MiniSeq Systemhandbuch

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1 MiniSeq Systemhandbuch Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren. ILLUMINA EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU Januar 2016 Anpassen einer kurzen End-to-End-Workflow-Anleitung mit dem Custom Protocol Selector support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

2 Dieses Dokument und dessen Inhalt sind Eigentum von Illumina, Inc. und verbundenen Unternehmen ( Illumina ) und ausschließlich für den bestimmungsgemäßen Gebrauch durch den Kunden in Verbindung mit dem Gebrauch des hier beschriebenen Produkts (der hier beschriebenen Produkte) und für keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt. Dieses Dokument und dessen Inhalt dürfen ohne schriftliches Einverständnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw. anderweitig übermittelt, offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden. Illumina überträgt mit diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent, Markenzeichen, Urheberrecht oder bürgerlichen Recht bzw. ähnlichen Rechten an Drittparteien. Die Anweisungen in diesem Dokument müssen von qualifiziertem und entsprechend ausgebildetem Personal genau befolgt werden, damit die in diesem Dokument beschriebene Anwendung der Produkte sicher und ordnungsgemäß erfolgt. Vor der Verwendung dieser Produkte muss der Inhalt dieses Dokuments vollständig gelesen und verstanden worden sein. FALLS NICHT ALLE HIERIN AUFGEFÜHRTEN ANWEISUNGEN VOLLSTÄNDIG GELESEN UND BEFOLGT WERDEN, KÖNNEN PRODUKTSCHÄDEN, VERLETZUNGEN DER BENUTZER UND ANDERER PERSONEN SOWIE ANDERWEITIGER SACHSCHADEN EINTRETEN. ILLUMINA ÜBERNIMMT KEINERLEI HAFTUNG FÜR SCHÄDEN, DIE AUS DER UNSACHGEMÄSSEN VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE (EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE) ENTSTEHEN Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, die kürbisorange Farbe und das Streaming-Basen-Design sind Marken von Illumina, Inc. und/oder ihren Tochtergesellschaften in den USA und/oder anderen Ländern. Alle anderen Namen, Logos und Marken sind Eigentum der jeweiligen Eigentümer. ii Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis iii Kapitel 1 Überblick 1 Einleitung 2 Weitere Ressourcen 3 Gerätekomponenten 4 Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Überblick 8 Vorinstallierte Datenbanken und Genome 11 Kapitel 2 Erste Schritte 13 Starten des Geräts 14 Anpassen der Systemeinstellungen 15 Konfigurieren der Analyseeinstellungen 17 Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien und Geräte 20 Kapitel 3 Sequenzierung 23 Einleitung 24 Sequenzierungsworkflow 25 Vorbereiten der Verbrauchsmaterialien 27 Vorbereiten von Bibliotheken für die Sequenzierung 29 Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs 30 Überwachen des Lauffortschritts 38 Automatischer Nachwaschlauf 41 Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 42 Kapitel 4 Wartung 45 Einleitung 46 Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs 47 Software-Updates 51 Anhang A Fehlerbehebung 53 Dateien für die Fehlerbehebung 54 Fehler beim automatischen Selbsttest 56 RTA-Fehler 59 Workflow für die Rehybridisierung 60 Systemprüfung 63 Netzwerkkonfigurationseinstellungen 66 Anwendungsspezifische Genome 68 Ausschalten des Geräts 69 Anhang B Echtzeitanalyse 71 Überblick über die Echtzeitanalyse 72 Eingabe- und Ausgabedateien 73 Echtzeitanalyse-Workflow 74 Anhang C Ausgabedateien und -ordner 77 Sequenzierungsausgabedateien 78 Ordnerstruktur der Sequenzierungsausgabedaten 79 MiniSeq Systemhandbuch iii

4 Für die Analyse erforderliche Eingabedateien 80 Index 81 Technische Unterstützung 85 iv Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

5 Kapitel 1 Überblick Überblick Einleitung 2 Weitere Ressourcen 3 Gerätekomponenten 4 Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Überblick 8 Vorinstallierte Datenbanken und Genome 11 Kapitel 1 MiniSeq Systemhandbuch 1

6 Überblick Einleitung Das Illumina MiniSeq -System bietet die dem Industriestandard und den hohen Qualitätsanforderungen entsprechende Sequenzierungstechnologie von Illumina und den Bedienkomfort eines benutzerfreundlichen, kostengünstigen Desktopsystems. Merkmale } Sequenzierung mit hohem Qualitätsstandard: Das MiniSeq-System ermöglicht die Sequenzierung von kleinen Genomen und von Amplikonen sowie eine gezielte Anreicherung und RNA-Sequenzierung unter Verwendung geringer Bibliotheks- Volumina. } MiniSeq-Systemsoftware: Im MiniSeq-System ist eine Software-Suite integriert, die die Vorgänge auf dem Gerät steuert, Bilder verarbeitet und Base-Calls generiert. Die Suite enthält zudem eine Software für die Datenanalyse im Gerät sowie Datenübertragungstools, die die Datenanalyse mit anderen Methoden, z. B. BaseSpace, ermöglichen. } Datenanalyse im Gerät: Die Local Run Manager-Software analysiert die Laufdaten gemäß dem für den Lauf angegebenen Analysemodul. Es sind verschiedene Analysemodule in der Software enthalten. } BaseSpace -Integration: Der Sequenzierungsworkflow ist mit BaseSpace, der Genomik-Computing-Umgebung von Illumina für die Laufüberwachung, Datenanalyse, Speicherung und Zusammenarbeit, integriert. Die Ausgabedateien werden zur Analyse in Echtzeit nach BaseSpace bzw. BaseSpace Onsite gestreamt. } Komfortables Laden von Verbrauchsmaterialien: Ein Klemmmechanismus positioniert die Fließzelle beim Laden in das Gerät. Eine vorbefüllte Einweg- Reagenzienkartusche liefert die Reagenzien für den Lauf und den nachfolgenden Gerätewaschlauf. Die Fließzelle und Reagenzienkartusche enthalten eine integrierte Identifikation, um eine genaue Nachverfolgung zu ermöglichen. 2 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

7 Weitere Ressourcen Auf den MiniSeq-Supportseiten der Illumina-Website können Sie auf Dokumentation, Software-Downloads, Schulungsinformationen und Informationen zu kompatiblen Produkten von Illumina zugreifen. Die folgenden Dokumente stehen auf der Website von Illumina zur Verfügung. Ressource Custom Protocol Selector Beschreibung Ein Assistent zum Erstellen einer anwendungsspezifischen End-to-End-Dokumentation, die auf das für den Sequenzierungslauf verwendete Bibliotheksvorbereitungsverfahren, die Laufparameter und die Analysemethode zugeschnitten ist. Weitere Ressourcen MiniSeq-System Handbuch zur Standortvorbereitung (Dokument- Nr ) MiniSeq-System Sicherheits- und Compliance-Handbuch (Dokument- Nr ) RFID Reader mit externer Antenne Compliance-Handbuch (Dokument- Nr ) MiniSeq-System Handbuch zum Denaturieren und Verdünnen von Bibliotheken (Dokument- Nr ) Local Run Manager Softwarehandbuch (Dokument- Nr ) Enthält Spezifikationen für den Laborplatz, die elektrischen Anforderungen und die Umgebungsbedingungen. Bietet Informationen zur Betriebssicherheit, zu Compliance-Erklärungen sowie zu Gerätekennzeichnungen. Bietet Informationen zum integrierten RFID Reader des Geräts, Compliance-Zertifizierungen sowie sicherheitsbezogene Informationen. Bietet Anweisungen zum Denaturieren und Verdünnen von vorbereiteten Bibliotheken für einen Sequenzierungslauf sowie zum Vorbereiten einer optionalen PhiX-Kontrolle. Bietet Informationen zur Verwendung der Local Run Manager-Software und der verfügbaren Analyseoptionen. MiniSeq Systemhandbuch 3

8 Überblick Gerätekomponenten Zum MiniSeq-System gehören ein Touchscreen-Monitor, eine Statusleiste, eine Fließzellenund eine Reagenzienkammer. Abbildung 1 Gerätekomponenten A B C D E F Touchscreen-Monitor: Ermöglicht die Systemkonfiguration und -einrichtung am Gerät über die Benutzeroberfläche der Steuerungssoftware. Ein/Aus-Taste: Mit dieser Taste werden der integrierte Gerätecomputer eingeschaltet und das Betriebssystem aktiviert. USB-Anschlüsse: Ermöglichen den einfachen Anschluss von Peripheriegeräten. Fließzellenkammer: Enthält während eines Sequenzierungslaufs die Fließzelle. Statusleiste: Gibt den Gerätestatus an, z. B. In Arbeit (blau), Überprüfung erforderlich (orange), Bereit zum Sequenzieren (grün) oder dass in den nächsten 24 Stunden ein Waschlauf durchgeführt werden muss (gelb). Reagenzienkammer: Enthält die Reagenzienkartusche und die Flasche für verbrauchte Reagenzien. Fließzellenkammer Der Fließzellentisch verfügt über einen Fließzellenriegel, der die Fließzelle in Position hält, wenn er verriegelt wird. Wenn der Fließzellenriegel geschlossen wird, richten Stifte im unteren Bereich des Riegels die Fließzellenanschlüsse an den Fluidikanschlüssen aus. Abbildung 2 Fließzellenkammer A B C Tür der Fließzellenkammer Fließzellenriegel Fließzellentisch 4 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

9 D E Fließzelle Freigabeknopf des Fließzellenriegels Die thermische Station unter dem Fließzellentisch steuert die für die Clusterbildung und die Sequenzierung erforderlichen Temperaturänderungen. Reagenzienkammer HINWEIS Stellen Sie keine Gegenstände neben der Fließzellenkammer auf das Gerät. Zum Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs auf dem MiniSeq-System ist der Zugang zur Reagenzienkammer erforderlich, um die Verbrauchsmaterialien für den Lauf zu laden und die Flasche für verbrauchte Reagenzien zu leeren. Abbildung 3 Reagenzienkammer Gerätekomponenten A B C Flasche für verbrauchte Reagenzien: Hat einen Schraubdeckel, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit beim Transport der Flasche verschüttet wird. Reagenzienkartusche: Mit Reagenzien vorgefülltes Verbrauchsmaterial für den Einmalgebrauch. Tür der Reagenzienkammer: Bietet Zugang zur Reagenzienkammer. Die Tür der Reagenzienkammer lässt sich an den Scharnieren an der Unterseite des Geräts nach außen öffnen. Um die Tür zu öffnen, ziehen Sie sie vorsichtig an den Seitenkanten nach vorne. HINWEIS Stellen Sie keine Gegenstände auf die Tür der Reagenzienkammer. Die Kammertür ist nicht zur Nutzung als Ablage geeignet. Ein/Aus-Taste Mit der Ein/Aus-Taste auf der Vorderseite des Geräts werden das Gerät und der Gerätecomputer eingeschaltet. Die Ein/Aus-Taste führt die folgenden Aktionen je nach Status der Gerätenetzspannung aus. Netzspannungsstatus Gerät ist ausgeschaltet Aktion Drücken Sie die Ein/Aus-Taste kurz, um das Gerät einzuschalten. MiniSeq Systemhandbuch 5

