde, dass an der Probestelle 4 an der Argen Pestizide die Aktivität der untersuchten Enzyme beeinflussen. Bei Schneidern wurde allerding eine eher geringere CaE-Aktivität in den Hirnen von an der Argen gefangenen Individuen (im Vgl. zur Schussen) gemessen Proteingehalt Gehirn Döbel Argen P4 Döbel Schussen P3 (uh KA) Schneider Argen P Schneider Schussen P3 (uh KA) Abb : Mittlerer Proteingehalt der Gehirne von Döbeln und Schneidern aus Schussen und Argen Abb : Mittlere Körperlänge von Döbeln und Schneidern aus Schussen und Argen 131

132 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) Abb : Mittlere Aktivität der Acetylcholinesterase im Gehirn von Döbeln und Schneidern aus Schussen und Argen Abb : Aktivität der Acetylcholinesterase im Gehirn von Döbeln aus Schussen (P3) und Argen (P4) zu den drei Probenahmezeitpunkten Abb : Körperlänge von Döbeln aus Schussen (P3) und Argen (P4) zu den drei Probenahmezeitpunkten 132

133 CaE activities (nmol.min- 1.mgProtein-1) Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) Abb : Aktivität der Acetylcholinesterase im Gehirn von Schneidern aus Schussen (P3) und Argen (P4) zu den drei Probenahmezeitpunkten Abb : Körperlänge von Schneidern aus Schussen (P3) und Argen (P4) zu den drei Probenahmezeitpunkten 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Carboxylesterasen 58,8 59,4 48,8 50,8 pnpa 10,0 10,1 10,27,3 pnpv Döbel Argen P4 Döbel Schussen P3 (uh KA) Schneider Argen P4 Schneider Schussen P3 (uh KA) Abb : Aktivität der Carboxylesterasen pnpa und pnpv im Gehirn von Döbeln und Schneidern aus Schussen und Argen 133

134 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Acetylcholinesterase) Literatur Carr, R.L., Chambers, J.E., Acute effects of the organophosphate paraoxon on schedulecontrolled behaviour and esterase activity in rats: dose-response relationships. Pharmacology Biochemistry and Behaviour 40, Chanda, S.M., Mortensen, S.R., Moser, V.C., Padilla, S., Tissue-specific effects of chlorpyrifos on carboxylesterase and cholinesterase activity in adult rats: an in vitro and in vivo comparison. Fundamental and Applied Toxicology 38, de la Torre, F.R., Ferrari, L., Salibián, A. (2002). Freshwater pollution biomarker: response of brain acetylcholinesterase activity in two fish species. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol..131(3): Durieux, E. D. H., Farver, T.B., Fitzgerald, P.S., Eder, K.J., Ostrach, D.J. (2011). Natural factors to consider when using acetylcholinesterase activity as neurotoxicity biomarker in Young-Of-Year striped bass (Morone saxatilis). Fish Physiol Biochem 37: Ellman, L., Courteym, K.D., Andreasm, V.Jr,, Featherstone, R.M., A new rapid colorimetric determination of cholinesterase activity. Biochemical Pharmacology 7, Flammarion, P., Noury, P., Garric, J. (2002). The measurement of cholinesterase activities as a biomarker in chub (Leuciscus cephalus): the fish length should not be ignored. Environ Pollut. 120(2): Markwell, M.A.K., Haas, S.M., Bieber, L.L., Tolbert, N.E Modification of Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lippoprotein samples. Analytical Biochemistry 87, Sogorb MA, Vilanova E (2002) Enzymes involved in the detoxification of organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis. Toxicol Lett 128: Wheelock CE, Phillips BM, Anderson BS, Miller JL, Miller MJ, Hammock BD (2008) Applications of carboxylesterase activity in environmental monitoring and toxicity identification evaluations (TIEs). Rev Environ Contam Toxicol 195: Xing, H., Wang, J., Li, J., Fan, Z., Wang, M., Xu, S. (2010). Effects of atrazine and chlorpyrifos on acetylcholinesterase and Carboxylesterase in brain and muscle of common carp. Environ Toxicol Pharmacol. 30(1): Kurzzusammenfassung: Acetylcholinesterase im Gehirn von Fischen Deutliche Hemmung der Acetylcholinesterase in Fischen aus der Argen Keine Abhängigkeit der AChE-Aktivität von der Körperlänge der Fische, weder an der Schussen noch an der Argen (was zu erwarten gewesen wäre), deshalb ggf. auch an der Schussen hemmende Effekte möglich Fehlende Referenzwerte erschweren Interpretation Bearbeitung des Teilprojektes: Dr. Magali Rault, Universität Avignon, Prof. Dr. Rita Triebskorn, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; ; rita.triebskorn@uni-tuebingen.de 134

135 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) Stressproteinnachweise in Geweben von Döbel und Schneider aus Schussen und Argen sowie von in den Bypässen exponierten Bachforellen Hintergrund und Methodik Als Biomarker zur Erfassung von Proteinschäden (Proteotoxizität) sowie der Proteinneusynthese ist der Level der Stressproteinfamilie Hsp70 weltweit anerkannt (Sørensen et al. 2003). Bei kompensatorischen Reaktionen des Organismus auf eine Proteinschädigung steigt zunächst der Level von Hsp70 an, erreicht ein Maximum und fällt bei Überlastung dieses protektiv wirkenden Systems oftmals bis unter den Kontrollzustand ab (Eckwert et al. 1997). Unter Berücksichtigung dieser Reaktionskinetik ist somit eine differentielle Diagnostik möglich. Die Messung in den Organen der Fische erfolgte mit einem hoch reproduzierbaren Immunoblotting- Verfahren (methodische Variabilität ± 2,7%). Proben der Leber, Kieme, Niere und Gonade aller beprobten Fischindividuen wurden vor Ort in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Labor homogenisiert und zentrifugiert. Konstante Mengen nicht membrangebundenen Proteins (Bestimmung nach Bradford, 1976) wurden über SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt, in einem Semi-dry-Verfahren auf Nitrocellulose geblottet und Hsp70 immunologisch detektiert. Die Quantifikation des Signals erfolgte über die Bestimmung des optischen Volumens (Intensität x Fläche) in Relation zu einem Hsp70-Standard. Diese Methodik ist bei einer Reihe von Fischarten etabliert (Köhler et al. 2001, 2007, Eder et al. 2007, 2009, Scheil et al. 2010). Untersucht wurden zu allen Probenahmezeitpunkten Schneider und Döbel aus Schussen (P3) und Argen (P4). Zusätzlich wurden Bachforellen untersucht, die in den Bypass-Stationen bei Gunzenhaus und Pflegelberg am nach 43 Tagen Exposition beprobt wurden. Bei der Laborkontrolle handelt es sich ebenfalls um Bachforellen aus der Fischzucht Peter Störk (Bad Saulgau, Deutschland). Diese wurden nach 61 Tagen Laborhaltung am beprobt. Statistische Auswertung : Mittels Shapiro-Wilk-W-Test wurden die Daten auf Normalverteilung getestet. Die weitere Auswertung erfolgt mit dem Tukey Kramer 135

136 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) Test bzw. bei nicht Normalverteilung mit dem Wilcoxon/ Kruskal-Wallis Test. Signifikanzniveaus 0,05 (*), 0,01 (**) und 0,001 (***). Resultate Freilandfische Die dem Freiland entnommenen Fische zeigten Unterschiede im Stressproteingehalt abhängig von der Fischart, von dem Geschlecht der Tiere, von der Jahreszeit und Probestelle (Tab ). Schneider: Männliche Schneider wiesen unabhängig vom untersuchten Organ an der Probestelle P4 (Argen) höhere Hsp70-Level als an der Probestelle 3 (Schussen) auf. Weibliche Tiere zeigten nur in der Niere im Herbst einen signifikant erhöhten Stressproteingehalt an P4 (Abb ). Mit Ausnahme der Ovarien im Sommer, die in der Schussen einen höheren Hsp70-Wert aufwiesen als in der Argen lagen die Stressproteingehalte ansonsten in allen Organen auf vergleichbarem Niveau. Schneider aus der Argen zeigten tendenziell eher höhere Hsp70-Gehalte im Vergleich zu Artgenossen von der P3 an der Schussen. Döbel: Der Hsp70-Level in Niere, Kieme und Gonade von männlichen Döbeln lag unabhängig von der Jahreszeit an der Probestelle P4 (Argen) niedriger als an der Probestelle P3 (Schussen). Die Weibchen dieser Fischart zeigten allerdings ein konträres Bild: In allen untersuchten Organen von weiblichen Döbeln existierten Tendenzen zu höheren Stressproteingehalten an der Argen als an der Schussen. Allerdings wiesen die Ovarien im Herbst einen signifikant erhöhten Hsp70-Gehalt an der P3 im Vergleich zur Argen auf. Männliche Döbel zeigten tendenziell eher niedrigere Hsp70-Gehalte in der Argen im Vergleich zur P3 an der Schussen. Bei weiblichen Döbeln war die Tendenz, mit Ausnahme der Ovarien, eher umgekehrt. Generell lagen die Hsp70-Level in weiblichen Gonaden bei beiden Fischarten wesentlich niedriger als in männlichen Gonaden (Abb und ). 136

137 relativer Hsp70-Level Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) Tab : Relation der Stressproteingehalte von Freilandfängen zwischen Probestellen P3 und P4. : Hsp70-Wert an P4 höher als an P3, : Hsp70-Wert an P4 geringer als an P3, -: kein Unterschied; signifikante Unterschiede sind mit * (signifikant) bzw. ** (hoch signifikant) gekennzeichnet. Sommer Herbst Schneider Männchen Leber (*) Niere (*) Kieme - (*) Gonade (*) - Weibchen Leber - - Niere - (**) Kieme - - Gonade (**) Tendenzen Hsp70-Level an der P4 (Argen) höher als an der P3 (Schussen) Hsp70-Level im Sommer an der P4 niedriger als an der P3; im Herbst erhöht Döbel Männchen Leber - - Niere Kieme Gonade (**) (*) Weibchen Leber - Niere Kieme - Gonade (*) Hsp70-Level an der P4 niedriger als an der P3 Hsp70-Level an der P4 höher als an der P3; Ausnahme Gonade (Herbst) P4 P3 4 3 * ** Sommer Herbst Sommer Herbst Männchen Weibchen Abb : Hsp70-Level in Nieren von Schneidern in Abhängigkeit von der Jahreszeit 137

138 relativer Hsp70-Level relativer Hsp70-Level Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) P4 P3 4 3 * 2 ** Sommer Herbst Sommer Herbst Männchen Weibchen Abb : Hsp70-Level in Gonaden von männlichen und weiblichen Schneidern in Abhängigkeit von der Jahreszeit. P4 P ** * * Sommer Herbst Sommer Herbst Männchen Weibchen Abb : Hsp70-Level in männlichen und weiblichen Gonaden von Döbeln in Abhängigkeit von der Jahreszeit Bachforellen aus den Bypass-Systemen Die statistische Analyse der HSP70 Daten mittels Kruskal-Wallis Test zeigte für die Leberproben der in Gunzenhaus exponierten Bachforellen einen signifikanten Unterschied zur Kontrolle (p = , dargestellt in Abb ). Der Mittelwert des relativen HSP 70-Levels liegt für die Leber mit 4.65 im Vergleich zur Kontrolle mit nur 2.48 fast doppelt so hoch. Für alle anderen Organe zeigte sich weder in einem Vergleich untereinander noch im Vergleich mit der Kontrolle ein signifikanter Unterschied. Die für die Station Pflegelberg erzielten Ergebnisse entstammen einem einzigen überlebenden Tier und sind somit statistisch nicht verwertbar. 138

139 relativer HSP 70-Level Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) 8 7 * Kontrolle Gunzenhaus Pflegelberg Gonade Kieme Niere Leber Abb : Vergleich des Stressproteingehaltes aller Fischorgane. Bypass-Expositionen und Laborkontrolle (Kontrolle und Gunzenhaus n = 12, Pflegelberg n = 1) Diskussion Die Gehalte des Stressproteins Hsp70 indizieren proteotoxische Wirkungen, deren Ursache vielfältig sein kann. So können nicht nur Umweltchemikalien sondern auch z.b. jahreszeitlich spezifische Parameter für den Hsp70-Status verantwortlich sein. Ein starkes Ansteigen der Hsp70-Level im Frühjahr, sinkende Hsp70-Level im Sommer/Herbst und niedrigste Hsp70-Level im Winter konnten bei verschiedenen Fischarten beobachtet werden (Fader et al., 1994, Köhler et al. 2001). Im Untersuchungsfall traten jahreszeitliche Unterschiede in den untersuchten Proben nur in geringem Maße auf. Ein möglicher Grund dafür sind andere Stressoren (Chemikalien, Parasiten), die saisonale Unterschiede in den Hsp70-Leveln überlagern können (Eder et al. 2007). So waren an der Probestelle P3 gefangene Döbel wesentlich häufiger von Kratzern (Parasiten) befallen als Döbel an der Probestelle P4. Diese Infektion kann zu einer Erhöhung der Hsp70-Level in den Tieren an der Probestelle P3 führen. Auch die histologischen Untersuchungen der Döbel zeigten, dass Tiere an der Probestelle P3 deutlich mehr bzw. stärkere Schädigungen in den untersuchten Geweben aufwiesen als Tiere der Probestelle 4. Die höheren Hsp70-Gehalte in den Geweben von Döbeln an der Probestelle P3, vor allem die signifikanten Steigerungen in den Gonaden spiegeln das stärkere proteotoxisches Potential an der Schussen wider. Insbesondere männliche Döbel 139

140 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) weisen eine hohe Sensitivität für proteotoxische Wirkungen, bedingt durch die Situation in der Schussen auf. Die erhöhten Hsp70-Level in den Nieren und Lebern der Forellen aus Gunzenhaus zeigen ebenso eine im Vergleich zur Kontrolle starke proteotoxische Belastung nach Exposition gegenüber Wasser der Schussen an. Das einzige die Exposition überlebende Individuum aus der Station Pflegelberg (Argen) weist ähnliche Tendenzen auf. Demzufolge müssen auch für die Argen recht starke proteotoxische Potentiale angenommen werden. Diese Schlussfolgerung wird durch die für Schneider ermittelten Daten bestätigt. Im Kontrast zu Döbeln waren die Hsp70-Level in den untersuchten Organen der Schneider an der Probestelle P4 (Argen) deutlich höher als an der Probestelle P3 (Schussen). Somit ist von einer artspezifischen Reaktion auf proteotoxische Potentiale, die in Schussen und Argen von unterschiedlichen Stressoren herrühren (und somit auch unterschiedliche Fischarten jeweils unterschiedlich betreffen können), auszugehen. Da die histopathologischen Untersuchungen bei Döbel und Schneider gezeigt haben, dass die überwiegende Zahl der Organe zelluläre Reaktionen, jedoch keine schwerwiegenden Destruktionspozesse zeigten, ist nicht davon auszugehen, dass in den Flüssen abundante Individuen unter einer pathologische Überlastung des Stressproteinsystems (wie von Eckwert et al. (1997) beschrieben) leiden. Literatur Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, Eckwert H, Alberti G, Köhler H-R (1997): The induction of stress proteins (hsp) in Oniscus asellus (Isopoda) as a molecular marker of multiple heavy metal exposure. I. Principles and toxicological assessment. Ecotoxicology 6, Eder KJ, Köhler H-R, Werner I (2007): Pesticide and pathogen: Heat shock protein expression and acetylcholinesterase inhibition in juvenile Chinook salmon in response to multiple stressors. Environ. Toxicol. Chem. 26, Eder KJ, Leutenegger CM, Köhler H-R, Werner I (2009): Effects of neurotoxic insecticides on heatshock proteins and cytokine transcription in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Ecotox. Environ. Saf. 72, Fader SC, Yu Z, Spotila JR (1994): Seasonal variation in heat shock proteins (hsp 70) in stream fish under natural conditions. J. Therm. Biol. 19, Köhler H-R, Bartussek C, Eckwert H, Farian K, Gränzer S, Knigge T, Kunz N (2001): The hepatic stress protein (hsp70) response to interacting abiotic parameters in fish exposed to various levels of pollution. J. Aquat. Ecosys. Stress Recov. 8, Köhler H-R, Sandu C, Scheil V, Nagy-Petrica EM, Segner H, Telcean I, Stan G, Triebskorn R (2007): Monitoring Pollution in River Mures, Romania, Part III: Biochemical Effect Markers in Fish and Integrative Reflection. Environ. Monit. Ass. 127,