10 Überblick Netzspannungsstatus Gerät ist eingeschaltet Gerät ist eingeschaltet Aktion Drücken Sie die Ein/Aus-Taste kurz, um das Gerät auszuschalten. Ein Dialogfeld erscheint, um ein normales Herunterfahren des Geräts zu bestätigen. Halten Sie die Ein/Aus-Taste für 10 Sekunden gedrückt, um das Herunterfahren des Geräts und des Gerätecomputers zu erzwingen. Verwenden Sie diese Methode zum Ausschalten des Geräts nur dann, wenn das Gerät nicht mehr reagiert. HINWEIS Schalten Sie das Gerät unter normalen Bedingungen nicht aus. Wenn Sie das Gerät während eines Sequenzierungslaufs ausschalten, wird der Lauf umgehend beendet. Das Beenden eines Laufs ist endgültig. Die Verbrauchsmaterialien können nicht wiederverwendet werden und die Sequenzierungsdaten werden nicht gespeichert. Systemsoftware Die Gerätesoftware-Suite umfasst integrierte Anwendungen für die Durchführung von Sequenzierungsläufen und die Geräteanalyse. } MiniSeq Control Software: Die Steuerungssoftware führt Sie durch die Schritte zur Konfiguration eines Sequenzierungslaufs, steuert die Vorgänge auf dem Gerät und gibt während des Laufs einen Überblick über die Laufstatistik. } Echtzeitanalyse-Software (RTA): RTA führt die Bildanalyse und das Base-Calling während des Laufs durch. Weitere Informationen finden Sie unter Überblick über die Echtzeitanalyse auf Seite 72. } Local Run Manager: Bevor Sie mit der Sequenzierung beginnen, geben Sie mit Local Run Manager die Laufparameter und die Analysemethode an. Nach der Sequenzierung wird die Datenanalyse im Gerät automatisch gestartet. Weitere Informationen finden Sie im Local Run Manager Softwarehandbuch (Dokument-Nr ). Statussymbole Ein Statussymbol rechts oben in der Benutzeroberfläche der Steuerungssoftware informiert Sie über Änderungen der Bedingungen während der Laufkonfiguration bzw. des Laufs. Statussymbol Statusname Beschreibung Status OK Das System funktioniert normal. Verarbeitung Die Verarbeitung im Gerät läuft. Achtung Ihre Aufmerksamkeit ist erforderlich. Warnung Fehler Eine Warnung ist aufgetreten. Warnungen stoppen einen Lauf nicht und es ist keine Aktion erforderlich, damit der Lauf fortgesetzt werden kann. Ein Fehler ist aufgetreten. Bei Fehlern sind Maßnahmen erforderlich, damit der Lauf fortgesetzt werden kann. 6 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

11 Wenn eine Bedingungsänderung auftritt, blinkt das Symbol, um Sie darauf aufmerksam zu machen. Wählen Sie das Symbol aus, um eine Beschreibung der Bedingung anzusehen. Wählen Sie Acknowledge (Bestätigen), um die Meldung zu akzeptieren, und Close (Schließen), um das Dialogfeld zu schließen. Gerätekomponenten MiniSeq Systemhandbuch 7

12 Überblick Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Überblick Zum Durchführen eines Sequenzierungslaufs auf dem MiniSeq-System-System benötigen Sie ein MiniSeq-Kit-Kit für den Einmalgebrauch. Jedes Kit enthält eine Fließzelle sowie die zur Durchführung eines Sequenzierungslaufs benötigten Reagenzien. Die Fließzelle und Reagenzienkartusche verwenden das RFID-Tracking (Radio Frequency Identification), um die Verbrauchsmaterialien genau nachzuverfolgen und die Kompatibilität mit den angegebenen Laufparametern sicherzustellen. Fließzelle Die Fließzelle ist ein Glasträger, auf dem die Clusterbildung und die Sequenzierreaktion stattfinden. Die Fließzelle befindet sich in einer Fließzellenkartusche. Abbildung 4 Komponenten der Fließzelle A B C D Bildgebungsbereich Fließzellendichtung Auslassanschluss Einlassanschluss Reagenzien werden der Fließzelle durch den Einlassanschluss zugeführt, passieren den Bildgebungsbereich der einzelnen Lane und verlassen die Fließzelle durch den Auslassanschluss. Die Fließzelle wird in trockenem Zustand in einem Fließzellenbehälter mit Folienverpackung geliefert. Lagern Sie die Fließzelle bis zu ihrem Gebrauch in der versiegelten Folienverpackung bei 2 C bis 8 C. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Vorbereiten der Fließzelle auf Seite 27. Überblick über die Reagenzienkartusche Die Reagenzienkartusche ist ein Verbrauchsmaterial für den einmaligen Gebrauch mit folienversiegelten Behältern, die mit Clusterbildungs-, Sequenzierungs- und Waschlaufreagenzien vorgefüllt sind. 8 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

13 Abbildung 5 Reagenzienkartusche Die Reagenzienkartusche enthält einen designierten Behälter zum Laden von vorbereiteten Bibliotheken. Nach Beginn des Laufs werden die Bibliotheken automatisch von der Reagenzienkartusche an die Fließzelle übertragen. WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Tragen Sie eine entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel. Verbrauchte Reagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden Sicherheitsstandards Ihrer Region. Weitere umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html. Lagern Sie die Reagenzienkartusche bis zu ihrem Gebrauch bei -25 C bis -15 C. Weitere Informationen finden Sie unter Vorbereiten der Reagenzienkartusche auf Seite 27. Reservierte Behälter Abbildung 6 Nummerierte Behälter Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Überblick Position Beschreibung 13, 14 und 15 Reserviert für optionale anwendungsspezifische Primer 16 Laden der Bibliotheken MiniSeq Systemhandbuch 9

14 Überblick Herausnehmbarer Behälter in Position 9 Die vorgefüllte Reagenzienkartusche beinhaltet ein Denaturierungsreagenz in Position 9, das Formamid enthält. Um die sichere Entsorgung nicht verwendeter Reagenzien nach dem Sequenzierungslauf zu erleichtern, ist dieser Behälter herausnehmbar. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 auf Seite Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

15 Vorinstallierte Datenbanken und Genome Die meisten Analysemethoden benötigen zur Durchführung des Alignments eine Referenz. Auf dem Gerätecomputer sind mehrere Referenzdatenbanken und Genome vorinstalliert. Vorinstalliert Datenbanken Genome Beschreibung mirbase für Menschen dbsnp für Menschen refgene für Menschen Arabidopsis thaliana Hausrind (Bos taurus) E. coli Stamm DH10B E. coli Stamm MG1655 Taufliegen (Drosophila melanogaster) Mensch (Homo sapiens) Build hg19 Hausmaus (Mus musculus) PhiX Wanderratte (Rattus norvegicus) Rhodobacter sphaeroides Backhefe (Saccharomyces cerevisiae S288C) Staphylococcus aureus NCTC 8325 Vorinstallierte Datenbanken und Genome MiniSeq Systemhandbuch 11

16 12 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

17 Kapitel 2 Erste Schritte Erste Schritte Starten des Geräts 14 Anpassen der Systemeinstellungen 15 Konfigurieren der Analyseeinstellungen 17 Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien und Geräte 20 Kapitel 2 MiniSeq Systemhandbuch 13

18 Erste Schritte Starten des Geräts Vergewissern Sie sich, dass das Gerät ordnungsgemäß installiert, initialisiert und konfiguriert wurde. Wenn Sie das Gerät starten, bevor es betriebsbereit ist, wird es ggf. beschädigt. 1 Stellen Sie den Netzschalter auf die Position I (Ein). Abbildung 7 Netzschalter auf der Rückseite des Geräts 2 Drücken Sie die Ein/Aus-Taste über der Reagenzienkammer. Mit der Ein/Aus-Taste werden der integrierte Gerätecomputer eingeschaltet und das Betriebssystem aktiviert. Abbildung 8 Ein/Aus-Taste auf der Vorderseite des Geräts 3 Warten Sie, bis das Betriebssystem vollständig geladen wurde. Die MiniSeq Control Software startet und beginnt automatisch mit der Initialisierung des Systems. Wenn die Initialisierung abgeschlossen ist, wird der Startbildschirm geöffnet. 4 Melden Sie sich mit dem Standardbenutzernamen und dem Standardkennwort an: } Benutzername: sbsuser } Kennwort: sbs123 Anderenfalls melden Sie sich mithilfe der vorgegebenen Anmeldeinformationen für Ihren Standort an. 14 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

19 Anpassen der Systemeinstellungen Die Steuerungssoftware enthält benutzerdefinierbare Einstellungen für die Geräte- Identifikation und die folgenden Workflow-Voreinstellungen. } Entsorgung von Verbrauchsmaterialien am Ende des Laufs } Bestätigung des Selbsttests überspringen, um den Lauf automatisch zu starten } Verwendung der Bildschirmtastatur bei der Laufkonfiguration } Aktivieren der Audio-Signale Anpassen der Geräte-Identifikation 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Um ein Avatarbild für das Gerät auszuwählen, wählen Sie Browse (Durchsuchen) und navigieren Sie zu dem gewünschten Bild. 3 Geben Sie im Feld Nick Name (Kurzname) einen bevorzugten Namen für das Gerät ein. 4 Wählen Sie Save (Speichern), um die Einstellungen zu speichern und mit dem nächsten Bildschirm fortzufahren. Das Bild und der Name erscheinen links oben auf jedem Bildschirm. Festlegen der Option zur automatischen Entsorgung von Verbrauchsmaterialien 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Purge consumables at end of run (Verbrauchsmaterialien am Ende des Laufs entsorgen). Wenn diese Option aktiviert ist, werden nach jedem Lauf nicht verwendete Reagenzien automatisch aus der Reagenzienkartusche in den Behälter für verbrauchte Reagenzien befördert. Ist die Option deaktiviert, verbleiben die nicht verwendeten Reagenzien in der Reagenzienkartusche. HINWEIS Durch die automatische Entsorgung von Verbrauchsmaterialien nimmt der Workflow mehr Zeit in Anspruch. Bei einem Lauf mit 300 Zyklen (2 151) dauert die Entsorgung von nicht verwendeten Reagenzien etwa 50 Minuten. 3 Wählen Sie Save (Speichern), um die Einstellungen zu speichern und den Bildschirm zu schließen. Anpassen der Systemeinstellungen Auswahl der Option zum automatischen Starten des Laufs 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Skip pre-run check confirmation (Bestätigung des Selbsttests überspringen). MiniSeq Systemhandbuch 15

20 Erste Schritte Dadurch wird der Sequenzierungslauf automatisch gestartet, nachdem der automatische Selbsttest erfolgreich durchgeführt wurde. Wenn diese Option deaktiviert ist, müssen Sie den Lauf nach der Durchführung des Selbsttests manuell starten. 3 Wählen Sie Save (Speichern). Festlegen der automatischen Suche nach Software-Updates 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatically check for software updates on BaseSpace (Automatisch nach Software-Updates auf BaseSpace suchen). Zur Durchführung dieser Option wird eine Internetverbindung benötigt. 3 Wählen Sie Save (Speichern), um die Einstellungen zu speichern und den Bildschirm zu schließen. Auswahl der Option zur Verwendung der Bildschirmtastatur 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Use on-screen keyboard (Bildschirmtastatur verwenden). Sie können jetzt die Bildschirmtastatur zur Eingabe von Informationen bei der Konfiguration des Laufs verwenden. 3 Wählen Sie Save (Speichern). Aktivieren der Audio-Signale 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Customization (Anpassung des Systems). 2 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Play audio (Audio abspielen), um die Audio- Signale für die folgenden Ereignisse einzuschalten: } Geräte-Initialisierung } Starten eines Laufs } Auftreten von Fehlern } Benutzerinteraktion erforderlich } Ende eines Laufs 3 Wählen Sie Save (Speichern). 16 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

21 Konfigurieren der Analyseeinstellungen Die Steuerungssoftware bietet die folgenden Optionen für die Datenübertragung und die nachfolgende Analyse: } BaseSpace: Die Daten werden zur Analyse auf BaseSpace an Illumina BaseSpace gesendet. } BaseSpace Onsite: Die Daten werden an den BaseSpace Onsite LT-Server gesendet und auf dem Server analysiert. } Local Run Manager: Die Daten werden an den angegebenen Speicherort des Ausgabeordners gesendet und von einem Modul von Local Run Manager analysiert. } Standalone (Eigenständig): Die Daten werden für die spätere Analyse im angegebenen Ausgabeordner gespeichert. Auswählen von BaseSpace 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Configuration (Systemkonfiguration). 2 Wählen Sie Analysis Configuration (Analysekonfiguration). 3 Wählen Sie BaseSpace. 4 [Optional] Legen Sie Standardanmeldedaten für BaseSpace fest. a b c Geben Sie unter User name (Benutzername) und Password (Kennwort) die entsprechenden Informationen ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Save the credentials as the default (Anmeldedaten als Standard speichern). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bypass Analysis Method login screen (Anmeldebildschirm für Analysemethode überpringen). Konfigurieren der Analyseeinstellungen 5 [Optional] Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Output Folder (Ausgabeordner) und wählen Sie Browse (Durchsuchen), um zum bevorzugten Speicherort für den Ausgabeordner zu navigieren. Bei dieser Einstellung wird eine Kopie der Base-Call-Dateien (BCL) am angegebenen Speicherort gespeichert. 6 [Optional] Wählen Sie Send instrument health information to Illumina (Gerätestatusinformationen an Illumina senden), um Protokolldateien an Illumina zu senden. Zur Durchführung dieser Option wird eine Internetverbindung benötigt. 7 Wählen Sie Save (Speichern). Auswählen von BaseSpace Onsite 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Configuration (Systemkonfiguration). 2 Wählen Sie Analysis Configuration (Analysekonfiguration). 3 Wählen Sie BaseSpace Onsite. 4 [Optional] Legen Sie Standardanmeldedaten für BaseSpace Onsite fest. MiniSeq Systemhandbuch 17

22 Erste Schritte a b c Geben Sie unter User name (Benutzername) und Password (Kennwort) die entsprechenden Informationen ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Save the credentials as the default (Anmeldedaten als Standard speichern). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bypass Analysis Method login screen (Anmeldebildschirm für Analysemethode überpringen). 5 Geben Sie im Feld Server Name (Servername) den vollständigen Dateipfad zu Ihrem BaseSpace Onsite-Server ein. 6 [Optional] Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Output Folder (Ausgabeordner) und wählen Sie Browse (Durchsuchen), um zum bevorzugten Speicherort für den Ausgabeordner zu navigieren. Bei dieser Einstellung wird eine Kopie der Base-Call-Dateien (BCL) am angegebenen Speicherort gespeichert. 7 [Optional] Wählen Sie Send instrument health information to Illumina (Gerätestatusinformationen an Illumina senden), um Protokolldateien an Illumina zu senden. Zur Durchführung dieser Option wird eine Internetverbindung benötigt. 8 Wählen Sie Save (Speichern). Auswählen von Local Run Manager 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Configuration (Systemkonfiguration). 2 Wählen Sie Analysis Configuration (Analysekonfiguration). 3 Wählen Sie Local Run Manager. 4 [Optional] Legen Sie Standardanmeldedaten für Local Run Manager fest. a b c Geben Sie unter User name (Benutzername) und Password (Kennwort) die entsprechenden Informationen ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Save the credentials as the default (Anmeldedaten als Standard speichern). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bypass Analysis Method login screen (Anmeldebildschirm für Analysemethode überpringen). 5 [Optional] Wählen Sie Use Run Monitoring (Laufüberwachung verwenden), um den Lauf mithilfe von Visualisierungstools auf BaseSpace zu überwachen. Hierfür sind eine Internetverbindung und eine Anmeldung bei BaseSpace erforderlich. 6 [Optional] Legen Sie Standardanmeldedaten für BaseSpace fest. a b Geben Sie unter User name (Benutzername) und Password (Kennwort) die entsprechenden Informationen ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Save the credentials as the default (Anmeldedaten als Standard speichern). 7 Wählen Sie Browse (Durchsuchen) und navigieren Sie zum Speicherort des bevorzugten Ausgabeordners. 8 [Optional] Wählen Sie Send instrument health information to Illumina (Gerätestatusinformationen an Illumina senden), um Protokolldateien an Illumina zu senden. Zur Durchführung dieser Option wird eine Internetverbindung benötigt. 18 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

23 9 Wählen Sie Save (Speichern). Auswählen von Standalone (Eigenständig) 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Configuration (Systemkonfiguration). 2 Wählen Sie Analysis Configuration (Analysekonfiguration). 3 Wählen Sie Standalone (Eigenständig). 4 [Optional] Wählen Sie Use Run Monitoring (Laufüberwachung verwenden), um den Lauf mithilfe von Visualisierungstools auf BaseSpace zu überwachen. Hierfür sind eine Internetverbindung und eine Anmeldung bei BaseSpace erforderlich. 5 [Optional] Legen Sie Standardanmeldedaten für BaseSpace fest. a b Geben Sie unter User name (Benutzername) und Password (Kennwort) die entsprechenden Informationen ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Save the credentials as the default (Anmeldedaten als Standard speichern). 6 Wählen Sie Browse (Durchsuchen) und navigieren Sie zum Speicherort des bevorzugten Ausgabeordners. 7 [Optional] Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Send instrument health information to Illumina (Gerätestatusinformationen an Illumina senden), um Protokolldateien an Illumina zu senden. Zur Durchführung dieser Option wird eine Internetverbindung benötigt. 8 Wählen Sie Save (Speichern). Konfigurieren der Analyseeinstellungen MiniSeq Systemhandbuch 19

24 Erste Schritte Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien und Geräte Die folgenden Verbrauchsmaterialien und Geräte werden auf dem MiniSeq-System verwendet. Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien für Sequenzierungsläufe Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck 1 N NaOH (Natriumhydroxid) Allgemeiner Laborlieferant Bibliotheksdenaturierung, verdünnt auf 0,1 N 200 mm Tris-HCl, ph7 Allgemeiner Laborlieferant Bibliotheksneutralisation nach der Denaturierung Isopropylalkoholtupfer, 70 % oder VWR, Katalog-Nr (oder vergleichbar) Reinigung der Fließzelle und allgemeine Verwendung Ethanol, 70 % Allgemeiner Laborlieferant Einweg-Handschuhe, Allgemeiner Laborlieferant Allgemeine Verwendung ungepudert Labortücher, fusselfrei VWR, Katalog-Nr (oder vergleichbar) Reinigung der Fließzelle Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien für die Gerätewartung Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck NaOCl, 5 % (Natriumhypochlorit) Tween 20 Sigma-Aldrich, Katalog-Nr (oder vergleichbares Produkt in Laborqualität) Sigma-Aldrich, Katalognr. P7949 Durchführen eines manuellen Nachwaschlaufs; verdünnt auf 0,12 % Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs; verdünnt auf 0,05 % Wasser, Laborqualität Allgemeiner Laborlieferant Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs Richtlinien für Wasser in Laborqualität Bei Geräteverfahren sollte immer deionisiertes Wasser bzw. Wasser in Laborqualität verwendet werden. Verwenden Sie niemals Leitungswasser. Verwenden Sie nur die folgenden Wasserarten oder -äquivalente: } Deionisiertes Wasser } Illumina PW1 } 18 Megohm (MΩ)-Wasser } Milli-Q-Wasser } Super-Q-Wasser } Wasser in Molekularbiologie-Qualität 20 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

25 Vom Benutzer bereitzustellende Geräte Element Gefrierschrank, -25 C bis -15 C, frostfrei Eiskübel Kühlschrank, 2 C bis 8 C Quelle Allgemeiner Laborlieferant Allgemeiner Laborlieferant Allgemeiner Laborlieferant Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien und Geräte MiniSeq Systemhandbuch 21