141 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Stressproteine Fische) Scheil V, Zürn A, Triebskorn R, Köhler H-R (2010): Embryo development, stress protein (Hsp70) responses and histopathology in zebrafish (Danio rerio) following exposure to nickel chloride, chlorpyrifos and binary mixtures of them. Environ Toxicol 25, Sørensen JG, Kristensen TN, Loeschcke V (2003): The evolutionary and ecological role of heat shock proteins. Ecol Lett 6, Kurzzusammenfassung: Stressproteinanalysen Proteotoxisch (Eiweiß-zerstörend) wirkende Stressoren sind sowohl in der Schussen als auch in der Argen vorhanden Vor allem männliche Döbel zeigen erhöhte Stressproteingehalte in der Schussen Weibliche Döbel und Schneider zeigen höhere Stressproteinlevel in der Argen (außer in der Gonade der weiblichen Döbel) Im Bypass an der Schussen exponierte Forellen zeigen im Vergleich zu Labortieren einen signifikant erhöhten Stressproteinlevel in der Leber; Auch ein überlebendes Tier an der Argen mit ähnlich hohem Hsp70-Level Unüblich für diesen Biomarker: Kaum saisonale Schwankungen Bearbeitung des Teilprojektes: Anja Henneberg, Lisa Hanslik, Prof. Dr. Heinz-R. Köhler, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; ; anja.henneberg@googl .com 141

142 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Histopathologie von Leber, Kieme und Niere bei Döbeln und Schneidern aus dem Freiland und Forellen aus den Bypass- Systemen Hintergrund und Zielsetzung Histopathologische Untersuchungen sind geeignet, den Belastungszustand von Gewässern zu bewerten, indem sie eine Aussage zum Gesundheitszustand von Fischen ermöglichen (Bernet et al., 1999). Sie sind etabliert im Gewässermonitoring (z.b. Schwaiger, 2001; Triebskorn et al. 2008) und wurden in der vorliegenden Studie eingesetzt, um Zusammenhänge zwischen dem Eintrag von Spurenstoffen über die Kläranlage Langwiese und gesundheitlichen Mängeln von (a) Freilandfischen (Döbel und Schneider) und (b) im Bypass geschlüpften bzw. exponierten Forellen herzustellen. Als zentrale Stoffwechselorgane der Fische werden Leber, Kieme und Niere untersucht. Methodik Histopathologisch untersucht wurden an Schussen und Argen entnommene Döbel (Leuciscus cephalus) und Schneider (Alburnoides bipunctatus) sowie in den Bypässen an Schussen und Argen exponierte juvenile Bach- und Regenbogenforellen. Fünf der in den Bypässen exponierten Gruppen an Bach-, bzw. Regenbogenforellen waren ab Schlupf exponiert, jeweils eine Gruppe an Bach- und Regenbogenforellen wurden nach Schlupf unter Kontrollbedingungen und anschließender Kontrollhälterung für 125 Tage (Bachforellen) bzw. 100 Tage (Regenbogenforellen) bis zur Präparation in den Bypässen gehalten. Unmittelbar nach Betäubung und Tötung der Fische wurden Leber, Niere, Kieme und Gonade (letztere s. Kap ) vor Ort im Freiland entnommen und sofort in 2% Glutardialdehyd (in 0,1 M Cacodylatpuffer, ph 7,6) fixiert. Im Labor wurden die Organe in 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen. Kiemen- und NIerenproben wurden in einem Gemisch aus konzentrierter Ameisensäure und 70%igem Ethanol entkalkt. Nach Entwässerung über eine aufsteigende Alkoholreihe wurden die Proben in Paraffin eingebettet. Von jedem Organ wurden Serien von 3 µm dicken Gewebeschnitten hergestellt, die mit Hämatoxylin-Eosin sowie PAS-Alcianblau angefärbt wurden. Die lichtmikroskopische Auswertung erfolgte qualitativ sowie semi-quantitativ, wobei eine Einteilung in die fünf in Tab beschriebenen Klassen vorgenommen wurde. 142

143 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Tab : Klassifikationskriterien für Kieme, Leber und Niere Klasse Kieme Leber Niere 1 Sekundärlamellen intakt, Pfeilerzellen und Pflasterzellen gut zu unterscheiden, Chloridzellen an der Basis der Sekundärlamellen, wenige Schleimzellen 2 < 20% Epithelablösung (epithel lifting), gering ausgeprägte Hypertrophie von Chloridzellen und/oder Pflasterzellen % Epithelablösung mit entzündlich-zelligen Infiltrationen, starke Hypertrophie von Chloridzellen und/oder Pflasterzellen, Fusion von Sekundärlamellen sehr helles Cytoplasma bei Männchen u. jungen Weibchen (bedingt durch hohen Glyco-gengehalt), leer erscheinende Cytoplasmaareale um basophile Cytoplasmabereiche bei reiferen Weibchen (Stadium 2) leicht dilatierte Kapillaren bei Männchen, kleine Entzündungsherde (z.t. um Gallencanaliculi) bei reifen Weibchen: Zellen mit sehr basophilem Cytoplasma, Zellkerne mit hypertrophen Nukleoli, bei Männchen dunklere Zellen (reduzierter Glycogengehalt), dilatierte Kapillaren und Interzellularen, Vakuolisierung des Cytoplasmas 4 < 20% Nekrosen < 5% Nekrosen, zahlreiche Entzündungsherde, sehr dunkle Zellen mit großen Interzellularen und stark erweiterten Kapillaren 5 > 20% Nekrosen > 5% Nekrosen, Karyolyse, starke Entzündungen, Gewebestruktur aufgelöst proximale Tubuli mit basophilem Cytoplasma und baso-median liegenden Zellkernen, distale Tubuli mit sehr hellem Cytoplasma und basal liegenden runden Zellkernen, gut strukturierte Glomeruli, hämato-poetisches Gewebe kompakt wenige Makrophagen v.a. zwischen Zellen der distalen Tubuli, erweiterte Interzellularen viele Makrophagen, hyalintropfige Proteinspeicherung in proximalen Tubuli, hämatopoetisches Gewebe reduziert, dilatierte Tubuli < 20% Nekrosen, sehr viele Makrophagen 20% Nekrosen, starke Lumendilatation Nachfolgend sind exemplarisch Bilder der drei o.g. Monitororgane gezeigt, die den Zustand der Organe in den Bewertungsklassen 1, 3 bzw. 5 illustrieren. 143

144 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Kontrollzustand (Klasse 1) der Leber eines Döbels Abb : Reaktionszustand (Klasse 3) der Leber eines Döbels Abb : Destruktionszustand (Klasse 5) der Leber eines Döbels 144

145 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Kontrollzustand (Klasse 1) der Kieme eines Döbels Abb : Reaktionszustand (Klasse 3) der Kieme eines Schneiders Abb : Destruktionszustand (Klasse 5) der Kieme eines Döbels 145

146 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Kontrollzustand (Klasse 1) der Niere eines Döbels: proximale Tubuli und Glomerulus (inlet) Abb : Reaktionszustand (Klasse 3) der Niere eines Döbels Abb : Destruktionszustand (Klasse 5) der Niere eines Döbels 146

147 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Resultate und Diskussion Freilandfische Leber Qualitative Beschreibung Der Zustand der Leber war sowohl bei Schneidern als auch bei Döbeln an P4 (Argen) besser als an P3 (Schussen unterhalb KA Langwiese). Die Zellen waren größer und der Gehalt an Glykogen war höher. Bei an der Schussen gefangenen Fischen konnten auch verstärkt cloudy swelling sowie bindegewebige Veränderungen im Lebergewebe festgestellt werden. Im Sommer gefangene Tiere waren zumeist im schlechteren Zustand als Tiere vom Herbst; die Zellkerne zeigten öfter Veränderungen und die Interzellularen waren stark erweitert. Semi-quantitative Bewertung Schneider Im Mittel waren die Lebern aller von in der Schussen gefangenen Schneidern in einem signifikant schlechteren Zustand als die Lebern der Tiere, die aus der Argen entnommen wurden. Dieser Unterschied lässt sich auf signifikant schlechtere Bewertungen bei denjenigen Tieren aus der Schussen zurückführen, die im Sommer gefangen wurden. Bei Tieren, die im Herbst bei kühleren Temperaturen entnommen wurden, trat dieser Unterschied nicht auf. Im Sommer wirkt die höhere Temperatur als zusätzlicher Stressor und kann ggf. in Kombination mit vermehrtem Schadstoffeintrag, z.b. aus der Landwirtschaft, zu stärkeren Effekten führen. Abb : Bewertung der Lebern von Schneidern gesamt 2009, 2010 und

148 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Bewertung der Lebern von Schneidern 2009, 2010 und 2011, getrennt nach Jahreszeiten Döbel Die Lebern der Döbel aus der Schussen waren insgesamt deutlich stärker geschädigt als die Lebern der Tiere aus der Argen, wobei in der Argen die Schädigungen im Sommer stärker ausfielen als im Herbst. Weshalb solche saisonalen Unterschied auftreten können, wurde bereits zuvor diskutiert. Abb : Bewertung der Lebern von Döbeln gesamt 2009, 2010 und

149 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Bewertung der Lebern von Döbeln 2009, 2010 und 2011 getrennt nach Jahreszeiten Kieme Qualitative Beschreibung Die Kiemen von Schneidern und Döbeln wiesen an P4 einen besseren Gesundheitszustand auf als an P3. An P3 kam es gehäuft zu Fusionen der Sekundärlamellen und Hyperplasien und Hypertrophien von Chlorid- und Pflasterzellen. Die Zahl der Schleimzellen war an P3 höher. An P4 konnten nur leichte Fusionen und leichte Hyperplasien und Hypertrophien von Chlorid- und Pflasterzellen beobachtet werden. Bei den Döbeln wiesen die Kiemen vom Herbst einen leicht besseren Zustand auf, da nur selten Fusionen der Sekundärlamellen auftraten, und die Hyperplasien und Hypertrophien von Chlorid- und Pflasterzellen nicht sehr stark ausgeprägt waren. Es traten weniger Schleimzellen, Aneurismen und Makrophagenaggregationen im Gewebe auf. Semi-quantitative Bewertung Schneider Die Kiemen der Schneider aus der Schussen zeigen leicht höhere Werte als die Kiemen der Schneider aus der Argen. Ein jahreszeitlicher Einfluss war hier nicht zu erkennen. Die Kieme ist das Organ, das als erstes mit Schadstoffen im Gewässer in Kontakt kommt. Zudem ist die Kieme im Gewässer zusätzlich Partikeln ausgesetzt. Bei starken Regenfällen kommt es zum Beispiel zu einer vermehrten Einschwemmung von Trübstoffen, welche die Kiemen schädigen können. Döbel Bei den Kiemen der Döbel lässt sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren aus der Schussen und den Tieren aus der Argen erkennen. In beiden Fällen treten deutliche Reaktionen sowie Schädigungen auf. Auch die Kiemen der Döbel sind an der Argen im 149

150 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Sommer stärker geschädigt als im Herbst, was o.g. Gründe haben kann. Abb : Bewertung der Kiemen von Döbeln 2009, 2010 und 2011 getrennt nach Jahreszeiten Niere Qualitative Beschreibung Der Gesundheitszustnd der Niere war sowohl bei Schneidern als auch bei Döbeln an der Probestelle P4 an der Argen besser als an der Probestelle P3 an der Schussen: es waren insgesamt weniger Makrophagen in den Tubuli zu finden, die Tubuli selbst waren weniger stark dilatiert und es traten so gut wie keine Vakuolisierungen auf. Bei den Döbeln, die im Herbst gefangen wurden, waren stärkere Schäden zu beobachten als bei Döbeln vom Sommer: es traten häufig Nekrosen und hyalintropfige Degenerationen in den Tubuli auf. Semi-quantitative Bewertung Schneider Die Untersuchung der Nieren der Schneider zeigte einen nur geringen jahreszeitlichen Einfluss. Dabei waren tendenziell die Organe im Herbst in einem besseren Zustand als im Sommer. Gemittelt erscheint die Struktur der Nieren der Tiere aus der Argen intakter als diejenige der Nieren der Schneider, die aus der Schussen gefangen wurden, wobei dieser Unterschied sehr gering ausfällt. Döbel Der Zustand der Nieren bei den Döbeln ist an der Argen signifikant intakter (niedrigerer Bewertungsstatus) als an der Schussen. Die für Kiemen und Lebern beobachtete Saisonalität ist für die Niere nicht feststellbar. 150

151 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Abb : Bewertung der Nieren von Döbeln gesamt 2009, 2010 und 2011 Forellen Bypass Es wurden insgesamt fünf Gruppen Bachforellen und drei Gruppen Regenbogenforellen untersucht: Drei Gruppen Bachforellen und zwei Gruppen Regenbogenforellen wurden nach dem Schlupf in den Bypass-Systemen dort weiter exponiert. Jeweils eine Gruppe Bach- und eine Gruppe Regenbogenforellen wurden nach dem Schlupf unter Kontrollbedingungen und anschließender Kontrollhälterung für 125 Tage (Bachforellen) bzw. 100 Tage (Regenbogenforellen) bis zur Präparation in den Bypässen gehalten. Kontrolltiere wurden jeweils im Labor gehalten. Die Ergebnisse der histologischen Auswertung sind in Tab zusammengefasst. Insgesamt zeigten sich durchgehend sehr deutliche Unterschiede zwischen den Kontrolltieren und den an der Schussen exponierten Fischlarven. Die stärksten Effekte traten jeweils in der Leber der Tiere, aber auch in der Niere auf. Reaktionen von Tieren, die an der Argen exponiert waren, waren meist weniger stark ausgeprägt als bei Tieren, die in Schussenwasser gehalten wurden. Unterschiede zu Kontrolltieren waren dennoch häufiger zu beobachten. Bei Bachforellen waren die Reaktionen von in den Bypässen geschlüpften Tieren deutlicher als bei Fischlarven, die im Labor geschlüpft und danach im Bypass exponiert wurden. Dies war sowohl an der Schussen als auch an der Argen der Fall. Regenbogenforellen, die im Bypass geschlüpft waren, zeigten vorwiegend an der Schussen deutliche Effekte. Bei Regenbogenforellen, die im Labor geschlüpft waren, traten an Schussen und Argen sehr starke Reaktionen vor allem in der Leber auf. 151