26 22 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

27 Kapitel 3 Sequenzierung Sequenzierung Einleitung 24 Sequenzierungsworkflow 25 Vorbereiten der Verbrauchsmaterialien 27 Vorbereiten von Bibliotheken für die Sequenzierung 29 Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs 30 Überwachen des Lauffortschritts 38 Automatischer Nachwaschlauf 41 Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 42 Kapitel 3 MiniSeq Systemhandbuch 23

28 Sequenzierung Einleitung Um auf dem MiniSeq-System einen Sequenzierungslauf durchzuführen, bereiten Sie die Verbrauchsmaterialien für den Lauf vor und folgen Sie dann den Anweisungen der Software zur Konfiguration des Sequenzierungslaufs. Workflow-Überblick Clusterbildung Während der Clusterbildung werden einzelne DNA-Moleküle an der Oberfläche der Fließzelle gebunden und dann amplifiziert, um Cluster zu bilden. Sequenzierung Cluster werden mithilfe einer Zweikanal-Sequenzierungschemie und Filterkombinationen aufgenommen, die jedem der Fluoreszenz-Kettenterminatoren entsprechen. Nachdem die Bildgebung einer Platte auf der Fließzelle abgeschlossen ist, wird die nächste Platte aufgenommen. Dieser Vorgang wird für jeden Sequenzierungszyklus wiederholt. Im Anschluss an die Bildanalyse führt die Software das Base-Calling, das Filtern und die Qualitätsbewertung durch. Analyse Während der Durchführung des Laufs überträgt die Steuerungssoftware automatisch Base- Call-Dateien (BCL) zwecks Datenanalyse an den angegebenen Ausgabespeicherort. Je nach Anwendung und der für das System ausgewählten Analysekonfiguration stehen mehrere Analysemethoden zur Verfügung. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Konfigurieren der Analyseeinstellungen auf Seite 17. Dauer eines Sequenzierungslaufs Die Dauer eines Sequenzierungslaufs hängt von der Anzahl der durchgeführten Zyklen ab. Die maximale Lauflänge ist ein Paired-End-Lauf mit 150 Zyklen zuzüglich bis zu zwei Index-Reads mit je acht Zyklen. Informationen über die Laufdauer und andere Systemspezifikationen erhalten Sie auf der Seite MiniSeq-System-Spezifikationen der Illumina-Website. Anzahl der Zyklen in einem Read Bei einem Sequenzierungslauf ist die Anzahl der in einem Read ausgeführten Zyklen um einen Zyklus höher als die Anzahl der analysierten Zyklen. Zur Durchführung eines Paired-End-Laufs mit 150 Zyklen konfigurieren Sie z. B. den Lauf für 151 Zyklen pro Read (2 151), sodass sich eine Gesamtanzahl von 302 Zyklen ergibt. Am Ende des Laufs werden Zyklen analysiert. Der zusätzliche Zyklus bei jedem Read wird für Phasierungs- und Vorphasierungsberechnungen verwendet. 24 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

29 Sequenzierungsworkflow Die Laufkonfigurationsschritte hängen von der für den Lauf angegebenen Analysekonfiguration ab. } Standalone (Eigenständig): Nach dem Vorbereiten und Laden der Verbrauchsmaterialien werden alle Laufparameter über die Benutzeroberfläche von MiniSeq Control Software angegeben. } BaseSpace, BaseSpace Onsite oder Local Run Manager: Bevor Sie den Lauf auf dem Gerät konfigurieren, vergeben Sie einen Laufnamen und geben Sie die Laufparameter auf der Registerkarte BaseSpace Prep (BaseSpace-Vorbereitung) oder mithilfe von Local Run Manager an. Wählen Sie nach dem Vorbereiten der Verbrauchsmaterialien den Laufnamen in der MiniSeq Control Software und laden Sie anschließend die Verbrauchsmaterialien für den Lauf. Workflow (Eigenständige Konfiguration) Bereiten Sie eine neue Reagenzienkartusche vor: auftauen und überprüfen. Bereiten Sie eine neue Fließzelle vor: Bringen Sie sie auf Raumtemperatur und packen Sie sie aus. Sequenzierungsworkflow Denaturieren und verdünnen Sie die Bibliotheken. Weitere Informationen hierzu finden Sie im MiniSeq-System Handbuch zum Denaturieren und Verdünnen von Bibliotheken (Dokument- Nr ). Geben Sie die Bibliothekslösung in die Reagenzienkartusche in Behälter Nr. 16. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche der Software Sequence (Sequenzieren) aus. Laden Sie die Fließzelle und die Reagenzienkartusche. Leeren Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien und setzen Sie sie wieder ein. Geben Sie auf dem Laufkonfigurationsbildschirm die Laufparameter an. Wählen Sie nach Abschluss des Selbsttests Start (Starten). Überwachen Sie den Lauf auf dem Gerätebildschirm über BaseSpace, wenn die Überwachung aktiviert ist, oder über einen Netzwerkcomputer unter Verwendung des Sequenzierungsanalyse-Viewers. Die Daten werden in den angegebenen Ausgabeordner übertragen. MiniSeq Systemhandbuch 25

30 Sequenzierung Nach Abschluss der Sequenzierung beginnt automatisch ein Gerätewaschlauf. Workflow (BaseSpace- oder Local Run Manager-Konfiguration) Geben Sie die Laufparameter auf BaseSpace, BaseSpace Onsite oder Local Run Manager an. Bereiten Sie eine neue Reagenzienkartusche vor: auftauen und überprüfen. Bereiten Sie eine neue Fließzelle vor: auf Raumtemperatur bringen, auspacken und inspizieren. Denaturieren und verdünnen Sie die Bibliotheken. Weitere Informationen hierzu finden Sie im MiniSeq-System Handbuch zum Denaturieren und Verdünnen von Bibliotheken (Dokument- Nr ). Geben Sie die Bibliothekslösung in die Reagenzienkartusche in Behälter Nr. 16. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche der Software Sequence (Sequenzieren), um den Lauf zu konfigurieren. Wählen Sie den Laufnamen aus, der auf BaseSpace, BaseSpace Onsite oder Local Run Manager angegeben wurde. Setzen Sie die Fließzelle ein. Laden Sie die Reagenzienkartusche. Leeren Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien und setzen Sie sie wieder ein. Überprüfen Sie auf dem Laufkonfigurationsbildschirm die Laufparameter. Wählen Sie nach Abschluss des Selbsttests Start (Starten). Überwachen Sie den Lauf auf dem Gerätebildschirm über BaseSpace oder über einen Netzwerkcomputer unter Verwendung des Sequenzierungsanalyse-Viewers. Die Daten werden an BaseSpace, BaseSpace Onsite bzw. den angegebenen Ausgabeordner übertragen. Nach Abschluss der Sequenzierung beginnt automatisch ein Gerätewaschlauf. 26 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

31 Vorbereiten der Verbrauchsmaterialien Vorbereiten der Reagenzienkartusche 1 Nehmen Sie die Reagenzienkartusche aus dem Lagerort mit einer Temperatur von -25 C bis -15 C. 2 Tauen Sie die Reagenzien in einem Wasserbad gemäß den Angaben in der folgenden Tabelle auf. Tauchen Sie die Kartusche nicht in Wasser. Wenn die Reagenzien aufgetaut sind, trocknen Sie zuerst die Basis der Kartusche, bevor Sie fortfahren. Methode Auftauzeit Stabilitätsgrenze Wasserbad von 37 C 35 Minuten Bis zu 2 Stunden Wasserbad mit Raumtemperatur (19 C bis 25 C) 90 Minuten Bis zu 24 Stunden Wenn Sie in einem Wasserbad mehrere Kartuschen auftauen, verlängert sich die Auftauzeit. Alternativ können Sie die Reagenzien mit folgenden Methoden auftauen. Methode Auftauzeit Stabilitätsgrenze Bei Raumtemperatur 5 Stunden Bis zu 24 Stunden (19 C bis 25 C) Gekühlt bei 2 C bis 8 C 18 Stunden Bis zu 72 Stunden 3 Invertieren Sie die Kartuschen fünf Mal, um die Reagenzien zu mischen. 4 Inspizieren Sie die großen Behälter auf der Unterseite der Kartusche, um sicherzustellen, dass die Reagenzien aufgetaut und die Behälter frei von Eiskristallen sind. 5 Klopfen Sie leicht auf den Tisch, um die Anzahl der Luftblasen zu verringern. Vorbereiten der Verbrauchsmaterialien Vorbereiten der Fließzelle 1 Nehmen Sie ein neues Fließzellenpaket aus dem Lagerort mit einer Temperatur von 2 C bis 8 C. 2 Legen Sie das verschlossene Fließzellenpaket bei Raumtemperatur für 30 Minuten beiseite. HINWEIS Vermeiden Sie ein mehrmaliges Abkühlen und Erwärmen der Fließzelle. 3 Nehmen Sie den Fließzellenbehälter aus der Folienverpackung. 4 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Handschuhe an. 5 Greifen Sie die Fließzelle an der Kunststoffkartusche und nehmen Sie sie aus dem Behälter. MiniSeq Systemhandbuch 27

32 Sequenzierung Abbildung 9 Herausnehmen der Fließzelle 6 Reinigen Sie die Glasoberfläche der Fließzelle mit einem fusselfreien Alkoholtupfer. 7 Trocknen Sie sie anschließend mit einem fusselfreien Reinigungstuch für Objektive ab. Gehen Sie um die schwarze Fließzellendichtung herum behutsam vor. 8 Prüfen Sie die Fließzellenanschlüsse auf etwaige Verstopfungen. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung gut sitzt. 28 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

33 Vorbereiten von Bibliotheken für die Sequenzierung Denaturieren und Verdünnen von Bibliotheken Bevor Sie die Bibliotheken in die Reagenzienkartusche laden, müssen Sie sie denaturieren und verdünnen und optional eine PhiX-Kontrolle hinzugeben. Weitere Informationen finden Sie im MiniSeq-System Handbuch zum Denaturieren und Verdünnen von Bibliotheken (Dokument-Nr ). Das Ladevolumen für das MiniSeq-System beträgt 500 µl bei einer Ladekonzentration von 1,8 pm. Die Ladekonzentration kann jedoch je nach Bibliotheksvorbereitungs- und Quantifizierungsmethode variieren. Laden der Bibliotheken in die Reagenzienkartusche 1 Reinigen Sie die Verschlussfolie, die den mit Load Library Here (Bibliothek hier laden) beschrifteten Behälter Nr. 16 abdeckt, mit einem fusselfreien Tuch. 2 Durchstechen Sie die Folie mit einer sauberen 1-ml-Pipettenspitze. 3 Geben Sie 500 µl vorbereitete Bibliotheken in Behälter Nr. 16. Achten Sie beim Zuführen der Bibliotheken darauf, die Verschlussfolie nicht zu berühren. Abbildung 10 Laden der Bibliotheken Vorbereiten von Bibliotheken für die Sequenzierung MiniSeq Systemhandbuch 29

34 Sequenzierung Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs Die Schritte für die Laufkonfiguration sind je nach Systemkonfiguration unterschiedlich: } Eigenständige Konfiguration: Sie werden aufgefordert, die Laufparameter im Laufkonfigurationsbildschirm der Steuerungssoftware festzulegen. } BaseSpace- oder Local Run Manager-Konfiguration: Sie werden aufgefordert, sich anzumelden und in BaseSpace oder Local Run Manager aus einer Liste mit vordefinierten Läufen auszuwählen. Konfiguration eines Laufs (Eigenständige Konfiguration) 1 Wählen Sie im Startbildschirm die Option Sequence (Sequenzieren). Der Befehl Sequence (Sequenzieren) gibt die Verbrauchsmaterialien aus dem vorherigen Lauf frei und öffnet eine Reihe von Bildschirmen für die Laufkonfiguration. Einsetzen der Fließzelle 1 Öffnen Sie die Tür der Fließzellenkammer. 2 Drücken Sie den Freigabeknopf rechts vom Fließzellenriegel. Abbildung 11 Geöffneter Fließzellenriegel 3 Entfernen Sie ggf. die gebrauchte Fließzelle aus dem vorherigen Lauf. 4 Stellen Sie sicher, dass der Fließzellentisch sauber ist. Wenn Schmutzpartikel vorhanden sind, reinigen Sie den Fließzellentisch mit einem Alkoholtupfer. 5 Platzieren Sie die Fließzelle über die Ausrichtungsstifte auf dem Fließzellentisch. Abbildung 12 Fließzelle auf Tisch platzieren 6 Schließen Sie den Fließzellenriegel, um die Fließzelle zu sichern. 30 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

35 Abbildung 13 Geschlossener Fließzellenriegel 7 Schließen Sie die Tür der Fließzellenkammer. Einsetzen der Reagenzienkartusche 1 Öffnen Sie die Tür der Reagenzienkammer. 2 Entfernen Sie ggf. die gebrauchte Reagenzienkartusche. HINWEIS Um die sichere Entsorgung nicht verwendeter Reagenzien, die Formamid enthalten, zu erleichtern, lässt sich der Behälter in Position 9 herausnehmen. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 auf Seite Schieben Sie die Reagenzienkartusche bis zum Anschlag in die Reagenzienkammer. Abbildung 14 Einsetzen der Reagenzienkartusche Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs Leeren der Flasche für verbrauchte Reagenzien 1 Nehmen Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien aus der Kammer. MiniSeq Systemhandbuch 31

36 Sequenzierung Abbildung 15 Entfernen der Flasche für verbrauchte Reagenzien 2 Verschließen Sie die Flaschenöffnung mit dem Schraubdeckel, um zu verhindern, dass beim Transportieren der Flasche Flüssigkeit verschüttet wird. Abbildung 16 Verschließen der Flasche für verbrauchte Reagenzien 3 Entsorgen Sie den Inhalt der Flasche gemäß den geltenden Vorschriften. WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Tragen Sie eine entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel. Verbrauchte Reagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden Sicherheitsstandards Ihrer Region. Weitere umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html. 4 Schieben Sie die leere Flasche für verbrauchte Reagenzien ohne Schraubdeckel bis zum Anschlag in die Kammer. 5 Schließen Sie die Kammertür und wählen Sie Next (Weiter). Eingeben von Laufparametern 1 Geben Sie einen beliebigen Namen ein. 2 [Optional] Geben Sie eine beliebige Bibliotheks-ID ein. 3 Wählen Sie aus der Dropdown-Liste Recipe (Rezeptur) eine Rezeptur aus. Es werden nur kompatible Rezepturen aufgelistet. 4 Wählen Sie einen Read-Typ aus: Single Read oder Paired End. 32 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

37 5 Geben Sie die Anzahl der Zyklen für jeden Read des Sequenzierungslaufs an: } Read 1: Geben Sie einen Wert von bis zu 151 Zyklen ein. } Index 1: Geben Sie die Anzahl der Zyklen ein, die für Index 1 (i7) Primer erforderlich sind. } Index 2: Geben Sie die Anzahl der Zyklen ein, die für den Index 2 (i5) Primer erforderlich sind. } Read 2: Geben Sie einen Wert von bis zu 151 Zyklen ein. Dieser Wert ist in der Regel mit dem Wert von Read 1 identisch. Die Steuerungssoftware prüft die Anzahl der angegebenen Zyklen anhand folgender Kriterien: } Die Gesamtzahl der Zyklen überschreitet nicht die zulässige Maximalzahl der für den Lauf geladenen Reagenzienkartusche. } Read 1 umfasst mehr Zyklen als die fünf Zyklen der Matrizenbildung. } Die Anzahl der Index-Read-Zyklen ist nicht höher als die Anzahl der Read 1- und Read 2-Zyklen. HINWEIS Vergewissern Sie sich, dass Sie die korrekte Anzahl an Index-Read-Zyklen für die zu sequenzierenden Bibliotheken angeben. Weitere Informationen finden Sie in der Dokumentation zur Bibliotheksvorbereitung. 6 [Optional] Wenn Sie anwendungsspezifische Primer verwenden, aktivieren Sie das jeweilige Kontrollkästchen für die verwendeten Primer. } Read 1: Anwendungsspezifischer Primer für Read 1. } Index 1: Anwendungsspezifischer Primer für Index 1. } Index 2: Anwendungsspezifischer Primer für Index 2. } Read 2: Anwendungsspezifischer Primer für Read 2. 7 [Optional] Wählen Sie Advanced Settings (Erweiterte Einstellungen), um die Einstellungen für den aktuellen Lauf zu ändern. } Purge consumables for this run (Verbrauchsmaterialien für diesen Lauf entsorgen): Ändern Sie die Einstellung, um nach dem aktuellen Lauf Verbrauchsmaterialien automatisch zu entsorgen. } Use run monitoring for this run (Laufüberwachung für diesen Lauf verwenden): Ändern Sie diese Einstellung, um die Laufüberwachung in BaseSpace zu verwenden. Ist diese Option aktiviert, ist eine Internetverbindung und eine Anmeldung bei BaseSpace erforderlich. } Recipe (Rezeptur): Wählen Sie eine anwendungsspezifische Rezeptur für den Lauf aus. } Output folder (Ausgabeordner): Ändern Sie den Speicherort für den Ausgabeordner des aktuellen Laufs. Wählen Sie Browse (Durchsuchen) und navigieren Sie zum gewünschten Speicherort des Ordners. 8 Wählen Sie Next (Weiter). HINWEIS Öffnen Sie nicht die Tür der Reagenzienkammer oder der Fließzellenkammer, während der automatische Selbsttest oder der Sequenzierungslauf durchgeführt wird. Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs Überprüfen des automatischen Selbsttests 1 Prüfen Sie die Ergebnisse des automatischen Selbsttests. } Um einen Test während seiner Durchführung zu stoppen, wählen Sie Cancel (Abbrechen). MiniSeq Systemhandbuch 33

38 Sequenzierung } Bei allen Elementen, die den Test nicht bestehen, ist eine Aktion erforderlich, bevor Sie fortfahren können. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Fehler beim automatischen Selbsttest auf Seite 56. } Um den Test wieder zu starten, wählen Sie Retry (Wiederholen). Der Selbsttest wird beim ersten unvollständigen oder fehlgeschlagenen Test fortgesetzt. 2 Um den Lauf zu starten, wählen Sie eine der folgenden Optionen. } Wenn das System nicht für einen automatischen Start des Laufs nach erfolgreicher Durchführung des Selbsttests konfiguriert ist, wählen Sie Start (Starten). } Ist das System für den automatischen Start konfiguriert, wird der Sequenzierungslauf automatisch gestartet. Sie müssen nicht anwesend sein. Falls jedoch beim Selbsttest Fehler auftreten, wird der Lauf nicht automatisch gestartet. Konfigurieren eines Laufs (Konfiguration für BaseSpace oder Local Run Manager) 1 Wählen Sie im Startbildschirm die Option Sequence (Sequenzieren). Der Befehl Sequence (Sequenzieren) gibt die Verbrauchsmaterialien aus dem vorherigen Lauf frei und öffnet eine Reihe von Bildschirmen für die Laufkonfiguration. Anmelden bei BaseSpace oder Local Run Manager 1 Geben Sie Ihren Benutzernamen und Ihr Kennwort ein. 2 Wählen Sie Next (Weiter). Auswahl eines verfügbaren Laufs 1 Wählen Sie einen Laufnamen aus der Liste der verfügbaren Läufe aus. Verwenden Sie die Nach-oben- und Nach-unten-Pfeile, um durch die Liste zu blättern, oder geben Sie den Namen eines Laufs im Feld Search (Suchen) ein. 2 Wählen Sie Next (Weiter). Einsetzen der Fließzelle 1 Öffnen Sie die Tür der Fließzellenkammer. 2 Drücken Sie den Freigabeknopf rechts vom Fließzellenriegel. Abbildung 17 Geöffneter Fließzellenriegel 3 Entfernen Sie ggf. die gebrauchte Fließzelle aus dem vorherigen Lauf. 4 Stellen Sie sicher, dass der Fließzellentisch sauber ist. Wenn Schmutzpartikel vorhanden sind, reinigen Sie den Fließzellentisch mit einem Alkoholtupfer. 34 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

39 5 Platzieren Sie die Fließzelle über die Ausrichtungsstifte auf dem Fließzellentisch. Abbildung 18 Fließzelle auf Tisch platzieren 6 Schließen Sie den Fließzellenriegel, um die Fließzelle zu sichern. Abbildung 19 Geschlossener Fließzellenriegel 7 Schließen Sie die Tür der Fließzellenkammer. Einsetzen der Reagenzienkartusche 1 Öffnen Sie die Tür der Reagenzienkammer. 2 Entfernen Sie ggf. die gebrauchte Reagenzienkartusche. HINWEIS Um die sichere Entsorgung nicht verwendeter Reagenzien, die Formamid enthalten, zu erleichtern, lässt sich der Behälter in Position 9 herausnehmen. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 auf Seite Schieben Sie die Reagenzienkartusche bis zum Anschlag in die Reagenzienkammer. Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs Abbildung 20 Einsetzen der Reagenzienkartusche MiniSeq Systemhandbuch 35