152 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Tabelle : Zusammenfassung histopathologischer Effekte bei juvenilen Forellen, die in den Bypass-Systemen exponiert wurden. Unterschiede zu den Kontrollwerten wurden auf der Basis der nachfolgenden Signifikanzniveaus gekennzeichnet: 0,01 < p 0,05: schwach signifikant: * 0,001 < p 0,01: signifikant: ** p 0,001: hoch signifikant: *** Tendenzen, die nicht signifikant waren, wurden mit "o" gekennzeichnet. Fehlende Unterschiede zur Kontrolle wurden durch "/" gekennzeichnet SCHLUPF IM BYPASS Fischart Alter Expositionszeit Organ Argen Schussen Bachforelle 80 d 80 d Leber * ** Niere * ** 120 d 120 d Leber o o Kieme ** ** Niere o ** 218 d 218 d Leber / o Kieme o o Regenbogenforelle 60 d 60 d Leber / * Niere o * 189 d 189 d Leber / ** Kieme * * Niere / o SCHLUPF IM LABOR Fischart Alter Expositionszeit Organ Argen Schussen Bachforelle 185 d 58 d Leber / * Kieme / o Regenbogenforelle 161 d 58 d Leber ** *** Kieme / * Korrelationsanalysen erbrachten, dass bei Bachforellen der Schädigungsgrad der Kieme sowohl an Schussen als auch an Argen positiv mit dem Alter der Tiere (p<0,05), nicht aber mit der Expositionszeit korreliert ist. Die Schädigung der Leber korreliert bei Bachforellen weder an Schussen noch an Argen mit dem Alter, allerdings an der Schussen negativ mit der Expositionszeit. Dies kann für eine physiologische Anpassung der Tiere an die belastete Situation über die Zeit sprechen, vor allem bei solchen Tieren, die im Bypass geschlüpft sind. Es ist allerdings zu berücksichtigen, dass die Mortalität in diesem Experiment an der Schussen relativ hoch war, und nur die Werte für wenige überlebende Tiere in die Korrelationsanalyse eingingen. Bei Regenbogenforellen zeigte sich im Gegensatz zu den Bachforellen für die Leber, dies allerdings nur an der Schussen, eine positive Korrelation zwischen Schädigungsgrad und Alter (p<0.001) sowie zwischen Schädigungsgrad und Expositionszeit (p<0.01). 152

153 Toxische Potentiale und Wirkungen: (Histopathologie Fische ) Literatur Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. (1999). Histopathology in fish: proposal for a protocol to assess aquatic pollution. J. Fish Dis. 22(1): Schwaiger, J. (2001). Histopathological alterations and parasite infection in fish: indicators of multiple stress factors. J. Aquat. Ecosyst. Stress Recov. 8: Triebskorn, R., Sandu, C., Telcean, I., Casper, H., Farkas, A., Colarescu, O., Dori, T., Köhler, H.-R. (2008). Monitoring Pollution in River Mures, Romania, Part II: Metal accumulation and histopathology. Environ. Monit. Ass. 141: Kurzzusammenfassung: Histopathologie Fische Histopathologische Effekte bei Freilandfischen und bei im Bypass exponierten Tieren an der Schussen deutlich stärker als an der Argen Meist in allen Organen von Freilandfischen, auch bei Fischen aus der Argen, kein unbelasteter Zustand nachweisbar Deutlichere Unterschiede bei im Bypass-exponierten Tieren als bei Freilandfischen Deutlichere Effekte bei Döbeln als bei Schneidern Stärkste Reaktionen in der Leber der Fische Bearbeitung des Teilprojektes: Diana Maier, Paul Thellmann, Physiologische Ökologie der Tiere, Universität Tübingen, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; maierdiana@gmx.de. 153

154 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor Entwicklungstoxische Potentiale: Embryotests mit dem Zebrabärbling (Danio rerio) Einleitung Der Embryotest mit dem Zebrabärbling, Danio rerio, gilt als Standardtest zur Ermittlung toxischer Potentiale. Er wurde für wässrige Proben von Nagel (2002) als DarT entwickelt und unter DIN T 6 (Ausgabe 2003, gültig ab ) (DIN 2003) sowie der OECD Guideline 210 (OECD 1992) standardisiert. Seine Anwendung auf Sedimente erfolgt nach der Modifikation nach Hollert et al. (2003). Befruchtete Eier des Zebrabärblings werden unter konstanten Bedingungen in Petrischalen kultiviert und die Embryonalentwicklung lichtmikroskopisch verfolgt. Eine Verlängerung des eigentlichen Tests über den Schlupfzeitpunkt der Tiere hinaus hat sich aufgrund langjähriger Erfahrungen als günstig erwiesen. So können beispielsweise toxische Potentiale detektiert werden, da nach dem Schlupf die protektive Wirkung des Chorions wegfällt. Zu definierten Zeitpunkten werden üblicherweise folgende Endpunkte ermittelt: Koagulation der Eier, Epibolie, vollständige Gastrulation, Formation der Somiten, Strecken ( Ablösung ) des Schwanzes, Auftreten spontaner Kontraktionen des Embryos, Augenausbildung und Augendefekte, Herzschlagfrequenz, Bildung von Otolithen und Melanozyten, Ödeme des Dottersacks / des Herzens / des Kopfes und Schlupfrate sowie (nach dem Schlupf) Missbildungen der Augen, des Schwanzes und der Flossen, Wirbelsäuleverkrümmungen und Fehler in der Pigmentierung. Methodik Eier des Zebrabärblings (Danio rerio) wurden direkt nach der Befruchtung gegenüber Sediment und Oberflächenwasser von Argen und Schussen und gegenüber Wasser der Kläranlagen Langwiese und Eriskirch exponiert. Über einen Untersuchungszeitraum von i.d.r. 96 Stunden wurden verschiedene letale und subletale Endpunkte bestimmt, wie beispielsweise Mortalität, Entwicklungsgeschwindigkeit, Herzschlagrate, Fehlbildungen und Schlupf. Diese Endpunkte geben Hinweise auf embryotoxische Wirkungen der Proben.. Resultate Die Resultate sind nachfolgend in Grafiken, welche die Resultate aller Embryotests enthalten, zusammengefasst. 154

155 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor Herzschlagrate Die Herzschlagrate war zu allen Probenahmezeitpunkten bei den Embryonen, die gegenüber Sediment und Wasser der Probestelle 6 (Schussenmündung) exponiert waren, signifikant gegenüber der Kontrolle erniedrigt. Abb. 1 zeigt deutlich, dass auch bei Embryonen, die gegenüber Wasser und Sediment von Probestelle 3 (unterhalb KA) und gegenüber den Abläufen der KA Langwiese und Eriskirch exponiert waren, vereinzelt stark erniedrigte Herschlagraten auftraten Herzschläge/min Kontrolle PS0 PS3 PS4 PS6 KA Langw KA Erisk Probestelle Abb : Herzschlagfrequenz 48 h nach der Fertilisation. Exposition gegenüber der Proben der Probenstelle 4 (Argen), 0, 3, 6 (Schussen) und der Kläranlagen Eriskirch und Langwiese. Die Daten sind als Boxplot dargestellt, wobei die grauen Bereiche folgende Perzentile darstellen: 25% (unteres Ende), 50% = Median (horizontale Linie) und 75% (oberes Ende). Die Whiskers oberhalb und unterhalb der grauen Boxen zeigen das 90% und das 10% Perzentil. Die Punkte zeigen Extremwerte außerhalb des 10% bzw. des 90% Perzentils an. n = 22 (KW), n = 4 (P0), n=17 (P3), n = 18 (P4), n = 15 (P6), n = 15 (KA Eriskirch und KA Langwiese). Mortalität Die Mortalität war zu allen Probenahmezeitpunkten bei den Embryonen, die gegenüber Sediment und Wasser der Probestelle 6 (Schussenmündung) exponiert waren, am höchsten und erreichte in Einzelfällen bis zu 70% der exponierten Embryonen. Bei den restlichen Ansätzen trat keine erhöhte Mortalität auf. 155

156 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor 80 Mortalität zum Versuchsende [%] Kontrolle PS0 PS3 PS4 PS6 KA Langw KA Erisk Probestelle Abb : Mortalität der Embryonen in % am Ende des Tests (96h nach Befruchtung). Exposition gegenüber den Proben der Probenstelle 4 (Argen), 0, 3, 6 (Schussen) und der Kläranlagen Eriskirch und Langwiese. Die Daten sind als Boxplot dargestellt, wobei die grauen Bereiche folgende Perzentile darstellen: 25% (unteres Ende), 50% = Median (horizontale Linie) und 75% (oberes Ende). Die Whiskers oberhalb und unterhalb der grauen Boxen zeigen das 90% und das 10% Perzentil. Die Punkte zeigen Extremwerte außerhalb des 10% bzw. des 90% Perzentils an. n = 22 (Kontrolle), n = 4 (P0), n=17 (P3), n = 18 (P4), n = 15 (P6), n = 15 (KA Eriskirch und KA Langwiese). Schlupfrate Die Schlupfrate war zu allen Probenahmezeitpunkten bei den Embryonen, die gegenüber Sediment und Wasser der Probestelle 6 (Schussenmündung) exponiert waren, signifikant erniedrigt. In vielen Fällen kam es zu keinem Schlupf. In sehr wenigen Fällen kam es auch bei der Exposition gegenüber den Abläufen der KA Langwiese und Eriskirch zu stark vermindertem Schlupferfolg. 156

157 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor 120 Schlupferfolg zum Versuchsende [%] Kontrolle PS0 PS3 PS4 PS6 KA Langw KA Erisk Probestelle Abb : Schlupfrate in % der überlebenden Embryonen zum Ende des Tests (96h nach Befruchtung). Exposition gegenüber den Proben der Probenstelle 4 (Argen), 0, 3, 6 (Schussen) und der Kläranlagen Eriskirch und Langwiese. Die Daten sind als Boxplot dargestellt, wobei die grauen Bereiche folgende Perzentile darstellen: 25% (unteres Ende), 50% = Median (horizontale Linie) und 75% (oberes Ende). Die Whiskers oberhalb und unterhalb der grauen Boxen zeigen das 90% und das 10% Perzentil. Die Punkte zeigen Extremwerte außerhalb des 10% bzw. des 90% Perzentils an. n = 22 (KW), n = 4 (P0), n=15 (P3), n = 18 (P4), n = 14 (P6), n = 14 (KA Eriskirch und KA Langwiese). Entwicklungsdefizite In allen Testansätzen traten bei geschlüpften Embryonen, die gegenüber Sediment und Wasser der Probestelle 6 (Schussenmündung) exponiert waren, sehr viele Entwicklungsdefizite (keine Somiten, keine Augenbildung, keine spontanen Kontraktionen, keine Schwanzablösung) auf. Auch bei Embryonen, die im Ansatz P3 (Wasser und Sediment von unterhalb der KA Langwiese) gehalten wurden sowie in den Ansätzen P4 (Argen) waren zeitweise zwischen 40% und 60% Entwicklungsdefizite zu beobachten. 157

158 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor Entwicklungsdefizite 24h nach Befruchtung Kontrolle PS0 PS3 PS4 PS6 KA Langw KA Erisk Probestelle Abb : Einfluss aller Wasser- und Sedimentproben der untersuchten Probestellen 4 (Argen), 0, 3, 6 (Schussen) und der Kläranlagen Eriskirch und Langwiese auf die Entwicklung der Embryonen 24h nach Befruchtung. Beobachtete Endpunkte: keine Somiten, Augenbildung, spontanen Kontraktionen, Schwanzablösung. Die Daten sind als Boxplot dargestellt, wobei die grauen Bereiche folgende Perzentile darstellen: 25% (unteres Ende), 50% = Median (horizontale Linie) und 75% (oberes Ende). Die Whiskers oberhalb und unterhalb der grauen Boxen zeigen das 90% und das 10% Perzentil. Die Punkte zeigen Extremwerte außerhalb des 10% bzw. des 90% Perzentils an. n = 11 (Kontrolle), n = 1 (P0), n = 9 (P3, P4, P6, KA Eriskirch und KA Langwiese). Diskussion Drastische Effekte wurden v.a. bei Exposition der Embryonen gegenüber Proben von der Schussenmündung beobachtet. Dort ist die Belastung so groß, dass die Entwicklung derart stark verzögert wird, so dass sich die Embryonen nach ca. 48h in einem Entwicklungsstadium befinden, welches normalerweise nach 12 h erreicht wird. Auch die Mortalität, die Reduktion der Herzschlagrate und Entwicklungsdefizite sind an dieser Probestelle deutlich höher als bei Kontrollen und bei den anderen Ansätzen. Die Proben von der Schussenmündung stehen unter dem direkten Einfluss der Kläranlage Eriskirch und Wasser aus dem Bodensee, das in den Mündungsbereich zurückdrückt, so dass sich hier feinpartikuläres Sediment ansammelt, an das Schadstoffe adsorbiert werden können. Die Stärke der Effekte in den übrigen Ansätzen variiert stark zwischen den einzelnen Entnahmezeitpunkten. Die meiste Effekte wurden für Proben der Probenahme D festgestellt. Möglicher Grund hierfür ist, dass die Probenahme direkt nach einem Hochwasserereignis 158

159 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Zebrabärbling im Labor stattfand und es dadurch zu einem erhöhten Eintrag von Abwasser/Rohabwasser durch das RÜB und die Kläranlage Eriskirch kam. Literatur Hollert, H., Keiter, S., König, N., Rudolf, M., Ulrich, M., Braunbeck, T. (2003). A new sediment contact assay to assess particle-bound pollutants using zebrafish (Danio rerio) embryos. J. Soils Sed. 3: Nagel, R. (2002). DarT: The embryo test with the Zebrafish Danio rerio--a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX.19(1): Kurzzusammenfassung: Embryotests mit dem Zebrabärbling Nach Exposition von Eiern des Zebrabärblings gegenüber Wasser und Sediment der Schussenmündung (P6) waren bei allen Tests sehr starke embryotoxische Effekte nachweisbar Nach Exposition gegenüber Ablauf der KA Langwiese und Eriskirch zeigten sich in den meisten Fällen geringe Effekte, in Einzelfällen zeigte sich jedoch eine deutliche Beeinflussung der Herzschlagrate und der Schlupfrate Nach Exposition gegenüber Wasser und Sediment der Probestellen P3 (Schussen unterhalb der KA Langwiese) und P4 (Argen) traten oft geringe Effekte auf, teilweise zeigte sich aber auch eine Beeinflussung der Herzschlagrate (P3) sowie vermehrt Entwicklungsdefizite (P3 und P4) Bearbeitung des Teilprojektes: Carolin Schultz, Marlene Langjahr, Anja Henneberg, Dr. Raphaela Osterauer, Physiologische Ökologie der Tiere, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; raphaela.osterauer@gmx.de. 159

160 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass 4.4.8: Entwicklungstoxische Wirkungen: Embryotests mit Forellen in den Bypass-Systemen Hintergrund Im Zusammenhang mit weltweiten Berichten über Rückgänge von Salmonidenbeständen, z.b. Lachs, Bachforellen oder Äschen (Noakes et al., 2000; Burkhardt-Holm, 2009) haben Tests, durch welche entwicklungstoxische Wirkungen bei Fischen im Freiland überprüft werden können, zusehends Bedeutung erlangt. In diesem Zusammenhang haben sich Embryotests mit Forellen in Mesokosmen in der Vergangenheit bereits als sehr geeignet erwiesen, den Einfluss anthropogener Stoffe auf Entwicklungsprozesse dieser Fische zu bewerten (Luckenbach et al., 2003). ELS-(early life stage) Tests stellen generell eine Alternative zu akuten und chronischen Fischtests dar (Braunbeck 2006). In vielen Fällen zeigen larvale und juvenile Entwicklungsstadien von Fischen eine sehr viel größere Sensitivität gegenüber Giftstoffen im Wasser als adulte Tiere (Woltering 1985, zitiert in McKim et al. 1975, Eaton 1974); Subletale Effekte können so sensitiver erfasst werden. ELS- Tests zeichnen sich im Vergleich zu FFLC-Tests (fish full life-cycle tests) zudem durch einen geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand aus, während sie trotzdem robuste Voraussagen zur Toxizität zulassen (Luckenbach et al. 2001; Leeuwen 1989, zitiert in McKim 1985). Methodik Der in diesem Projekt durchgeführte Embryotest ist angelehnt an den Fish-Early-Life Stage Toxicity Test OECD-Guideline 210, mit Abwandlungen, um den Test im Freiland durchführbar zu machen. Die beobachteten Endpunkte waren: Mortalität Augenpunktbildung Schlupf Herzschlagrate (eine Woche nach dem Schlupf) Die Tests sollten ursprünglich ausschließlich mit Bachforellen durchgeführt werden. Da im Januar 2011 zum Zeitpunkt der Fertigstellung der Bypass-Systeme allerdings nur noch einmal Bachforelleneier bezogen werden konnten, wurden parallel Tests mit Regenbogenforelleneiern durchgeführt. 160

161 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass In der Expositionsperiode Januar April 2011 (genannt 2011 ) wurden am je Bypass 360 frisch befruchtete Bachforelleneier eingesetzt. Am wurden je 300 Regenbogenforelleneier eingesetzt. Im Labor wurde stets die gleiche Anzahl an Eiern exponiert. In der Expositionsperiode Dezember April 2012 (genannt 2012 ) wurde nur mit Bachforelleneiern gearbeitet. Am wurden je Station und ebenfalls im Labor 600 Bachforelleneier eingesetzt. In den beiden Bypass-Stationen wurden jeweils zwei 250 Liter Wasser fassende Becken für den Embryotest betrieben, wobei 2012 je in einem Becken das Flusswasser auf 8 C temperiert und das andere von Rohflusswasser durchflossen war. Der Parallelansatz mit beheizten und unbeheizten Becken war deshalb notwendig, weil unterschiedliche Temperaturen die Entwicklungsgeschwindigkeit von Fischen maßgeblich beeinflussen. Durch den Abgleich der in den unbeheizten Systemen erzielten Resultate mit den Ergebnissen aus den beheizten Aquarien ist es möglich, den Einfluss der Temperatur auf die Untersuchungsparameter zu ermitteln bzw. die erzielten Werte auf vergleichbare Temperaturen hochzurechnen, so dass dieser Parameter am Ende als Einflussfaktor ausgeschlossen werden kann. Ein kontinuierlicher Durchfluss in den Expositionsbecken gewährleistete die optimale Versorgung der Forelleneier mit frischem sauerstoffreichen Flusswasser. Im Labor wurden die Eier in 250L-Becken in aufbereitetem Leitungswasser bei ebenfalls einer Wassertemperatur von 8 C bzw. 6 C gehältert. Die frisch befruchteten Forelleneier (Bachforellen- und Regenbogenforelleneier, Fischzucht Störk, Bad Saulgau) wurden innerhalb von 3 Stunden nach dem Abstreifen in die Expositionssiebe in den Aquarien der Bypass-Stationen an Argen bzw. Schussen und im Labor eingesetzt. Pro Becken wurden 300 Eier, aufgeteilt auf sechs Siebeinrichtungen exponiert. Ein Versuch zur Bestimmung der Befruchtungsrate wurde zusätzlich mit 200 Eiern im Labor durchgeführt. Eine Kontrolle der Eier erfolgte alle zwei bis drei Tage. Um eine Ausbreitung von Pilzbefall unter den Eiern zu verhindern, war es essentiell, tote Eier bzw. Tiere sofort zu entfernen. Kriterien für den Tod waren nach OECD Richtlinie 210 (OECD ) abhängig vom Entwicklungsstadium (Eier: Trübung und Verfärbung des Eies; Embryonen: keine Bewegung im Ei und/oder fehlender Herzschlag; Larven und juvenile Fische: Immobilität und/oder keine Reaktion auf mechanische Reizung). 161

162 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Abb : Unbefruchtetes (links) und befruchtetes (rechts) Bachforellenei, Embryonen beim Schlüpfen und bereits geschlüpfte Bachforellenlarven mit Dottersack (von links nach rechts). Ergebnisse und Diskussion Die großen zeitlichen Unterschiede in der Entwicklung der Forellen 2011 sind vor allem auf die Temperaturunterschiede zurückzuführen. Die durchschnittliche Wassertemperatur der Argen war im im Extremfall bis zu 5 C niedriger als die der Schussen. Im Labor betrug sie 8 C. Um die Daten dennoch miteinander vergleichen zu können, wurden sie mit Eichwerten bzw. Modellen zur Entwicklungsgeschwindigkeit von Forellen bei verschiedenen Temperaturen aus der Literatur (Jungwirth & Winkler, 1984; Ojanguren & Brana, 2003) verrechnet. Um den Einfluss der Temperatur auch experimentell ermitteln zu können, wurde 2012 je ein Becken an den Bypass-Stationen mit einer Heizeinrichtung ausgestattet, welche eine Erwärmung des Flusswassers auf 8 C gewährleistete. Allerdings trat während der Exposition der Eier ein extremes, mehr als einen Monat andauerndes Dauerhochwasser an Schussen und Argen auf, während dessen die Pumpen nicht funktionierten und im Zuge dessen auch die Elektronik und damit verbunden die Temperatursensoren und -logger in den Testsystemen ausfielen, so dass für diese Zeit nur punktuelle Messwerte für die Temperatur vorliegen. Mortalität Die Mortalität unterschied sich im Jahr 2011 bei den Bachforellen zwischen den Bypässen und der Kontrolle kaum. Der durchgeführte Befruchtungsversuch (s. Abschnitt Schlupferfolg ) ergab, dass eine Mortalität von 12% durch unbefruchtete Eier zu erklären ist. Die Mortalitätsrate an der Argen war mit ca. 25% am höchsten. Die Mortalitätsraten in der Schussen betrug 16%, die im im Labor 20%. Eine Ursache für die höhere Mortalität an der Argen könnte ein kurzzeitiger Ausfall der Bypass-Anlage sein, in welchem die Wassertemperaturen sehr gering waren, was laut Ojanguren et al. (2003) zu einer höheren Mortalität führen kann. 162

163 kumulative Mortalität [%] kumulative Mortalität [%] Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Mit einer Befruchtungsrate von nur 50% waren die Ergebnisse, die sich aus den Tests mit den Regenbogenforelleneiern ergaben, nicht valide. Die hohen und gleich ansteigenden Mortalitätsraten in den 3 Gruppen (Abb ) zeigen keine Unterschiede und sind auf die niedrige Befruchtungsrate zurückzuführen Labor Argen Schussen Jan Feb Mrz Abb : Kumulative Mortalität der Bachforellen aus dem Jahr 2011 (n=360). 12% der Eier unbefruchtet Labor Argen Schussen Feb Mrz Abb Kumulative Mortalität der Regenbogenforellen aus dem Jahr 2011 (n=300). 50% der Eier unbefruchtet. 163

164 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Im Jahr 2012 war in den unbeheizten Becken an den Bypass-Stationen an Schussen und Argen die Gesamtsterblichkeit, verglichen mit den beheizten Becken, leicht erhöht (Abb und 5). Ebenso verhielt es sich im Vergleich zur Laborkontrolle, die konstant bei 8 C gehalten wurde. Insgesamt machen konstante Temperaturen in jeweils einem Becken der Bypässe den Versuch kontrollierbarer und lassen einen direkten Vergleich mit den Laborkontrollen zu. Die harten Witterungsbedingungen, mit bis zu -20 C Außentemperatur und Hochwasser, machten Anfang Februar 2012 allerdings für einen Zeitraum von ungefähr einem Monat den Betrieb der Anlage unmöglich, d.h. für diesen Zeitraum war aufgrund des fehlenden Wasserdurchflusses kein Beheizen der Becken möglich. Der klare Anstieg der Mortalität im unbeheizten Becken an der Argen (Abb ) stellt den Beginn eines größeren Ausfalls, vermutlich aufgrund größerer Schwankungen in der Wassertemperatur bei Wiederinbetriebnahme der Anlage dar. Die Ergebnisse der Mortalitätsraten aus den Jahren 2011 und 2012 weisen auf eine erhöhte Embryotoxizität in der Argen hin. Da es in den beiden Jahren zu einem Ausfall der Pumpen an den Bypässen kam, sollte diese Tendenz durch weitere Untersuchungen überprüft werden. Schlupf 100% Abbildung : Kumulative Mortalität bei Bachforellen aus dem Jahr 2012 (beheiztes Flusswasser, Laborkontrolle 8 C, n=600). 9,5% der Eier unbefruchtet. 164

165 Kumulatiive Mortalität Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Laborkontrolle Argen(unbeheizt) Schussen(unbeheizt) 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Schlupf 100% Jan Feb Mrz Apr Expositionszeit [Tage] Abbildung : Kumulative Mortalität der Bachforellen aus dem Jahr 2012 (unbeheiztes Flusswasser, Laborkontrolle 8 C, n=600). 9,5% der Eier unbefruchtet. Schlupfzeitpunkt In Tabelle sind die Temperaturmittelwerte von Labor, Schussen und Argen sowie die Anzahl der Tage, die bis zum 50%igen Schlupf der Embryonen vergingen, angegeben. Da die durchschnittliche Wassertemperatur deutlich variierte, wurden mit 3 verschiedenen Modellen die erwarteten Zeitpunkte bestimmt, an denen 50% der Embryonen geschlüpft sein sollten. Das Modell 2 von Elliott (aus Ojanguren 2003) sagt bei einer Temperatur von 7,9 C eine Dauer von 49 Tagen bis zum Schlupf von 50% der Embryonen vorher. Dies bestätigte sich im Laborversuch, weshalb dieses Modell für die Berechnung der Erwartungswerte in den Flüssen als das am besten geeignete ausgewählt wurde. Die Bachforellen an der Argen waren nach 79 Tagen zu 50% geschlüpft, wohingegen das Modell 77 Tage voraussagte. An der Schussen wurde nach 74 Tagen der Schlupf von 50% der Embryonen beobachtet, während das Modell 77 Tage vorhersagte. Die Forellen an der Argen schlüpften somit etwas später, diejenigen an der Schussen geringfügig früher als im Modell Ojanguren (2003) vorausgesagt wird. Die beiden anderen Modelle (Tab , Modell 2 und 3) prognostizieren einen späteren Schlupf was implizieren würde, dass die Tiere an beiden Flüssen verfrüht geschlüpft wären. Da die Modelle nur für Bachforellen entwickelt wurden, und die Regenbogenforellen sich natürlicherweise deutlich schneller entwickeln (s. Tabelle ), konnten die Werte für Regenbogenforellen nicht gegen die Modell-Werte geeicht werden. Da allerdings die Durchschnittstemperatur im Labor (6,7 C) und in der Schussen (6,78 C) fast identisch 165

166 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass waren, können diese beiden Datensätze direkt miteinander verglichen werden: Die an der Schussen exponierten Regenbogenforellen schlüpften 3 Tage früher (Labor 52d, Schussen 49d). Generell schlüpften die exponierten Forellen tendenziell an der Schussen früher, während an der Argen eine leichte Verzögerung des Schlupfes festgestellt werden konnte. Ein verzögerter Schlupf spricht eher für eine erste Reaktion auf moderaten, ein frühzeitiger Schlupf für eine Reaktion auf stärkeren Umweltstress. Die Zeitpunkte, zu denen (1) das Augenpunktstadium erreicht war, (2) der Schlupf erfolgte (3) der Herzschlag gemessen wurde, sind in Tab und zusammengefasst. Tab : Vergleich der beobachteten 50%-Schlupfzeitpunkte aus dem Jahr 2011 mit drei Modellen, die bei Jungwirth & Winkler (1984) und Ojanguren & Brana (2003) beschrieben sind. Labor Tag (d) Modell 1 Modell 2 Modell 3 Temp. C Schlupf= 50% Bachforellen 7,90 49d 55d 49d 53d Regenbogenforellen 6,70 52d Schussen Temp. C Bachforellen 5,56 74d 81d 77d 78d Regenbogenforellen 6,78 49d Argen Temp. C Bachforellen 5,61 79d 81d 77d 78d Regenbogenforellen 5,96 53d Schlupferfolg Zur Kontrolle des Befruchtungserfolgs wurde 2012 im Labor ein Befruchtungsversuch mit 100 Eiern durchgeführt. Dieser ergab einen Befruchtungserfolg von 90,5 %. Auf dieser Basis war im optimalen Fall eine Schlupfrate von ebefalls 90,5 % zu erwarten. Wie Abb zeigt, lag die Schlupfrate 2012 im Labor bei 86 %, d.h., sehr sehr nahe am Optimum. An den Bypass-Stationen an Schussen (76%) und Argen (74-78%) war der Schlupferfolg 2012 sehr ähnlich und verglichen mit der Laborkontrolle (86%) deutlich verringert (Abb ). Der Schlupferfolg im beheizten Becken an der Argen war etwas höher (78%) als im unbeheizten Becken (74%). Die geringen Unterschiede zwischen den beheizten und unbeheizten Becken sind auf den Stillstand der Bypass-Stationen 2012 durch harte Witterungsbedingungen zurückzuführen. Die Becken konnten für ca. einen Monat nicht beheizt werden und waren von der Umgebungstemperatur abhängig. Die hohen Temperaturschwankungen in den Bypass-Stationen könnten so, neben Schadstoffbelastungen in den Gewässern, dazu geführt haben, dass der Schlupferfolg in den Bypässen geringer war als im Labor. 166

167 Schlupferfolg [%] Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Becken 5 Becken 6 Becken 2 (beheizt) Becken 3 Becken 2 (beheizt ) Laborkontrolle Argen Schussen Becken 3 Abb : Schlupferfolg in der Laborkontrolle und den beiden Bypass-Stationen (je Becken n=300). Herzschlagrate Um die Herzschlagraten der juvenilen Forellen zwischen den Flüssen vergleichen zu können, müssen diese bei gleichen Temperaturen gemessen werden. Der Grund hierfür ist die Ektothermie von Fischen, die dazu führt, dass die Herzschlagrate der Tiere stark von ihrer Umgebungstemperatur abhängig ist. Zum Zeitpunkt der Messung waren 2011 die Pumpen an den Bypass-Stationen ausgefallen, so dass deutliche Temperaturunterschiede zwischen den Aquarien auftraten (6-13 C). Daraufhin wurde im Sommer 2011 im Labor ein Temperaturversuch durchgeführt, in welchem die Herzschlagraten bei verschieden Temperaturen gemessen wurden. Mit den erhaltenen Werten und einer daraus resultierenden Eichgerade können theoretisch zu erwartende Herzschlagraten bei verschiedenen Temperaturen berechnet werden. Weichen der theoretische Wert und der gemessene Wert stark voneinander ab, ist davon auszugehen, dass weitere Parameter, wie beispielsweise Chemikalien die Herzschlagraten beeinflussen. In Abb sind die Herzschlagraten der Laborkontrolle und der exponierten Forellen aus den Bypässen dargestellt. Es ist zu erkennen, dass diese im Vergleich zu den theoretisch ermittelten Werten an den Flüssen Schussen und Argen im Jahr 2011 deutlich erhöht waren. Dies war im Jahr 2012 lediglich andeutungsweise im beheizten Becken an der Schussen der Fall. In den restlichen Ansätzen war die herzschlagrate im Vergleich zum Modell eher erniedrigt. Auch bei den Laborkontrollen lagen die Herzschlagraten etwas höher als das Modell voraussagte. Allerdings ist die Differenz zwischen gemessenem und theoretischem Wert im 167

168 Herzschlagrate [Schläge/min] Herzschlagrate [Schläge/min] Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Labor gering, was für ein gutes Modell (theoretischen Wert) als solches spricht. Eine Erhöhung der Herzschlagraten kann durch Chemikalien hervorgerufen werden. So konnten Osterauer & Köhler (2008) in Versuchen mit Embryonen des Zebrabärblings zeigen, dass das Insektizid Thiacloprid in niedrigen Konzentrationen zu einer Erhöhung der Herzschlagrate führte. Da in der Schussen wesentlich mehr Chemikalien nachgewiesen werden konnten als in der Argen, könnte dies die Unterschiede in den Herzschlagraten 2011 an den beiden Flüssen erklären. Eine Verringerung der Herzschlagrate, wie sie bei den Bachforellen an der Schussen 2012 auftrat, konnten auch Stasiunaitè & Kazlauskienè (2002) bei Regenbogenforellen beobachten, die gegenüber geklärtem Abwasser exponiert waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass in der Schussen und Argen Stoffe vorhanden sind, die die Herzschlagraten der Embryonen negativ beeinflussen. gemessener Wert theoretischer Wert C 12,5 C 13,5 C Labor Argen Schussen Abb : Herzschlagraten von Bachforellen eine Woche nach dem Schlupf im Frühjahr 2011 (Labor n=60, Argen n=39, Schussen n=34). gemessener Wert theoretischer Wert ,5 C 12,5 C 13,5 C Labor Argen Schussen Abb : Herzschlagraten von Regenbogenforellen eine Woche nach dem Schlupf im Jahr 2011 (Labor n=48, Argen n=39, Schussen n=40). 168