40 Sequenzierung Leeren der Flasche für verbrauchte Reagenzien 1 Nehmen Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien aus der Kammer. Abbildung 21 Entfernen der Flasche für verbrauchte Reagenzien 2 Verschließen Sie die Flaschenöffnung mit dem Schraubdeckel, um zu verhindern, dass beim Transportieren der Flasche Flüssigkeit verschüttet wird. Abbildung 22 Verschließen der Flasche für verbrauchte Reagenzien 3 Entsorgen Sie den Inhalt der Flasche gemäß den geltenden Vorschriften. WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Tragen Sie eine entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel. Verbrauchte Reagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden Sicherheitsstandards Ihrer Region. Weitere umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html. 4 Schieben Sie die leere Flasche für verbrauchte Reagenzien ohne Schraubdeckel bis zum Anschlag in die Kammer. 5 Schließen Sie die Kammertür und wählen Sie Next (Weiter). 36 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

41 Prüfen der Laufparameter 1 Prüfen Sie die Laufparameter. Die Steuerungssoftware prüft die Anzahl der angegebenen Zyklen anhand folgender Kriterien: } Die Gesamtzahl der Zyklen überschreitet nicht die zulässige Maximalzahl der für den Lauf geladenen Reagenzienkartusche. } Read 1 umfasst mehr Zyklen als die fünf Zyklen der Matrizenbildung. } Die Anzahl der Index-Read-Zyklen ist nicht höher als die Anzahl der Read 1- und Read 2-Zyklen. HINWEIS Vergewissern Sie sich, dass Sie die korrekte Anzahl an Index-Read-Zyklen für die zu sequenzierenden Bibliotheken angeben. Weitere Informationen finden Sie in der Dokumentation zur Bibliotheksvorbereitung. 2 [Optional] Wählen Sie Edit (Bearbeiten), um die Laufparameter zu ändern. Wählen Sie Save (Speichern), wenn Sie fertig sind. } Purge consumables for this run (Verbrauchsmaterialien für diesen Lauf entsorgen): Ändern Sie die Einstellung, um nach dem aktuellen Lauf Verbrauchsmaterialien automatisch zu entsorgen. } Run parameters (Laufparamenter): Ändern Sie den Read-Typ oder die Anzahl der Zyklen pro Read. } Custom primers (Anwendungsspezifische Primer): Ändern Sie die Einstellungen für anwendungsspezifische Primer. 3 Wählen Sie Next (Weiter). HINWEIS Öffnen Sie nicht die Tür der Reagenzienkammer oder der Fließzellenkammer, während der automatische Selbsttest oder der Sequenzierungslauf durchgeführt wird. Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs Überprüfen des automatischen Selbsttests 1 Prüfen Sie die Ergebnisse des automatischen Selbsttests. } Um einen Test während seiner Durchführung zu stoppen, wählen Sie Cancel (Abbrechen). } Bei allen Elementen, die den Test nicht bestehen, ist eine Aktion erforderlich, bevor Sie fortfahren können. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Fehler beim automatischen Selbsttest auf Seite 56. } Um den Test wieder zu starten, wählen Sie Retry (Wiederholen). Der Selbsttest wird beim ersten unvollständigen oder fehlgeschlagenen Test fortgesetzt. 2 Um den Lauf zu starten, wählen Sie eine der folgenden Optionen. } Wenn das System nicht für einen automatischen Start des Laufs nach erfolgreicher Durchführung des Selbsttests konfiguriert ist, wählen Sie Start (Starten). } Ist das System für den automatischen Start konfiguriert, wird der Sequenzierungslauf automatisch gestartet. Sie müssen nicht anwesend sein. Falls jedoch beim Selbsttest Fehler auftreten, wird der Lauf nicht automatisch gestartet. MiniSeq Systemhandbuch 37

42 Sequenzierung Überwachen des Lauffortschritts 1 Überwachen Sie den Lauffortschritt, die Intensitäten und die Qualitäts-Scores, wenn die Kennzahlen am Bildschirm angezeigt werden. Abbildung 23 Fortschritt und Kennzahlen eines Sequenzierungslaufs A B C D E F G H Run progress (Lauffortschritt): Zeigt den aktuellen Schritt und die Anzahl der durchgeführten Zyklen für jeden Read-Vorgang an. Die Fortschrittsanzeige steht nicht im Verhältnis zur Laufgeschwindigkeit der einzelnen Schritte. Q-Score: Zeigt die Verteilung der Qualitäts-Scores (Q-Scores) an. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Qualitätsbewertung auf Seite 76. Intensity (Intensität): Zeigt den Wert der Clusterintensitäten von 90 % der Daten für jede Platte an. Die Basen werden durch Plot-Farben gekennzeichnet: A ist Rot, C ist Grün, G ist Blau und T ist Schwarz. Cluster Density (K/mm²) (Clusterdichte): Zeigt die Anzahl an Clustern, die für den Lauf erkannt wurden. Clusters Passing Filter (%) (Cluster nach Filterung): Zeigt den Prozentsatz der Cluster nach Filterung an. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Cluster nach Filterung auf Seite 76. Estimated Yield (Gb) (Geschätzte Menge): Zeigt die beabsichtigte Anzahl der Basen für den geplanten Lauf an. Data transfer status (Status der Datenübertragung): Zeigt basierend auf der Konfiguration der Analyse den Status der Datenübertragung an. Time to completion (Laufdauer): Zeigt Datum und Uhrzeit (JJJJ-MM-TT hh:mm) des Laufendes an. HINWEIS Nachdem Sie Home (Startseite) ausgewählt haben, können Sie nicht mehr zur Anzeige der Laufkennzahlen zurückkehren. Die Laufkennzahlen sind allerdings auf BaseSpace vorhanden und über einen Netzwerkcomputer, der den Sequenzierungsanalyse-Viewer verwendet, oder über einen Netzwerkcomputer, der Local Run Manager verwendet, zugänglich. 38 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

43 Zyklen für Laufkennzahlen Laufkennzahlen erscheinen zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Laufs. } Während der Schritte für die Clusterbildung werden keine Kennzahlen angezeigt. } Die ersten fünf Zyklen sind der Matrizenbildung vorbehalten. } In Zyklus 6 sind die Roh-Cluster-Dichte und die Intensitäten von Zyklus 1 verfügbar. } Nach Zyklus 25 sind Cluster nach Filterung, Menge und Qualitäts-Scores verfügbar. Sequenzierungsanalyse-Viewer Die Sequenzierungsanalyse-Viewer-Software zeigt die Sequenzierungskennzahlen, die während des Sequenzierungslaufs generiert werden. Die Kennzahlen werden in Form von Schaubildern, Diagrammen und Tabellen dargestellt und basieren auf den Daten, die von der Echtzeitanalyse generiert und in InterOp-Dateien geschrieben wurden. Die Kennzahlen werden während des Laufs aktualisiert. Wählen Sie zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Laufs Refresh (Aktualisieren), um aktualisierte Kennzahlen zu erhalten. Weitere Informationen finden Sie im Sequenzierungsanalyse-Viewer Benutzerhandbuch (Teile- Nr ). Der Sequenzierungsanalyse-Viewer ist eine Komponente der auf dem Gerätecomputer installierten Software. Zur Remote-Überwachung der Laufkennzahlen können Sie den Sequenzierungsanalyse-Viewer auch auf einem unabhängigen Computer mit Zugriff auf dasselbe Netzwerk installieren, mit dem das Gerät verbunden ist. Überwachen des Lauffortschritts Status der Datenübertragung Je nach ausgewählter Konfiguration für die Analyse erscheint während des Laufs ein Symbol, um den Verbindungsstatus anzugeben. Status Verbunden BaseSpace BaseSpace Onsite Local Run Manager Eigenständiges Gerät Datenübertragung Nicht verbunden Deaktiviert Gegebenenfalls werden mehrere Symbole auf dem Bildschirm angezeigt. Bei der Übertragung der Laufdaten an BaseSpace und an einen zusätzlichen Speicherort des Ausgabeordners sind z. B. das BaseSpace-Symbol und das Symbol für eigenständige Geräte auf dem Bildschirm zu sehen. MiniSeq Systemhandbuch 39

44 Sequenzierung Laufkopierdienst Die MiniSeq System Software Suite enthält einen Laufkopierdienst. Der Laufkopierdienst kopiert die von der Echzeitanalyse generierten Dateien in den angegebenen Ausgabeordner. Falls während des Laufs die Datenübertragung unterbrochen wird, werden die Daten vorübergehend auf dem Gerätecomputer gespeichert. Nach der Wiederherstellung der Verbindung während der Laufdurchführung wird die Datenübertragung automatisch fortgesetzt. Wenn die Verbindung nicht vor Abschluss des Laufs wiederhergestellt wird, übertragen Sie die Daten manuell an den bevorzugten Speicherort. Übertragung an BaseSpace Die Laufdaten werden mit BaseSpace Broker an BaseSpace übertragen. Falls die Verbindung zu BaseSpace unterbrochen wird, versucht der Broker sieben Tage lang, die Daten hochzuladen. Wenn nach sieben Tagen die Verbindung nicht wiederhergestellt werden konnte, werden die Laufdaten gelöscht. Wenn Sie einen zusätzlichen Speicherort für Laufdaten angeben, werden die Daten an diesen Speicherort gesendet, unabhängig vom Status von BaseSpace Broker. 40 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

45 Automatischer Nachwaschlauf Nach Abschluss des Sequenzierungslaufs wird ein automatischer Nachwaschlauf mit der Waschlösung und NaOCl in der Reagenzienkartusche initiiert. Der automatische Nachwaschlauf dauert etwa 90 Minuten. Nach Abschluss des Waschlaufs wird die Schaltfläche Home (Startseite) wieder aktiviert. Während des Waschlaufs bleiben die Sequenzierungsergebnisse auf dem Bildschirm eingeblendet. Nach dem Waschlauf Nach dem Waschlauf bleiben die Sipper in der unteren Position, wodurch verhindert wird, dass Luft in das System eindringt. Belassen Sie die Kartusche bis zum nächsten Lauf in ihrer Position. Automatischer Nachwaschlauf MiniSeq Systemhandbuch 41