169 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Abb : Herzschlagraten von Bachforellen eine Woche nach dem Schlupf im Jahr 2012 (Labor n=60, Argen n=60, Schussen n=60). Tab : Tabellarische Zusammenfassung der Zeitpunkte, zu denen Augenpunktstadium erreicht war und der Schlupf erfolgte bzw. der Herzschlag gemessen wurde. Expositionsansatz 2011 mit Regenbogen- und Bachforellen (d=tage, Bachforellen n=360; Regenbogenforellen n=300). Bachforellen Labor Ort Versuchs- Augen- Schlupf Herzschlagstart punkt- messung stadium Expositionszeit 0d 21d 45d-52d 51d Schussen Expositionszeit 0d 52d 74d-77d 83d Argen Expositionszeit 0d 73d 81d-85d 87d Regenbogenforellen Labor Expositionszeit 0d 28d 50d 56d Schussen Expositionszeit 0d 56d 44d-47d 53d Argen Expositionszeit 0d 43d 51d-55d 57d 169

170 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Tabelle : Tabellarische Zusammenfassung der Zeitpunkte, zu denen das Augenpunktstadium erreicht war und der Schlupf erfolgte bzw. der Herzschlag gemessen wurde. Expositionsansatz 2012 mit Bachforellen (d=tage, n=600). Bachforellen Labor Ort Versuchs- Augen- Schlupf Herzschlagstart punkt- 50% messung stadium Expositionszeit 0d 27d 50d 62d Schussen d(beheizt) 56d(beheizt) Expositionszeit 0d 49d(unbeheizt) 52d(unbeheizt) 70d Expositionszeit Argen d 49d(beheizt) 55d(unbeheizt) 60d(beheizt) 66d(unbeheizt) 70d Literatur Braunbeck T, Lammer E, (2006) Bachground paper: fish embryo toxicity assay. Umwelt Bundes Amt UBA Contract Number : Burkhardt-Holm, P.. (2009) Klimawandel und Bachforellenrückgang - gibt es einen Zusammenhang? : Resultate aus der Schweiz. Umweltwissenschaften und Schadstoff-Forschung 21: Elliott, J. M. (1984). Numerical changes and population regulation in young migratorytrout Salmo trutta in a Lake District stream J.f An. Ecol. 53: Elliott, J. M., Humpesch, U. H., Hurley, M. A. (1987). A comparative study of eight mathematical models for the relationship between water temperature and hatchingtime of eggs of freshwater fish. Arch. Hydrobiol. 109: Jungwirth, M. & Winkler, H. (1984). The temperature dependence of embryonic development of grayling (Thymallus thymallus), Danube salmon (Hucho hucho), Arctic char (Salvelinus alpinus). Aquaculture 38: Luckenbach, T., Triebskorn, R., Muller, E., Oberemm, A. (2001). Toxicity of waters from two streams to early life stages of brown trout (Salmo trutta f. fario L.), tested under semi-field conditions. Chemosphere 45 (4-5): Luckenbach, T., Kilian, M., Triebskorn, R., Oberemm, A. (2003).Assessment of the developmental success of brown trout (Salmo trutta f. fario L.) embryos in two differently polluted streams in Germany. Hydrobiologia 490 (1-3): McKim, J.M., Arthur, J.W, Thorslund, T.W. (1975). Toxicity of linear alkylate sulfonate detergent to larvae of four species of freshwater fish. Bull. Environ. Contain. Toxicol. 14: 1-7. McKim, J.M. (1985). Early life stage toxicity tests. Fund. Aquat. Toxicol Noakes, D.J., Beamish, R.J., Kent, M.L. (2000). On the decline of Pacific salmon and speculative links to salmon farming in British Columbia. Aquaculture 183: OECD Guideline For Testing Of Chemicals: Fish, Early-life Stage Toxicity Test 210. Adopted by the Council on 17th July Ojanguren A F, Brana F (2003): Thermal dependence of embryonic growth and development in brown trout. J. Fish Biol. 62: Osterauer, R., Köhler, H.-R. (2008). Temperature-dependent effects of the pesticides thiacloprid and diazinon on the embryonic development of zebrafish (Danio rerio). Aquat. Toxicol. 86, Stasiunaitè P, Kazlauskienè N (2002): Impact of municipal wastewater chemicals on the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).ekologija (Vilnius) 2: Van Leeuwen, C.J., Adema, D.M.M., Hermens, J.(1990). Quantitative structure-activity relationships for fish early life stage toxicity. Aquat. Toxicol. 16:

171 Toxische Potentiale und Wirkungen: Embryotests mit dem Forellen im Bypass Woltering, D.M. (1984). The growth response in fish chronic and early life stage toxicity tests: a critical review. Aquat.Toxicol. 5: Kurzzusammenfassung: Embryotests mit Forellen im Bypass Herzschlagraten an den Bypässen höher/niedriger als bei den Labortieren Verglichen mit der Laborkontrolle geringer Schlupferfolg an Schussen und Argen Verzögerter Schlupf an der Argen als frühe Reaktion auf moderaten Umweltstress; an der Schussen frühere Schlupf als Reaktion auf starkenumweltstress Erhöhte Mortalitätsraten an der Argen Bearbeitung des Teilprojektes: Anja Henneberg, Sebastian Kindermann, Physiologische Ökologie der Tiere, Konrad- Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; anja.henneberg@googl .com 171

172 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden Gesundheitszustand von Gammariden: Parasitierung, Stressproteinanalyse und Histopathologie bei zwei Vertretern der Gattung Gammarus* *Die Personalmittel dieses Projektteils wurde nicht durch Projektmittel, sondern durch ein persönliches Stipendium der MTU-Stiftung finanziert Einleitung Um den Gesundheitszustand von Gammariden in der Schussen und der Argen zu bewerten, wurden an drei Probestellen an der Schussen (P00 bei Staig, P0 bei Weißenau und P3 bei Oberbaumgarten) sowie an einer Probestelle an der Argen (P5 bei Gohren) mehrmals im Jahr Gammariden gesammelt. Untersucht wurden die Parasitierungsrate, die Integrität der Gewebe sowie die Stärke der Stressproteinatwort (Hsp70). Der Zusammenhang zwischen der Parasitierung von Organismen und dem Belastungszustandes ihres Lebensraumes wurde vielfach beschrieben (z.b. Marcogliese, 2005; Morley et al., 2010). Unter Umweltstress müssen Organismen große Mengen an Stoffwechselenergie für den Abbau und/oder die Ausscheidung von z.b. Giftstoffen aufwänden. Diese Energie fehlt, um beispielsweise Parasiten zu bekämpfen. Zudem zeichnen sich Parasiten im Vergleich zu ihrem Wirt in der Regel durch eine kürzere Regenerationszeit und eine höhere Reproduktionsrate aus, so dass sie sich schneller an wechselnde Umweltbedingungen, beispielsweise anthropogene Schadstoffe in Gewässern, anpassen können. Folge sind höhere Parasitierungsraten in belasteten Lebensräumen, wie sie z.b. von van Valen (1973) und Bell (1982) beschrieben wurden. Umweltbelastungen können sich aber auch stärker negativ auf den Parasiten auswirken als auf den Wirt, was dann zu gegenteiligen Effekten führen kann. Auch Anpassungen auf genetischer Ebene können für eine erhöhte Parasitierungsrate in belasteter Umgebung verantwortlich sein. Alle bisher untersuchten Organismen, vom Bakterium bis zum Menschen, sind in der Lage, auf einen Stressor, wie beispielsweise eine Temperaturerhöhung, mit der Bildung von sogenannten Stress- oder Hitzeschockproteinen (Hsp) zu reagieren. Tritt eine Stresssituation auf (z.b. Temperaturbelastung, Schwermetallbelastung, toxische Substanzen, UV-Strahlung und Sauerstoffmangel), die Denaturierungen von Proteinen zur Folge hat, werden solche Proteine vermehrt gebildet. Diese binden an (teilweise) denaturierte Proteine und es findet eine gezielte Rückfaltung statt (Ellis et al., 1989). Eine Erhöhung des Hsp70-Levels lässt somit einen Rückschluss auf das Maß an proteotoxischem Stress zu. 172

173 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden Um die Auswirkungen des Parasitenbefalls auf die inneren Organe der Flohkrebse darzustellen, wurden einige parasitierte Individuen histopathologisch untersucht. Nach Bollache et al. (2002) hat eine Parasitierung mit Acanthocephalen negative Auswirkungen auf die Fortpflanzung der Gammariden. Sie reichen bei den Weibchen von einer Reduktion der Fruchtbarkeit (z.b. durch Pomphorhynchus laevis) bis hin zur vollständigen Kastration (z.b. durch Polymorphus minutus) (Bollache et al., 2002). Methodik Parasitierungsrate Zur Bestimmung der Parasitierungsrate wurden pro Probestelle alle 100 für die Bestimmung des Geschlechterverhältnisses gefangenen Gammariden auf Parasitierung mit Acanthocephalen hin untersucht. Die Bestimmung der Parasitierung erfolgte direkt vor Ort am lebenden Tier. Eine Parasitierung an fixierten Tieren ist nur schwer nachweisbar, da die Parasiten in der Fixierlösung schnell ausbleichen. Bei parasitierten lebenden Individuen ist der Parasit als gelber, orangener oder roter Fleck auf der Dorsalseite des Gammariden makroskopisch erkennbar. Abb : Gammarus pulex parasitiert mit Pomphorhynchus laevis. Um die unterschiedlichen Probestellen miteinander vergleichen zu können, wurde die Anzahl parasitierter und nicht parasitierter Individuen an allen Probenahmen ermittelt und aufaddiert. Schließlich wurde der Anteil parasitierter Tiere an der Gesamtanzahl bestimmt. Statistisch wurden die Werte für die einzelnen Probestellen paarweise mit Fisher s Exact Test auf signifikante Unterschiede hin untersucht. Stressproteinanalysen Zur Ermittlung des Hsp-Gehalts der einzelnen Flohkrebse wurden an jeder Probestelle 10 (im Jahr ) Präkopulapaare gesammelt. Hierdurch wurde sicher gestellt, dass sich alle 173

174 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden zu untersuchenden Individuen im gleichen Entwicklungsstadium befanden, da dieses den Hsp70-Grundlevel beeinflussen kann. Zudem konnten die Geschlechter im Feld eindeutig identifiziert und getrennt voneinander eingefroren werden. Vor Ort wurden alle Tiere auf Artniveau determiniert und deren individuelle Körperlänge bestimmt. Anschließend wurde jedes Individuum einzeln in einem 1,5 ml Safe-Lock Eppendorf-Gefäß in flüssigem Stickstoff (-183 C) schockgefroren. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben im Labor bei 80 C gelagert. Zur quantitativen Bestimmung der Stressproteinlevel wurde ein quantitatives Immunoblotting- Verfahren angewendet, das bei Scheil et al. (2008) detailliert beschrieben ist. Konstante Mengen nicht membrangebundenen Proteins (Bestimmung nach Bradford, 1976) werden hierbei über SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt, in einem Semi-dry-Verfahren auf Nitrocellulose geblottet und Hsp70 immunologisch detektiert. Die Quantifikation des Signals erfolgte über die Bestimmung des optischen Volumens (Intensität x Fläche) in Relation zu einem Hsp70-Standard. Abschließend werden die so ermittelten Grauwerte statistisch auf signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Probestellen hin untersucht (nicht parametrische Daten, one-way ANOVA, Wilcoxon-Test, Bonferroni-Korrektur). Die beiden Gammarusarten Gammarus pulex und Gammarus roeseli mussten getrennt voneinander ausgewertet werden, da sich ihre Hsp70-Level an einer Probestelle signifikant voneinander unterschieden. Zwischen weiblichen und männlichen Individuen gab es jedoch an keiner Probestelle signifikante Unterschiede, so dass die Werte für Männchen und Weibchen zusammengefasst werden konnten. Histopathologie Für histopathologische Untersuchungen wurden an jeder Probestelle 10 Flohkrebse (parasitiert und unparasitiert) gesammelt, der Länge nach gemessen und auf Artniveau bestimmt. Vor Ort wurden die Individuen dekapitiert und einzeln in Schnappdeckelgläschen in 2% Glutardialdehyd (gelöst in 0,005 M Cacodylatpuffer, ph 7,4) fixiert. Nach der von Schirling et al. (2005) beschriebenen Methode wurden die Tiere in Kunststoff (Technovit) eingebettet. Anschließend wurden am Rotationsmikrotom Dünnschnitte (4µm Dicke) angefertigt. Nach Färbung der Schnitte mit Methylenblau und Hämatoxylin-Eosin wurden sie lichtmikroskopisch untersucht. Zu Beginn der Auswertung wurde ein nicht parasitierter Flohkrebs komplett in Serie geschnitten, um einen Referenzzustand zu erhalten. Anschließend wurden die Schnitte der parasitierten Individuen mit denen der unparasitierten verglichen. Hierbei wurde besonders auf Veränderungen der Gewebe der Verdauungsorgane und der Gonaden geachtet, da 174

175 Individuen Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden durch den hohen Platzbedarf der Acanthocephalen Struktur und Funktion der inneren Organe der Flohkrebse stark beeinträchtigt wird. Resultate Parasitierungsrate Die Parasiterungsrate (Abb ) war an P0 und P3 signifikant geringer als an P5. Zwischen den einzelnen Probestellen an der Schussen (P00, P0 und P3) konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Parasitierung * * Probestelle nicht parasitiert parasitiert Abb : Parasitierungsrate ( ). P0, P3 und P5: n=800; P00: n=600. Schussen: P00 (Staig), P0 (Weißenau), P3 (Oberbaumgarten). Argen: P5 (Gohren). Daten der Probenahmen B, B*, C: Jonas Geburzi (im Diagramm miteinbezogen). Signifikante Testergebnisse (Fishers Exact Test): * - p 0,017. Stressproteine (Hsp70) Die Stressproteinanalysen mit Gammarus roeseli (Abb ) und Gammarus pulex (Abb ) erbrachten aufgrund sehr hoher Standardabweichungen keine signifikant unterschiedlichen Werte für die Tiere der unterschiedlichen Probestellen. Jedoch ist bei beiden untersuchten Arten im Vergleich von P0 (oberhalb KA) und P3 (unterhalb KA) ein Trend zu einem erhöhten Hsp70-Level an Probestelle P3 zu erkennen. Beim Vergleich der Probestellen P00 und P0 ist ein Trend hin zu einem erhöhten Hsp70-Level an P00 erkennbar. 175

176 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden Abb : Relativer Hsp70-Level von Gammarus roeseli (2010 und 2011). Arithmetischer Mittelwert, Standardabweichung und Stichprobengröße. Abb : Relativer Hsp70-Level von Gammarus pulex (2010 und 2011). Arithmetischer Mittelwert, Standardabweichung und Stichprobengröße. Histopathologie Aus Abb wird ersichtlich wie viel Platz Parasiten in ihrem Wirtsorganismus beanspruchen können. Im abgebildeten Tier liegt der Parasit (Acanthella = Larve der Acanthocephala) dorsal der Verdauungsorgane und der Ovarien. Diese sind komplett zurückgedrängt, und in den Ovarien sind nur sehr junge Oozyten zu erkennen. 176