46 Sequenzierung Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 Der Behälter in Position 9 der Reagenzienkartusche enthält Formamid. Bevor Sie die gebrauchte Reagenzienkartusche entsorgen, können Sie den Behälter in Position 9 herausnehmen und getrennt entsorgen. 1 Ziehen Sie Handschuhe an und drücken Sie den weißen abbrechbaren Bügel in Position 9 nach unten, um die drei Verbindungspunkte zu brechen. Abbildung 24 Abbrechbarer Bügel in Position 9 A B Abbrechbarer Bügel ist noch intakt Behälterklemme 2 Schieben Sie den abbrechbaren Bügel nach links in Richtung des Kartuschenrands, bis er unter die Kartuschenabdeckung gleitet. Abbildung 25 Abbrechbarer Bügel entfernt, Behälterklemme freigelegt A B Abbrechbarer Bügel befindet sich unter der Kartuschenabdeckung Behälterklemme 3 Drücken Sie die durchsichtige Kunststoffbehälterklemme nach unten und ziehen Sie sie nach rechts. Der Behälter löst sich aus der Position auf der Unterseite der Reagenzienkartusche. 4 Entsorgen Sie den Behälter gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften. 42 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

47 WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Tragen Sie eine entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel. Verbrauchte Reagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden Sicherheitsstandards Ihrer Region. Weitere umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html. Herausnehmen des gebrauchten Behälters in Position 9 MiniSeq Systemhandbuch 43

48 44 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

49 Kapitel 4 Wartung Wartung Einleitung 46 Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs 47 Software-Updates 51 Kapitel 4 MiniSeq Systemhandbuch 45

50 Wartung Einleitung Zu den Wartungsverfahren gehören manuelle Gerätewaschläufe und Systemsoftware- Updates (wenn verfügbar). Sonstige regelmäßige Wartungen sind nicht erforderlich. } Gerätewaschläufe: Die Geräte bleiben einsatzbereit, wenn Sie einen automatischen Nachwaschlauf nach jedem Sequenzierungslauf durchführen. Unter bestimmten Bedingungen ist jedoch ein manueller Gerätewaschlauf erforderlich. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs auf Seite 47. } Software-Updates: Wenn eine neue Version der System Software Suite verfügbar ist, können Sie das Update automatisch über eine Verbindung mit BaseSpace oder manuell nach dem Herunterladen des Installationsprogramms von der Illumina-Website durchführen. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Software-Updates auf Seite 51. Präventive Wartung Illumina empfiehlt, jährlich eine präventive Wartung durchführen zu lassen. Wenn Sie keinen Servicevertrag abgeschlossen haben, wenden Sie sich an den für Ihre Region zuständigen Kundenbetreuer oder an den technischen Support von Illumina, um einen kostenpflichtigen präventiven Wartungstermin zu vereinbaren. 46 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

51 Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs Zu den Optionen für den manuellen Waschlauf gehören der Schnellwaschlauf und der manuelle Nachwaschlauf. Waschlauftypen Schnellwaschlauf Dauer: 20 Minuten Manueller Nachwaschlauf Dauer: 90 Minuten Beschreibung Ein Schnellwaschlauf ist alle sieben Tage erforderlich, wenn sich das Gerät im Leerlauf befindet, oder nach einem Ausschalten des Geräts. Beim Waschlauf wird das System mit einer vom Benutzer bereitgestellten Waschlösung aus Wasser in Laborqualität und Tween 20 gespült. Ein manueller Nachwaschlauf ist erforderlich, wenn der automatische Nachwaschlauf nicht durchgeführt wurde. Dies ist z. B. der Fall, wenn ein Lauf vorzeitig beendet und die Fließzelle zwecks späterer Rehybridisierung gespeichert wurde. Beim Waschlauf wird das System mit einer vom Benutzer bereitgestellten Lösung aus 0,12 % Natriumhypochlorit und einer Waschlösung aus Wasser in Laborqualität und Tween 20 gespült. HINWEIS Verwenden Sie stets eine frische NaOCl-Lösung, die innerhalb der vorherigen 24 Stunden vorbereitet wurde. Wenn Sie mehr als 1 ml vorbereiten, bewahren Sie die verbleibende Lösung bei 2 C bis 8 C auf und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten 24 Stunden. Entsorgen Sie anderenfalls die restliche NaOCl-Lösung. Zum Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs werden die im Lieferumfang des Geräts enthaltene Waschlaufkartusche und Waschlauf-Fließzelle benötigt. Alternativ können Sie eine gebrauchte Fließzelle für den Waschlauf verwenden. Abbildung 26 Waschlaufkartusche Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs Vorbereiten eines manuellen Nachwaschlaufs 1 Mischen Sie die folgenden Volumina, um 0,12 % NaOCl zu erhalten. } 5 % NaOCl (31 µl) } Wasser in Laborqualität (1.269 µl) 2 Geben Sie 1,3 ml 0,12 % NaOCl in die Waschlaufkartusche. Der richtige Behälter entspricht Position 31 auf der vorgefüllten Reagenzienkartusche. MiniSeq Systemhandbuch 47

52 Wartung Abbildung 27 Positionen für NaOCl und die Waschlösung A B 0,12 % NaOCl Waschlösung 3 Mischen Sie folgende Volumina, um eine 0,05-%-Tween-20-Waschlösung zu erhalten. } 100 % Tween 20 (40 µl) } Wasser in Laborqualität (80 ml) 4 Geben Sie 80 ml Waschlösung in die Waschlaufkartusche. Der richtige Behälter entspricht Position 40 auf der vorgefüllten Reagenzienkartusche. 5 Wählen Sie im Startbildschirm Perform wash (Waschlauf durchführen) und anschließend Manual post-run wash (Manueller Nachwaschlauf). Vorbereiten eines Schnellwaschlaufs 1 Mischen Sie folgende Volumina, um eine 0,05-%-Tween-20-Waschlösung zu erhalten. } 100 % Tween 20 (20 µl) } Wasser in Laborqualität (40 ml) 2 Geben Sie 40 ml Waschlösung in die Waschlaufkartusche. Der richtige Behälter entspricht Position 40 auf der vorgefüllten Reagenzienkartusche. 48 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

53 Abbildung 28 A Waschlösung Position für Waschlösung 3 Wählen Sie im Startbildschirm Perform wash (Waschlauf durchführen) und anschließend Quick Wash (Schnellwaschlauf). Laden der Waschlauf-Fließzelle und der Waschlaufkartusche 1 Laden Sie die Waschlauf-Fließzelle. Schließen Sie the Fließzellenklemme und die Fließzellentür. HINWEIS Alternativ können Sie eine gebrauchte Fließzelle einsetzen. 2 Entfernen Sie ggf. die gebrauchte Reagenzienkartusche des vorherigen Laufs. 3 Laden Sie die vorbereitete Waschlaufkartusche. 4 Entfernen Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien und entsorgen Sie den Inhalt gemäß den geltenden Vorschriften. WARNUNG Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Tragen Sie eine entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel. Verbrauchte Reagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden Sicherheitsstandards Ihrer Region. Weitere umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html. 5 Schieben Sie die leere Flasche für verbrauchte Reagenzien bis zum Anschlag in die Kammer. 6 Schließen Sie die Tür der Reagenzienkammer. 7 Wählen Sie Next (Weiter). Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs MiniSeq Systemhandbuch 49

54 Wartung Starten des Waschlaufs 1 Wählen Sie nach Abschluss des Selbsttests die Option Start (Starten). 2 Wählen Sie nach Abschluss des Waschlaufs Home (Startseite). Nach dem Waschlauf Nach dem Waschlauf bleiben die Sipper in der unteren Position, wodurch verhindert wird, dass Luft in das System eindringt. Belassen Sie die Kartusche bis zum nächsten Lauf in ihrer Position. 50 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

55 Software-Updates Software-Updates sind in einem Software-Paket, der sogenannten System Suite gebündelt, die aus der folgenden Software besteht: } MiniSeq Control Software } MiniSeq-Rezepturen } RTA2 } Local Run Manager } MiniSeq Service Software } Sequenzierungsanalyse-Viewer } BaseSpace Broker Versionshinweise zur Software finden Sie auf der Supportseite für das MiniSeq-System auf der Illumina-Website. Sie können Software-Updates automatisch über eine Internetverbindung oder manuell von einem Netzwerk- oder USB-Standort aus installieren. } Automatische Updates: Wenn Geräte mit einem Netzwerk mit Internetzugang verbunden sind, wird bei Verfügbarkeit eines Software-Updates ein entsprechendes Symbol auf der Schaltfläche Manage Instrument (Gerät verwalten) im Startbildschirm angezeigt. } Manuelle Updates: Laden Sie das System Suite-Installationsprogramm von der MiniSeq-System-Supportseite auf der Illumina-Website herunter. HINWEIS Wenn Sie ein Update während des Installationsvorgangs abbrechen, wird der Installationsvorgang an der aktuellen Stelle gestoppt. Die bis zum Zeitpunkt des Abbruchs durchgeführten Änderungen werden nicht deinstalliert oder rückgängig gemacht. Software-Updates Automatisches Software-Update 1 Wählen Sie Manage Instrument (Gerät verwalten). 2 Wählen Sie Software Update (Software-Update). 3 Wählen Sie Install the update already downloaded from BaseSpace (Update installieren, das bereits von BaseSpace heruntergeladen wurde). 4 Wählen Sie Update (Aktualisieren), um den Aktualisierungsvorgang zu starten. Ein Dialogfeld zum Bestätigen des Befehls wird geöffnet. 5 Befolgen Sie die Eingabeaufforderungen des Installationsassistenten: a b Akzeptieren Sie die Lizenzvereinbarung. Lesen Sie die Liste der Software durch, die in diesem Update enthalten ist. Nach Abschluss des Software-Updates wird die Steuerungssoftware automatisch neu gestartet. HINWEIS Wenn ein Firmware-Update durchgeführt wird, ist nach der Aktualisierung der Firmware ein automatischer Neustart des Systems erforderlich. MiniSeq Systemhandbuch 51