177 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden Abb : Sagittalschnitt durch einen parasitierten Gammarus pulex. Ac Acanthella, Ed Enddarm, Md Mitteldarm, Mdd Mitteldarmdrüse, Ov Ovar, rc rektales Caecum, Vd Vorderdarm. Die Pfeile markieren Vorder- und Hinterende der Acanthella. Vergrößerung 100x, Panorama aus 72 Einzelbildern. Jonas Geburzi, Diskussion Parasitierungsrate Eine grobe Artbestimmung der Acanthocephalen, für die Gammarus den Zwischenwirt darstellt, ist aufgrund ihrer Farbe möglich. Die Larven des Fischparasiten Pomphorhynchus laevis erscheinen als gelbe oder gelborangene Flecken. Die Larven des Vogelparasiten Polymorphus minutus hingegen sind viel dunkler orange bis rötlich gefärbt (Bollache et al., 2000). An P5 war die Mehrheit der infizierten Gammariden mit Polymorphus minutus befallen. An der unteren Vereinigten Argen (Probestelle in Gohren) kann von einem Einfluss des nahegelegenen Bodensees mit seiner Wasservogelpopulation (vor allem Enten) ausgegangen werden, wodurch das vermehrte Auftreten von Polymorphus minutus an dieser Probestelle erklärbar ist. An den Probestellen P0, P00 und P3 tritt überwiegend Pomphorhynchus laevis auf, was mit starkem Befall der Fische einhergeht. Beim Vergleich der Probestellen an der Schussen (P0, P00 und P3) sind anhand der Parasitierungsrate keine direkten Einflüsse der KA Langwiese erkennbar und die Parasitierungsrate ist an den 177

178 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden einzelnen Probestellen auch nicht signifikant unterschiedlich. Signifikante Unterschiede der Parasitierungsrate treten zwischen P5 und P0, sowie P5 und P3 auf. Stressproteine (Hsp70) Die statistische Auswertung der Daten erbrachte keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den Probesellen. Eine Ursache hierfür ist einerseits die relativ kleine Stichprobengröße an manchen Probestellen(z.T.n=2 oder n=3). Dies resultiert aus der unterschiedlichen Artenverteilung an den Probestellen. Da für die Stressproteinanalyse nur Präkopulapaare verwendet wurden, und diese aufgrund ihres Regenerationszyklus vor allem im Herbst nur noch selten auftraten, konnte nicht auf eine gleichmäßige Verteilung der Arten geachtet werden. Zudem zeigen die Daten eine sehr hohe Variabilität, was dazu führt, dass keine Signifikanzen ermittelt werden konnten, obgleich Tendenzen zu erkennen sind. Vergleicht man Probestellen P0 (oberhalb KA) und P3 (unterhalb KA) miteinander, ist bei beiden Arten ein Trend zu einem erhöhten Hsp70-Level an P3 erkennbar. Auch beim Vergleich von Probestelle P00 und P0 lässt sich ein Trend hin zu einem erhöhten Stressproteinlevel an P00 erkennen. Im Jahr 2010 wurden für die Stressproteine nur je 10 Präkopulatiere gesammelt (entspricht 20 Individuen). Um die Stichprobengröße zu erhöhen, wurde im Jahr 2011 die Menge verdoppelt und 20 Präkopulatiere (40 Individuen) gesammelt. Aufgrund der Ergebnisse von Sures & Radszuweit (2007) und Sures (2008) wurde darauf geachtet, keine äußerlich sichtbar parasitierten Individuen für die Stressproteinanalyse zu verwenden, da sich eine Parasitierung der Individuen auf die Stressproteinexpression negativ auswirken kann (Sures & Radszuweit, 2007; Sures 2008). Trotz Verwendung unparasitierter Tiere waren allerdings auf den gefärbten Nitrozellulosefiltern oft gar keine oder nur bruchstückhafte Proteinbanden zu erkennen. Hierdurch wurde die Auswertung der Daten erheblich erschwert. Histopathologie Durch histopathologische Untersuchungen wird ersichtlich, wie viel Platz der Parasit in seinem Wirt beanspruchen kann. Späte Acanthella- und Cystacanth-Larven erreichen annähernd 50% der Körperlänge des Gammariden und füllen dann einen Großteil seiner Leibeshöhle aus (Geburzi, 2010). Dadurch werden die Organe stark in ihrer Struktur und Funktion beeinträchtigt. Weitere histologische Auswertungen (u.a. der Gonaden) sind in Bearbeitung und liegen noch nicht vollständig vor. Literatur Bollache, L., Rigaud, T. & Cézilly, F. (2002): Effects of two acanthocephalan parasites on the fecundity and pairing status of female Gammarus pulex (Crustacea: Amphipoda). Journal of Invertebrate Pathology 79:

179 Toxische Potentiale und Wirkungen: Parasitierung, Stressproteine und Histologie bei Gammariden Ellis, R. J., Van der Vies, S. & Hemmingsen, S. M. (1989): The molecular chaperone concept. Biochem. Soc. Symp. 55: Geburzi, J. (2010): Mikroschadstoff-Monitoring in zwei Bodenseezuflüssen mit drei Vertretern der Gattung Gammarus. Geschlechterverhältnis, Reproduktion und Parasitierung als Endpunkte der Toxizität. Bachelorarbeit der Fakultät für Biologie, Universität Tübingen. Marcogliese, D.-J. (2005): Parasites of superorganism: Are they indicators of ecosystem health? International Journal of Parasitology 35(7): Morley, N.-J., Costa, H.-H. & Lewis, J.-W. (2010): Effects of a chemically polluted discharge on the relationship between fecundity and parasitic infections in the chub (Leuciscus cephalus) from a river in Southern England. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 58: Scheil V, Triebskorn R, Köhler H-R (2008): Cellular and stress protein responses to the UV-filter 3- benzylidene camphor in the amphipod crustacean Gammarus fossarum (Koch 1835). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 54, Schirling, M., Jungmann, D., Ladewig, V., Nagel, R., Triebskorn, R. & Köhler, H.-R. (2005): Endocrine Effects in Gammarus fossarum (Amphipoda): Influence of Wastewater Effluents, Temporal Variability and Spatial Aspects on Natural Populations. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 49: Sures, B. & Radszuweit, H. (2007): Pollution-induced heat shock protein expression in the amphipod Gammarus roeseli is affected by larvae of Polymorphus minutus (Acanthocephala). Journal of Helminthology 81: Sures, B. (2008): Host-parasite interactions in polluted environments. Journal of Fish Biology 73: Van Valen, L. (1973): A New Evolutionary Law. Evolutionary Theory 1: Kurzzusammenfassung: Parasitierung, Stressproteine und Histologie Gammariden Kein Einfluß der KA Langwiese auf die Parasitierungsrate der Gammariden erkennbar Trend zu höheren Stressproteinwerten unterhalb der KA Langwiese (P3) im Vergleich zu direkt oberhalb dieser KA (P0) bei G. pulex und G. roeseli Struktur von Mitteldarmdrüse und Gonaden durch Parasitierung negativ beeinflusst Bearbeitung des Teilprojektes: Katharina Peschke, Physiologische Ökologie der Tiere, Konrad-Adenauer-Str. 20, Tübingen; 07071/ ; katharina-peschke@web.de 179

180 Toxische Potentiale und Wirkungen: Makrozoobenthon Makrozoobenthon Einleitung Das Monitoring zum Makrozoobenthon in der Schussen erfolgt nach der Bewertungsmethodik für die europäische Wasserrahmenrichtlinie, d. h. der flächenbezogenen Aufnahme nach dem Multi-Habitat-Sampling-Verfahren. Anhand ökologischer Indices werden die Auswirkungen der zukünftigen Aktivkohlebehandlung auf der KA Langwiese sowie der verbesserten Mischwasserbehandlung beim RÜB Mariatal auf die Gewässerbiozoenose untersucht. Die vorliegende Untersuchung vom Herbst 2010 dient als Vergleichsbasis zur Dokumentation der Zusammensetzung des Makrozoobenthon vor der Umsetzung (Referenz). Diese Methode wurde u. a. bereits bei der Analyse von Veränderungen der aquatischen Besiedlung bei verschiedenen Sukzessionsstadien waldbaulicher Umgestaltungsmaßnahmen und der Durchwanderbarkeit erfolgreich eingesetzt (s. DBU- Projekt Nr /2: Erhalt und Entwicklung naturnaher Bachläufe im Wald im Rahmen der Waldbewirtschaftung). Methodik Das Makrozoobenthon wurde an den fünf Untersuchungsstellen in der Schussen flächenbezogen nach dem Multi-Habitat-Sampling-Verfahren (WRRL) aufgenommen (s. Dabei wurden Abschnitte im Bereich der fünf Untersuchungsbereiche ausgewählt, die hinsichtlich der abiotischen Faktoren für eine längere Fließgewässerstrecke der Schussen repräsentativ sind. Die anschließende Beprobung der Habitate erfolgte proportional zu ihrem Vorkommen an der jeweiligen Probestelle. Es wurde eine Lebenssortierung der Probe im Gelände durchgeführt. Die anschließende taxonomische Bestimmung im Labor wurde mindestens bis zum Niveau der Operationellen Taxaliste vorgenommen. Die ökologische Qualität der Schussen wurde mit Hilfe der Bewertungssoftware ASTERICS (Version 3.1.1) einschließlich des deutschen Bewertungssystems PERLODES ermittelt. In die Auswertung wurden verschiedene statistische Verfahren einbezogen, um die Veränderungen hinsichtlich der quantitativen und qualitativen Zusammensetzung des Makrozoobenthon an den verschiedenen Probestellen zu bewerten. Die Bewertung wurde gewässertypbezogen durchgeführt. Die Schussen gehört zum TyP03.2, den kleinen Flüssen der Jungmoräne des Alpenvorlandes. 180

181 Toxische Potentiale und Wirkungen: Makrozoobenthon Abweichend vom vorgegebenen Untersuchungszeitraum für die WRRL (Februar bis August) wurde die Aufnahme im Oktober 2010 durchgeführt, da die saprobiellen und toxischen Wirkungen nach der warmen (Temperatur) sommerlichen Niedrigwasserperiode (Mischungsverhältnis) am deutlichsten zum Ausdruck kommen. Das Makrozoobenthon wurde im Herbst 2010 an den folgenden fünf Stellen in der Schussen untersucht: 1: unterhalb Ravensburg-Weissenau (P0) 2: Schussen unterhalb RÜB Mariatal (= oberhalb KA Langwiese ) (P1) 3: Schussen direkt unterhalb KA Langwiese (nach Vermischung) 4: Schussen am Pegel Lochbrücke (Gerbertshaus) (P2) 5: Schussen in Oberbaumgarten (Holzbrücke) (P3) Resultate Die Aufnahme des Makrozoobenthon im Herbst 2010 zeigt, dass sich der gesamte Untersuchungsabschnitt der Schussen zwischen Ravensburg und Oberbaumgarten, ca. 5,6 km oberhalb der Mündung, aktuell im Bereich des guten saprobiellen Zustands befindet und in dieser Hinsicht die Anforderungen der WRRL erfüllt (Abb ). Unterhalb der Einleitung der Kläranlage Langwiese erfolgt nur noch ein sehr geringer Anstieg des Saprobienindex, der nicht signifikant ist. An den beiden flussabwärts befindlichen Probestellen ist jedoch eindeutig eine leichte Verbesserung der saprobiellen Verhältnisse und damit der Gewässergüte in der Schussen zu beobachten. Abb : Saprobienindices an den 5 Messstellen in der Schussen im Herbst

182 Toxische Potentiale und Wirkungen: Makrozoobenthon Die Artenzahl des Makrozoobenthon verringert sich im Untersuchungsabschnitt direkt unterhalb der KA Langwiese deutlich. Wie aus Abbildung 2 hervorgeht, wurde hier die niedrigste Anzahl an Makrozoobenthontaxa entlang der Untersuchungsstrecke festgestellt. Die Individuendichte, die bereits unterhalb des RÜB Mariatal einen Rückgang aufweist, nimmt unterhalb der KA Langwiese noch einmal leicht ab. Bereits an der Probestelle beim Pegel Lochbrücke ist jedoch wieder ein signifikanter Anstieg der Artenzahl und auch der Individuendichte in der Schussen zu beobachten (Abb ). Die Abnahme der Besiedlungsdichte unterhalb des RÜB Mariatal und der KA Langwiese beruht zu einem großen Teil auf einem Rückgang der Gammariden (Bachflohkrebse), welche innerhalb des Makrozoobenthon als besonders sensitiv gegenüber toxischen Einflüssen eingestuft werden. Abb : Artenzahl und Individuendichte des Makrozoobenthon an den 5 Untersuchungsstellen in der Schussen nach der Erhebung im Herbst Abb zeigt, dass unterhalb der Entlastung des RÜB Mariatal ein leichter und unterhalb der Kläranlage Langwiese ein stärkerer Rückgang der sensitiven Taxa innerhalb des Makrozoobenthon zu verzeichnen ist. Insbesondere die gegenüber toxischen Einflüssen auch als sensitiv angesehenen EPT-Taxa, (Ephemeroptera/Plecoptera/Trichoptera), d. h. die Arten der Eintags-, Stein- und Köcherfliegen, gehen hier deutlich zurück. Allerdings ist auch hier bereits an der nächsten Untersuchungsstelle am Pegel Lochbrücke wieder eine deutliche Verbesserung zu erkennen. 182

183 Toxische Potentiale und Wirkungen: Makrozoobenthon Abb : Anzahl der sensitiven Taxa (nach dem österreichischen Bewertungsverfahren) und der EPT-Taxa (Ephemeroptera-Plecoptera-Trichoptera) innerhalb des Makrozoobenthon an den 5 Probestellen in der Schussen nach der Erhebung im Herbst Diskussion Die Voruntersuchungen zum Makrozoobenthon in der Schussen im Herbst 2010 haben folgendes gezeigt: Im gesamten Untersuchungsabschnitt der Schussen zwischen Ravensburg und Kressbronn bestehen keine nennenswerten Gütedefizite bzw. Güteprobleme, die hauptsächlich durch eine Belastung mit leicht abbaubaren und daher sauerstoffzehrenden organischen Stoffen verursacht werden. Auch unterhalb der KA Langwiese war aktuell kein signifikanter Anstieg des Saprobienindex zu beobachten. Das bedeutet, dass auf der Kläranlage der mikrobiell abbaubare organische Anteil im Abwasser im Wesentlichen eliminiert wird. Die Schussen beherbergt heute auch wieder einige Arten der Roten Liste, wie z. B. die als stark gefährdet eingestuften Steinfliegen Taeniopteryx schoenemundi und Perla burmeisteriana (GF 2) sowie die Köcherfliege Brachycentrus subnubilus (GF 2) und die Eintagsfliege Heptagenia sulphurea (GF3). Im Schussenabschnitt unterhalb des RÜB Mariatal sowie der KA Langwiese war ein deutlicher Rückgang der Artenzahl und in geringerem Umfang der Individuendichte des Makrozoobenthon zu beobachten. Neben hydraulischen Belastungen, die auf diesem Abschnitt durch Mischwasserentlastungen und Regenwassereinleitungen hervorgerufen werden, können auch leicht toxische Wirkungen hierbei nicht ausgeschlossen werden. Unterhalb der Entlastung des RÜB Mariatal war ein leichter und unterhalb der Kläranlage Langwiese ein stärkerer Rückgang der sensitiven Taxa innerhalb des Makrozoobenthon 183

184 Toxische Potentiale und Wirkungen: Makrozoobenthon zu verzeichnen. Davon waren insbesondere die gegenüber toxischen Einflüssen als sensitiv eingestuften EPT-Taxa und die Gammariden betroffen. Von diesem Rückgang war aber auch die Organismengruppe der Coleoptera (Käfer) betroffen - speziell die verschmutzungssensitiven Hakenkäfer aus der Familie der Elmiden. Von den fünf in der Schussen vorhandenen Gattungen bzw. Arten dieser Familie konnten unterhalb der KA Langwiese nur noch Elmis maugetii und Limnius volckmari nachgewiesen werden. Esolus parallelepipedus, Riolus cupreus und Oulimnius tuberculatus traten hier nicht auf. An der ca. 10 km flussabwärts befindlichen Probestelle am Pegel Lochbrücke hat sich das Makrozoobenthon bereits wieder weitgehend erholt. Sowohl das Arteninventar insgesamt als auch die sensitiven Taxa zeigten hier keine signifikanten Defizite mehr im Vergleich zur Referenzmessstelle unterhalb von Weissenau, wobei an dieser Stelle anzumerken ist, dass im mittleren und unteren Verlauf der Schussen keine von Abwasser- und Mischwassereinleitungen weitgehend unbeeinträchtigte Referenzstelle existiert. Kurzzusammenfassung: Makrozoobenthon Alle Probestellen an der Schussen im "guten saprobiellen Zustand", d.h. wenig Belastung mit leicht abbaubaren bzw. sauerstoffzehrenden organischen Stoffen Unterhalb RÜB Mariatal und der KA Langwiese Rückgang der Artenzahl und Individuendichte Unterhalb des RÜB Mariatal und der KA Langwiese Rückgang der sensitiven Taxa (Artengruppen) Bearbeitung des Teilprojektes: Dr. Karl Wurm, Gewässerökologisches Labor Starzach, Tulpenstr. 4, Starzach; ; glw.k.wurm@t-online.de. 184

185 Öffentlichkeitsarbeit Gestaltung des Informationsflyers Von P. Rey, Hydra Konstanz wurde in Kooperation mit R. Triebskorn, Uni Tübingen ein Informationsflyer zum Projekt gestaltet. Dieser liegt dem Bericht bei. Der Flyer wurde so gestaltet, dass er Inhalte und Ziele des Projekts möglichst allgemein verständlich zusammenfasst. Als Zielgruppen wurden die interessierte Öffentlichkeit, Fischer und Behörden definiert. 185

186 Öffentlichkeitsarbeit 186

187 Öffentlichkeitsarbeit 187

188 Öffentlichkeitsarbeit Bearbeitung des Teilprojekts: Peter Rey, Hydra, Institut für angewandte Hydrobiologie, Fürstenbergstr. 25, Konstanz, Prof. Dr. Rita Triebskorn, Universität Tübingen; ; 188

189 Zusammenfassung und Ausblick 5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK (Triebskorn) Das Projekt SchussenAktiv hatte zum Ziel, den ökotoxikologischen Zustand der Schussen im Vergleich zur Argen vor Ausbau der Kläranlage (KA) Langwiese (AZV Mariatal, Ravensburg) zu beschreiben. Hierzu wurden im KA-Ablauf, im Oberflächenwasser (OFW) und in Sedimenten der Schussen unterhalb der KA (im Vergleich zur Argen) sowie in Biota chemische Analysen verschiedener Stoffgruppen durchgeführt. Im Rahmen von Labortests wurden toxische und hormonelle Potentiale im Ablauf der KA und im OFW bzw. Sediment der Schussen (im Vergleich zur Argen) bewertet. Parallel wurden reale endokrine und toxische Wirkungen bei Freilandtieren oder bei Tieren, die aktiv im Freiland exponiert waren, untersucht. Begleitend wurden limnochemische Untersuchungen durchgeführt, die für alle Probestellen außer der Schussenmündung hinsichtlich physikalisch-chemischer Eigenschaften und Nährstoffe einen guten Zustand ergaben. Die chemischen Analysen erbrachten ein differenziertes Bild zur Belastungssituation der Schussen unterhalb der KA Langwiese mit Spurenstoffen im Vergleich zur Argen. Im Ablauf der KA wurden maximal 29 Verbindungen über der Nachweisgrenze gefunden, im Oberflächenwasser der Schussen traten davon 21 auf. Der Spurenstoff-"Cocktail" war zu den verschiedenen Probenahmezeitpunkten sowohl qualitativ als auch quantitativ unterschiedlich zusammengesetzt. In der Schussen waren insgesamt deutlich mehr Substanzen als in der Argen nachzuweisen (Argen:12 Stoffe), und diese traten in den meisten Fällen auch in deutlich höheren Konzentrationen auf. In diesem Zusammenhang ist die sehr viel geringere Wasserführung der Schussen im Vergleich zur Argen aufgrund geringerer Niederschläge im Einzugsgebiet (und der damit verbundenen geringeren Verdünnung des gereinigten Abwassers) sowie das deutlich dichter besiedelte Umfeld von Bedeutung. Allerdings waren auch vereinzelt Substanzen in OFW bzw. in Biota aus der Argen in höheren Konzentrationen vorhanden als in der Schussen (z.b. -Sitosterol, Arsen, Cadmium), was vor oben genanntem Hintergrund (Verdünnungseffekt) als umso bedeutender bewertet werden muss. Für mehrere Stoffe (z.b. Carbamazepin, DMS, Sucralose, Benzotriazol) konnte der Eintrag über die Kläranlage Langwiese als bestimmend für die Konzentration im Vorfluter festgemacht werden. Üblicherweise lagen die Konzentrationen im OFW um den Faktor 3-10 niedriger als im KA-Ablauf, was etwa dem Verhältnis von gereinigtem Abwasser zum Oberflächenwasser der Schussen entspricht. Stoffe, die im KA-Ablauf in geringen Konzentrationen (z.b. 4-tert-Octylphenol: 61 ng/l; Bisphenol A: 24 ng/l) nachgewiesen wurden, lagen aufgrund dieses Verdünnungseffekts im OFW meist in Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze vor. Andere Spurenstoffe, wie z.b. Diclofenac, Ethanolamin 189

190 Zusammenfassung und Ausblick oder Coffein waren oberhalb der Kläranlage bereits in vergleichbaren oder sogar etwas höheren Konzentrationen als flussabwärts vorhanden. In diesen Fällen ist entweder mit hohen Belastungen aus Kläranlagen oberhalb der KA Langwiese auszugehen (Diclofenac), oder es erfolgen nur geringe Einträge über die KA Langwiese. Allerdings können auch zufällig erfasste Eintragsspitzen oberhalb der KA für diesen Effekt verantwortlich sein. Für die meisten der nachgewiesenen Spurenstoffe liegen (noch) keine Umweltqualitätsnormen (UQN) vor. Vor dem Hintergrund der vorgeschlagenen Erweiterung der Liste prioritärer Stoffe der WRRL sowie der zu erwartenden niedrigeren UQNs würden sich für Diclofenac im OFW der Schussen sowie für Flammschutzmittel in Biota aus Schussen und Argen Grenzüberschreitungen ergeben. Für Quecksilber wird bei Fischen aus Schussen und Argen der bereits bestehende EU-Grenzwert von 20 µg/kg überschritten. Die PCB-Konzentrationen in Fischen aus Schussen und Argen liegen unterhalb des Grenzwertes der EU. Als Voraussetzung dafür, einen potentiellen Zusammenhang zwischen den chemischanalytisch ermittelten Daten und den Wirkdaten herstellen zu können, wurden Substanzen, die entweder in wässrigen Proben, Sediment oder Biota nachgewiesen wurden, möglichen Wirkmechanismen zugeordnet. Als potentiell endokrin wirksame Substanzen wurden Octylphenol, Bisphenol A, Benzotriazol, Flammschutzmittel, -Sitosterol, PCB, Methyltriclosan und DDX-Verbindungen identifiziert. Die Konzentrationen der sehr stark wirksamen östrogenen Verbindungen E 2 und EE 2 lagen sowohl in den Oberflächenwasserproben als auch in den Ablaufproben der KA unterhalb der Nachweisgrenze. Allerdings wurden im Rahmen des Projekts SchussenAktiv biologische Wirktests eingesetzt, die hormonelle Potentiale in diesem geringen Konzentrationsbereich noch erfassen können. Mit dem E-Screen wurde so z.b. eine östrogene Gesamtaktivität von max. 4,6 ng/l (EEQ) im KA-Ablauf bzw. max. 1,7 ng/l (EEQ) im OFW der Schussen ermittelt. Zu dieser können, neben den o.g. Substanzen, auch endokrin wirksame Chemikalien, die unter der analytischen Nachweisgrenze vorlagen, beigetragen haben. Vor dem Hintergrund, dass hormonelle Effekte im unteren Nanogramm-Bereich ausgelöst werden können (niedrigste Effektkonzentration [LOEC] von EE 2 z.b. 0,1 ng/l), trägt die biologische Wirkanalytik, wie sie beispielsweise vom E-Screen oder den im Projekt eingesetzten Reportergenassays geleistet wird, dazu bei, in einem Konzentrationsbereich Vorsorge treffen zu können, der mit instrumenteller Analytik (noch) nicht erfasst werden kann. Den Nachweis endokriner Potentiale im Ablauf der KA Langwiese sowie im OFW und Sediment der Schussen wurde im Rahmen von SchussenAktiv nicht nur mit in vitro- Testsystemen (im Reagenzglas), sondern auch in vivo, d.h. mit lebenden Organismen 190

191 Zusammenfassung und Ausblick erbracht: Die Tests mit der Zwergdeckelschnecke weisen allerdings nicht nur in der Schussen, sondern auch in der Argen auf sehr starke östrogenartige Potentiale hin. Um die Inzidenzkette von der Präsenz von potentiell hormonell wirksamen Substanzen über endokrine Potentiale bis hin zu tatsächlichen Wirkungen bei Freilandorganismen verlängern zu können, wurden Wirkuntersuchungen an Fischen (Döbel, Schneider und Forellen) und Flohkrebsen durchgeführt, die entweder aus dem Freiland entnommen oder in den Bypass- Systemen aktiv dem Wasser von Schussen oder Argen gegenüber exponiert wurden. Die Induktion der Bildung von Vitellogenin in Jungforellen, Einflüsse auf die Gonadenreife beim Döbel und die höhere Anzahl an weiblichen Schneidern und Gammariden in der Schussen unterhalb der KA Langwiese lassen vermuten, dass sich an dieser Probestelle hormonelle Einflüsse bei Freilandorganismen bereits moderat manifestiert haben. Allerdings sind mögliche endokrine Wirkungen, wie die genannte verzögerte Gonadenentwicklung bei Döbeln und Schneidern an der Schussen, oft kaum von toxischen Effekten zu trennen. Unter Schadstoffeinfluss benötigen Organismen große Teile ihrer Stoffwechselenergie dafür, Giftstoffe ab- oder umzubauen bzw. diese zu entgiften. Diese Energie steht in der Folge für Organ- oder Körperwachstum nicht zur Verfügung, so dass z.b. Fortpflanzungsorgane kleiner bleiben (sog. trade-off). In diesen Kontext lässt sich auch sehr gut der geringere Gehalt an Glykogen (Speicherkohlenhydrat) in den Lebern von Döbeln und Schneidern aus der Schussen einordnen. Bekannt ist allerdings auch, dass Tiere aus Populationen, die dauerhaft und über viele Generationen hinweg unter Schadstoffeinfluss leben, bei geringerer Körpergröße und in geringerem Alter bereits reproduzieren können, was als mikroevolutive Anpassung gedeutet wird (Donker et al., 1993). Dass in der Schussen ein Zusammenspiel von endokrinen und toxischen Einflüssen von Bedeutung ist, ist aufgrund der Ergebnisse dieses Projektes sehr wahrscheinlich. Wie Tab verdeutlicht, sind für den Großteil der nachgewiesenen Substanzen eher nichthormonelle Wirkmechanismen bekannt. Hierunter fallen Stoffe, die entweder Gewebeschäden in exponierten Organismen verursachen, wie z.b. Diclofenac in den Nieren von Fischen sowie neurotoxische (z.b. Quecksilber), gentoxische (z.b. Methyltriclosan) oder osmotisch wirksame Substanzen (z.b. Acesulfam). Auch hier konnten im Rahmen von SchussenAktiv mögliche Zusammenhänge zwischen Exposition und Wirkung erarbeitet werden. Der Nachweis gentoxischer Potentiale mittels Reportergenassays in der Schussen lässt sich z.b. einerseits mit der Präsenz potentiell gentoxischer Verbindungen, wie DMS, TCPP, Methyltriclosan oder Carbendazim in Verbindung bringen. Andererseits spiegeln die vermehrten Mikrokerne in Blutzellen von Döbeln aus der Schussen diese gentoxischen Potentiale bei Freilandorganismen wider. Die Hemmung der Cholinesterase in Fischen aus 191

192 Zusammenfassung und Ausblick der Argen lässt sich ggf. durch die vermehrte Präsenz von neurotoxisch wirkenden Substanzen, wie Quecksilber, Arsen oder Cadmium in der Argen erklären. in Tab. 5.1 und 5.2. werden abschließend die chemisch-analytischen Daten und die Ergebnisse der Wirktests zusammenfassend bewertet. Beide Tabellen gemeinsam verdeutlichen, dass sowohl auf der Expositions- als auch auf der Effektseite ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher Einflussgrößen die Belastungssymptomatik an Schussen und Argen beschreibt, wobei die Dichte der Einflussgrößen an der Schussen deutlich höher ist. Die Untersuchung des Makrozoobenthon entlang der Schussen verdeutlichte den Einfluss der Kläranlage Langwiese auf der Ebene der Lebensgemeinschaft, wobei derzeit etablierte Bewertungssysteme (Saprobität) ebenso wie die im Rahmen des Projekts durchgeführten limnochemischen Analysen den guten Zustand der Schussen hinsichtlich Nährstoffbelastung bzw. Belastung mit sauerstoffzehrenden Stoffen bestätigten. Der Rückgang von Artenzahl und Individuendichte und hierbei vor allem der sensitiven Artengruppen weist allerdings deutlich darauf hin, dass andere Stoffe als die zuvor genannten, also ggf. Spurenstoffe, auf das System negativ einwirken. Inwiefern sich auf Individualebene festgestellte Reaktionen bzw. Schädigungen bei Freilandfischen auf der Ebene der Fischpopulationen widerspiegeln, wurde im Rahmen von SchussenAktiv nicht untersucht. Allerdings liegen von anderer Seite für den Wasserkörper 1103 zwischen Mariatal (oberhalb KA Langwiese) und Mariabrunn Daten zur Bewertung des ökologischen Zustands des Gewässers auf der Basis des fischbasierten Bewertungssystems für Fließgewässer (FIBS) vor. Die Stelle Brugg oberhalb von Meckenbeuren repräsentiert in diesem Wasserkörper eine Probestelle unterhalb der KA Langwiese. Der Gütezustand dieser Probestelle wurde nach FIBS als mäßig eingestuft, wobei einer der Gründe hierfür die starke Dominanz des Schneiders in diesem Teilabschnitt des Wasserkörpers (50%-75% aller Fische) war (Dussling, pers. Mitteilung 23. Juli 2012). Ob dies ggf. auch damit zusammenhängen kann, dass der Schneider relativ gut mit chemischen Belastungen unterhalb der KA Langwiese zurechtkommt, wäre weitergehend zu untersuchen. Bei den histologischen Untersuchungen und Stressproteinanalysen im Rahmen von SchussenAktiv erwies sich der Schneider jedenfalls insgesamt als weniger empfindlich als der Döbel, die Bachforelle oder die Regenbogenforelle. Als Synthese ist festzuhalten, dass es durch den kombinierten Einsatz verschiedener Methoden, die sowohl die Expositions- als auch die Effektseite abdecken, im Rahmen des Projektes SchussenAktiv möglich war, zwar nicht im Sinne von Kausalität, wohl aber auf der Basis einer Evidenzkette, die auf von Triebskorn et al. (2003) beschriebenen 192

193 Zusammenfassung und Ausblick Plausibilitätskriterien beruht, Zusammenhänge zwischen (1) der Präsenz von Spurenstoffen in Umweltkompartimenten, (2) toxischen und hormonellen Potentialen in denselben, (3) toxischen und endokrinen Effekten bei exponierten Organismen sowie (4) dem Zustand der Lebensgemeinschaft in der Schussen herzustellen. Zusätzlich konnte als Nebeneffekt gezeigt werden, dass die als Kontrollstelle ausgewählte Probestelle an der Argen zwar insgesamt als deutlich weniger belastet gelten kann als die Probestellen an der Schussen, dass aber auch hier Bedarf besteht, bestimmte Expositionen (z.b. -Sitosterol, Cadmium, Arsen, Quecksilber, Zink) und Effekte (z.b. Acetylcholinesterasehemmung bei Fischen, fehlende Abundanz von Gammariden) genauer zu betrachten um ggf. Ursachen für diese zu eruieren. Für die Fortführung des Projektes über weitere drei Jahre hinweg konnten Fördermittel vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) eingeworben werden. Die Fragestellung von SchussenAktiv ist hierbei in ein erweitertes Forschungsfeld integriert und wird unter dem Namen "SchussenAktivplus" bis Ende 2014 fortgeführt. Da mit der Fertigstellung des Ausbaus der Kläranlage Langwiese voraussichtlich bis Frühjahr 2013 gerechnet werden kann, wird der Zustand der Schussen noch ein Jahr lang vor dem Ausbau der Kläranlage und danach für zwei Jahre nach dem Ausbau untersucht werden können. Literatur Donker, M.H., Zonneveld, C., van Straalen, N.M. (1993). Early reproduction and increased reproductive allocation in metal-adapted populations of the terrestrial isopod Porcellio scaber. Oecologia 96: Triebskorn, R. et al. (2003). Establishing causality between pollution and effects at different levels of biological organization: The VALIMAR project. Human and Ecological Risk Assessment 9(1):

194 Zusammenfassung und Ausblick Tab. 5.1: Zusammenfassende Bewertung der Relevanz der nachgewiesenen Stoffgruppen im Ablauf der KA Langwiese, im Oberflächenwasser und in Biota aus Schussen und Argen. Stoffgruppe KA-Ablauf P 3 Schussen (uh KA) Fische Schussen Gammariden Schussen P 4 (Argen) Fische Argen Relevante Stoffe Arzneimittel Diclofenac, Carbamazepin, Erythromyzin, Clarithromyzin Hormone/Phytohormone ß-Sitosterol PSM Wasser: Carbendazim, DMS, Mecoprop,MCPA; Biota: DDX Süßstoffe Acesulfam, Sucralose Metalle Hg, Cd, Zn, Cu, As, Nickel Biozide Methyltriclosan Alkylphenole Octylphenol Komplexbildner EDTA, DPTA Flammschutzmittel Wasser: Tris-2-chloropropyl)-phosphat; Biota: PBDE PCB PCB6 Bewertung: in hohen Konzentrationen nachgewiesen regelmäßig in mittleren Konzentrationen nachgewiesen in geringen Konzentrationen nachgewiesen nicht nachgewiesen 194

195 Zusammenfassung und Ausblick Tab. 5.2: Zusammenfassung der Resultate der durchgeführten Tests bzw. Untersuchungen vor dem Hintergrund (a) welche Endpunkte adressiert wurden (toxische/endokrine Potentiale/ Wirkungen) und wie stark die Effekte waren. ANALYSEMETHODE Ablauf KA Langwiese P 3 (Schussen) / Bypass Gunzenhaus P 4 (Argen) / Bypass Pflegelberg toxische endokrine toxische endokrine toxische endokrine Potentiale Wirkungen Potentiale Wirkungen Potentiale Wirkungen Potentiale Wirkungen Potentiale Wirkungen Potentiale Wirkungen E-Screen (3) Reportergenassays Östrogenität 2 1 0/1 Reportergenassays Anti-Östrogenität 1 1 0/1 Reportergenassays Anti-Androgenität 0 1 0/1 Reproduktionstests mit Schnecken (3) Vitellogenin 2 0 Reifezustand, Geschlechterverhältnis, GSI Fische 3 0 Fertilität, Geschlechterverhältnis Gammarus 2 Reportergenassays dioxinähnl. Potentiale Reportergenassays gentoxische Potentiale Mikrokerntests Fische 3 1 Acetylcholinesterase 1 2 Stressproteinanalysen 2 1 Histopathologie Fische 3 2 Embryotest Zebrabärbling Labor Embryotest Forellen Bypass 2 2 Parasitiertung, Stessproteine Gammariden 1 0 Makrozoobenthos 3 Bewertung 0 kein Effekt 1 schwacher Effekt 2 mittlerer Effekt 3 starker Effekt 195

196 Danksagung 6. Danksagung Mein Dank gilt dem Ministerium für Umwelt, Klima und Energiewirtschaft Baden-Württemberg für die Förderung dieses Projektes sowie der Vorstudie, der Stiftung "Natur und Umwelt" der Landesbank Baden-Württemberg für Teile der Anschubfinanzierung zu dieser Studie, Herrn Hans-J. Vogel, Ref des RP Tübingen, für die Initialzündung zu diesem Projekt sowie für die sehr gute Zusammenarbeit, für zahlreiche fruchtbare Diskussionen, für die Vorkorrektur dieses Berichts und die sehr guten Verbesserungsvorschläge, Frau Dr. Ursula Maier vom Ministerium für Umwelt, Klima und Energiewirtschaft Baden- Württemberg für die intensive und kritische Durchsicht des Berichts sowie für gute Anregungen, Herrn Lothar Heissel, Ref des RP Tübingen, und seinen Mitarbeitern für die umfassende Unterstützung beim Aufbau der Freilandstationen; hierbei vor allem Herrn Vollmer für den unkonventionellen Transport des Bauwagens nach Wangen, Frau Regierungsvizepräsidentin Grit Puchan, Abt. 1 und Herrn Dietmar Enkel, Abt. 5 Umwelt des RP Tübingen für die Bereitstellung der Räumlichkeiten für die Projekttreffen sowie für ihr Interesse und für die Unterstützung des Projekts, Herrn Harald Hetzenauer, ISF Langenargen, für zahlreichen Anregungen, gute Diskussionen, für seine Geduld beim Erstellen der gemeinsamen Publikation, für die vielen Hilfestellungen vor Ort und für die Vorkorrektur dieses Berichts, Herrn Gerd Schröder, ISF Langenargen, für seinen Einsatz für das Projekt, den Mitarbeitern der Kläranlagen Langwiese und Pflegelberg sowie des AV Unteres Schussental für ihre große Kooperationsbereitschaft, Frau Brigitte Engesser, Herrn Kurt Sarembe und Herrn Andreas Schießl, ISF Langenargen, für den unermüdlichen Einsatz bei den Befischungen sowie Peter Rey für die Unterstützung bei denselben, Vertretern der Fischerei für wichtige Tipps, Herrn Michael Weyhmüller, BBW Achberg, für seinen riesigen Einsatz beim Aufbau der Bypass-Systeme, für das Einbringen und Umsetzen von Ideen, für viel Zeit und für seine Ausdauer beim Kampf gegen Hochwasser und Frost, meinen Mitarbeiterinnen Anja Henneberg, Diana Maier, Katharina Peschke und allen nicht namentlich genannten Kandidatinnen und Kandidaten für ihren unermüdlichen Einsatz bei den Probenahmen, unserer TA Stefanie Krais für ihr immerwährendes Engagement und ihre Hilfe in allen Fällen, Heinz Köhler für die Korrektur dieses Berichtes und seine Unterstützung in allen Bereichen. 196

197 Anhang 1: Chemische Analytik 7.ANHANG Analysewerte für wässrige Proben Parameter Prüfmethode Probe-Nr BG KA- Ablauf BG OFW BG KA- Ablauf BG OFW Messstelle KA-Ablauf OFW (PS 00) OFW (PS 3) OFW (PS 4) KA-Ablauf (D-Probe) KA-Ablauf (E-Probe) OFW (F 3) OFW (F 4) KA-Ablauf (F-Probe) KA-Ablauf (G-Probe) KA-Ablauf (H-Probe) KA-Ablauf (I-Probe) PN-Datum Tetrabrombisphenol A 0 Sonstige Parameter GC ng/l < 130 < 25 < 25 < 25 < 130 < 130 < 25 < 25 < 25 < 25 - < 25 N,N-Dimethylsulfamid 0 Sonstige Parameter HPLC 0,01 0,01 0,01 0,01 µg/l 0,26 0,04 0,24 0,01 0,24 0,25 0,2 < 0,01 0,22 0,21 0,21 0,21 Tolylfluanid 0 Sonstige Parameter HPLC 0,1 0,1 0,1 0,1 µg/l < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 - - < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Diethylamin Aliphatische Amine (Karlsruhe) 0,25 0,05 0,1 0,1 µg/l < 0,25 < 0,05 < 0,05 0,17 < 0,25 < 0,25 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Dimethylamin Aliphatische Amine (Karlsruhe) 0,25 0,05 0,1 0,1 µg/l < 0,25 0,06 0,05 < 0,05 < 0,25 0,30 < 0,1 < 0,1 0,16 0,22 < 0,1 0,13 Ethanolamin Aliphatische Amine (Karlsruhe) 0,75 0,15 0,3 0,3 µg/l < 0,75 0,27 0,21 0,3 < 0,75 < 0,75 < 0,3 < 0,3 < 0,3 < 0,3 < 0,3 < 0,3 Ethylamin Aliphatische Amine (Karlsruhe) 0,5 0,1 0,2 0,2 µg/l < 0,5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,5 < 0,5 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 Methylamin Aliphatische Amine (Karlsruhe) 0,5 0,1 0,2 0,2 µg/l < 0,5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,5 0,37 < 0,2 < 0,2 0,27 0,21 0,28 0,25 4-iso-Nonylphenol Alkylphenole/Bisphenole ng/l < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 4-tert.-Oktylphenol Alkylphenole/Bisphenole ng/l 51 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 < < 5 Bisphenol A Alkylphenole/Bisphenole ng/l 21 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 9, < 5 iso-nonylphenoldiethoxylat Alkylphenole/Bisphenole ng/l < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 Naphthalin-2-sulfonat Aromatische Sulfonate 0,1 0,02 0,1 0,02 µg/l 0,25 0,1 0,05 < 0,02 0,19 0,24 0,04 0,03 0,11 0,07 0,06 < 0,1 4-Methylbenzotriazol Betablocker/Bronchospasmolytika ng/l Methylbenzotriazol Betablocker/Bronchospasmolytika ng/l < Benzotriazol Betablocker/Bronchospasmolytika ng/l N-Acetyl-4-aminoantipyrin Betablocker/Bronchospasmolytika ng/l N-Formyl-4-aminoantipyrin Betablocker/Bronchospasmolytika ng/l Sulfamethoxazol Chemotherapeutika ng/l Cadmium Elemente mit ICP-MS 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 mg/l < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 Kupfer Elemente mit ICP-MS 0,01 0,01 0,01 0,01 mg/l < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Nickel Elemente mit ICP-MS 0,001 0,001 0,001 0,001 mg/l 0,001 0,001 < 0,001 < 0,001 0,002 0,002 < 0,001 < 0,001 0,003 0,002 0,002 0,002 Zink Elemente mit ICP-MS 0,02 0,02 0,02 0,02 mg/l < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 0,02 DTPA (Diethylentriaminpentaacetat) Komplexbildner µg/l 2,1 < 1 < 1 < 1 1,2 2,1 < 1 < 1 < 5 < 5 < 5 8,9 EDTA (Ethylendinitrilotetraacetat) Komplexbildner 0,5 0,5 2,5 0,5 µg/l 30 2,5 3,2 0, , Bromdichlormethan LHKW 0,1 0,1 0,1 0,1 µg/l < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Chloramphenicol Makrolide ng/l < 50 < 10 < 10 < 10 < 50 < 50 < 10 < 10 < 50 < 50 < 50 < 50 Clarithromycin Makrolide ng/l 70 < 10 < 10 < < 10 < 10 < Dehydrato-Erythromycin A Makrolide ng/l < < Carbamazepin Pharmazeutische Wirkstoffe ng/l < Coffein Pharmazeutische Wirkstoffe ng/l < < 25 < 130 < < 25 < 130 < 130 < 130 < 130 Diclofenac Pharmazeutische Wirkstoffe ng/l Naproxen Pharmazeutische Wirkstoffe ng/l Salicylsäure Pharmazeutische Wirkstoffe ng/l < Atrazin PSM mit GC-MS 0,02 0,02 0,05 0,05 µg/l < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 Diuron PSM mit HPLC 0,25 0,05 0,01 0,01 µg/l < 0,25 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,25 < 0,25 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Fenitrothion PSM mit GC-MS 0,05 0,05 0,05 0,05 µg/l < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 197

198 Anhang 1: Chemische Analytik Isoproturon PSM mit HPLC 0,25 0,05 0,02 0,02 µg/l < 0,25 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,25 < 0,25 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 Malathion PSM mit GC-MS 0,01 0,01 0,05 0,05 µg/l < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Pirimicarb PSM mit GC-MS 0,05 0,05 0,05 0,05 µg/l < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Propiconazol PSM mit HPLC 0,1 0,1 0,1 0,1 µg/l < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Simazin PSM mit GC-MS 0,02 0,02 0,02 0,02 µg/l < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02 Terbutryn PSM mit GC-MS 0,05 0,05 0,05 0,05 µg/l < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 0,05 0,07 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 2,4-DP (Dichlorprop) PSM Phenoxy/azide Herbizide 0,05 0,05 0,25 0,05 µg/l 0,1 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,25 < 0,25 < 0,25 < 0,25 MCPA PSM Phenoxy/azide Herbizide 0,05 0,05 0,25 0,05 µg/l < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,25 < 0,25 0,5 < 0,25 MCPP (Mecoprop) PSM Phenoxy/azide Herbizide 0,05 0,05 0,25 0,05 µg/l 0,1 < 0,05 < 0,05 < 0,05 0,08 0,06 < 0,05 < 0,05 < 0,25 < 0,25 0,81 < 0,25 Carbendazim PSM Sulfonylharnstoffe ng/l 64 < 10 < 10 < < Quecksilber Quecksilber mit AFS 0, ,00005 mg/l < 0,00005 < 0,00005 < 0,00005 < 0,00005 < 0,00005 < 0, alpha-Ethinylestradiol Steroidhormone ng/l < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 17-beta-Estradiol Steroidhormone ng/l < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 beta-sitosterol Steroidhormone ng/l 180 < 25 < < < 25 Estron Steroidhormone ng/l < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 Cyclamat Süßstoffe 0,01 0,01 0,01 0,01 µg/l 0,01 0,02 0,03 < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 < 0,01 < 0,01 Sucralose Süßstoffe 0,05 0,05 0,05 0,05 µg/l 0,72 0,06 0,05 < 0,05 0,66 1,3 0,13 < 0,05 1,4 1,4 < 0,05 1,2 Acesulfam Süßstoffe 0,01 0,01 µg/l 1,8 0, ,12 14 Saccharin Süßstoffe 0,01 0,01 µg/l 0,03 < 0,01 0,03 0,02 < 0,01 0,02 2-Ethylhexyldiphenylphosphat Trialkylphosphate ng/l < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 Triethylphosphat Trialkylphosphate ng/l 90 < 25 < 25 < < 25 < < 25 Trikresylphosphat (o-, m- u. p-isomer) Trialkylphosphate ng/l < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 Tri-n-butylphosphat Trialkylphosphate ng/l < 25 < 25 < 25 < < 25 < < 25 Triphenylphosphat Trialkylphosphate ng/l < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 Tris-(2-chlorethyl)-phosphat Trialkylphosphate ng/l 170 < 25 < 25 < < 25 < < 25 Tris-(2-chlorpropyl)-phosphat Trialkylphosphate ng/l < < Tris-(2-ethylhexyl)-phosphat Trialkylphosphate ng/l < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 BDE-100 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-138 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-153 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-154 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-183 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-209 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-28 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-47 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-66 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-85 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 BDE-99 Polybromierte Diphenylether ng/l < 250 < 10 < 10 < 10 < 250 < 250 Anzahl analys. Parameter Anzahl pos. Befunde

199 Anhang 1: Chemische Analytik Analysewerte für Sedimente 199