56 Wartung Manuelles Software-Update 1 Laden Sie das Installationsprogramm für die System Suite von der Illumina-Website herunter und speichern Sie es an einem Netzwerkspeicherort. Alternativ können Sie die Softwareinstallationsdatei auf einem USB-Stick speichern. 2 Wählen Sie Manage Instrument (Gerät verwalten). 3 Wählen Sie Software Update (Software-Update). 4 Wählen Sie Manually install the update from the following location (Update manuell von folgendem Speicherort installieren). 5 Wählen Sie Browse (Durchsuchen), um zum Speicherort der Softwareinstallationsdatei zu navigieren, und wählen Sie anschließend Update (Aktualisieren). 6 Befolgen Sie die Eingabeaufforderungen des Installationsassistenten: a b Akzeptieren Sie die Lizenzvereinbarung. Lesen Sie die Liste der Software durch, die in diesem Update enthalten ist. Nach Abschluss des Software-Updates wird die Steuerungssoftware automatisch neu gestartet. HINWEIS Wenn ein Firmware-Update durchgeführt wird, ist nach der Aktualisierung der Firmware ein automatischer Neustart des Systems erforderlich. 52 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

57 Anhang A Fehlerbehebung Fehlerbehebung Dateien für die Fehlerbehebung 54 Fehler beim automatischen Selbsttest 56 RTA-Fehler 59 Workflow für die Rehybridisierung 60 Systemprüfung 63 Netzwerkkonfigurationseinstellungen 66 Anwendungsspezifische Genome 68 Ausschalten des Geräts 69 Kapitel A MiniSeq Systemhandbuch 53

58 Fehlerbehebung Dateien für die Fehlerbehebung Ein Mitarbeiter des technischen Supports von Illumina kann Kopien von lauf- oder scanspezifischen Dateien anfordern, um Fehler zu beheben. In der Regel werden die folgenden Dateien für die Fehlersuche verwendet. Schlüsseldatei Ordner Beschreibung Laufinformationsdatei (RunInfo.xml) Stammordner Enthält die folgenden Informationen: Laufname Anzahl der Zyklen im Lauf Anzahl der Zyklen in jedem Read Angabe, ob der Read indiziert ist Anzahl der Bildstreifen und Platten auf der Fließzelle Laufparameterdatei (RunParameters.xml) RTA- Konfigurationsdatei (RTAConfiguration.xml) Stammordner Data\Intensities Enthält Informationen zu den Laufparametern und Laufkomponenten. Hierzu gehören RFID, Seriennummer, Chargennummer und Ablaufdatum. Enthält die RTA-Konfigurationseinstellungen für den Lauf. Die Datei RTAConfiguration.xml wird am Anfang des Laufs generiert. InterOp-Dateien (*.bin) InterOp Binäre Berichtsdateien, die im Sequenzierungsanalyse-Viewer verwendet werden. InterOp-Dateien werden während des Laufs aktualisiert. Protokolldateien Logs Protokolldateien beschreiben jeden vom Gerät für jeden Zyklus durchgeführten Schritt und listen die Software- und Firmware-Versionen auf, die beim Lauf verwendet wurden. Die Datei mit dem Namen [Gerätename]_ CurrentHardware.csv listet die Seriennummern der Gerätekomponenten auf. Fehlerprotokolldateien (*ErrorLog*.txt) Globale Protokolldateien (*GlobalLog*.tsv) Lane-Protokolldateien (*LaneLog*.txt) RTA Logs RTA Logs RTA Logs In diesen Dateien werden RTA-Fehler protokolliert. Die Fehlerprotokolldateien werden aktualisiert, sobald ein Fehler festgestellt wird. In diesen Dateien werden alle RTA-Ereignisse protokolliert. Die globalen Protokolldateien werden während des Laufs aktualisiert. In diesen Dateien werden alle RTA- Verarbeitungsereignisse protokolliert. Die Lane-Protokolldateien werden während des Laufs aktualisiert. 54 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

59 Ressourcen für die Fehlerbehebung Prozess-Status Wenn Sie technische Fragen haben, besuchen Sie die MiniSeq-System-Supportseiten der Illumina-Website. Die Supportseiten bieten Zugriff auf Dokumentation, Downloads und häufig gestellte Fragen. Melden Sie sich bei Ihrem MyIllumina-Konto an, um Zugang zu den Support-Bulletins zu erhalten. Wenden Sie sich hinsichtlich Problemen mit der Laufqualität oder -leistung an den technischen Support von Illumina. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Technische Unterstützung auf Seite 85. Es wird empfohlen, einen Link zur Lauf-Zusammenfassung in BaseSpace für den technischen Support von Illumina freizugeben, um die Fehlerbehebung zu erleichtern. Die MiniSeq Control Software listet den Status von mindestens drei Läufen im Temp- Ordner des Systems auf. Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option Process status (Prozess-Status). Das System listet für jeden Laufnamen den Status der folgenden Komponenten auf: } Echtzeitanalyse (RTA): Basierend auf der Verarbeitung von BCL-Dateien } Local Run Manager: Wenn Local Run Manager für den Lauf verwendet wurde } File Copy (Dateien kopieren): Basierend auf der Dateiübertragung mit dem Laufkopierdienst } BaseSpace: Wenn BaseSpace für den Lauf verwendet wurde Dateien für die Fehlerbehebung Ordner Sequencing Archive (Sequenzierungsarchiv) Bei jedem Lauf auf dem Gerät speichert die MiniSeq Control Software Dateien zur Lauf- Zusammenfassung in folgendem Ordner auf dem Gerätecomputer: D:\Illumina\MiniSeq Sequencing Archive. In diesem Ordner wird bei jedem auf dem Gerät durchgeführten Lauf ein Unterordner mit den folgenden Dateien erstellt: } RunCompletionStatus.xml: Enthält den Status nach Abschluss des Laufs, den Laufordnernamen, die Anzahl der geplanten und durchgeführten Zyklen, die Clusterdichte, die Cluster nach Filterung und die geschätzte Menge für den Lauf. } RunParameters.xml: Enthält Informationen zu den Laufparametern und Laufkomponenten. Hierzu gehören RFID, Seriennummer, Chargennummer und Ablaufdatum. MiniSeq Systemhandbuch 55

60 Fehlerbehebung Fehler beim automatischen Selbsttest Falls beim automatischen Selbsttest ein Fehler festgestellt wird, führen Sie die folgenden Aktionen aus, um den Fehler zu beheben. Wenn ein Selbsttest fehlschlägt, wird die RFID der Reagenzienkartusche nicht gesperrt und kann für einen nachfolgenden Lauf verwendet werden. Die RFID wird jedoch gesperrt, sobald die Folienversiegelungen durchstochen wurden. Systemprüfungen Doors closed (Türen geschlossen) Empfohlene Aktion Stellen Sie sicher, dass die Kammertüren geschlossen sind. Consumables loaded (Verbrauchsmaterialien geladen) Required Software (Software erforderlich) Instrument Disk Space (Speicherplatz auf dem Gerät) Network Connection (Netzwerkverbindung) Network Disk Space (Netzwerkspeicherplatz) Die Verbrauchsmaterialsensoren funktionieren nicht. Stellen Sie sicher, dass alle Verbrauchsmaterialien ordnungsgemäß geladen sind. Wählen Sie in den Laufkonfigurationsbildschirmen die Option Back (Zurück), um zum Ladeschritt zurückzukehren, und wiederholen Sie die Laufkonfiguration. Wichtige Software-Komponenten fehlen. Führen Sie manuell ein Software-Update durch, damit alle Software-Komponenten installiert werden. Auf der Festplatte des Geräts ist nicht genügend Speicherplatz für die Durchführung eines Laufs verfügbar. Löschen Sie die Laufdaten von der Festplatte des Geräts. Die Verbindung zum angegebenen Speicherort des Ausgabeordners wurde getrennt. Der Test hat zwar die Bezeichnung Network Connection (Netzwerkverbindung), er prüft jedoch die Verbindung zu allen für den Ausgabeordner angegebenen Speicherorten: auf einem Server, einer externen Festplatte oder der lokalen Festplatte. Prüfen Sie den Status der Verbindung zum angegebenen Speicherort des Ausgabeordners. Auf dem angegebenen Speicherort des Ausgabeordners steht kein Speicherplatz mehr zur Verfügung. Der Test hat zwar die Bezeichnung Network Disk Space (Netzwerkspeicherplatz), er prüft jedoch alle für den Ausgabeordner angegebenen Speicherorte: auf einem Server, einer externen Festplatte oder der lokalen Festplatte. Machen Sie Speicherplatz am angegebenen Speicherort des Ausgabeordners frei. Temperatur Temperature ramp (Temperaturanstieg) Empfohlene Aktion Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. 56 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

61 Temperatur Temperature Sensors (Temperatursensoren) Fans (Lüfter) Bildgebungssystem Imaging Limits (Bildgebungsbeschränkungen) Z Step-and-Settle (z-tisch Schritt und Positionseinnahme) Bit Error Rate (Bit-Fehlerrate) Flow Cell Registration (Fließzellenregistrierung) Empfohlene Aktion Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Empfohlene Aktion Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Möglicherweise ist die Fließzelle nicht korrekt positioniert. Wählen Sie in den Laufkonfigurationsbildschirmen die Option Back (Zurück), um zum Fließzellenschritt zurückzukehren. Nehmen Sie die Fließzelle heraus und setzen Sie sie erneut ein, um sicherzustellen, dass sie korrekt positioniert ist. Fehler beim automatischen Selbsttest Reagenzienzugabe Valve Response (Ventilreaktionszeit) Pump (Pumpe) Empfohlene Aktion Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Speicherplatz auf der Festplatte Die Festplatte des Gerätecomputers bietet, basierend auf den Daten eines Laufs mit den folgenden Laufparametern, Speicherplatz für etwa 45 Läufe: } Ein Paired-End-Lauf mit 150 Zyklen benötigt etwa 5 bis 6 GB an Speicherplatz. } Bei Verwendung des Local Run Manager-Analysemoduls für die Resequenzierung sind zusätzlich 10 GB erforderlich. Bei jedem Lauf erstellt die Software einen temporären Laufordner. Die im temporären Laufordner gespeicherten Dateien werden in den Ausgabeordner kopiert. Wenn Sie für den Ausgabeordner einen Speicherort auf der Festplatte des Gerätecomputers festlegen, werden zwei Kopien des Laufs auf der Festplatte gespeichert. Die Software speichert die temporären Laufordner der letzten drei Läufe. Wenn Sie die Analyse mit Local Run Manager durchführen, werden die temporär gespeicherten Dateien nicht automatisch gelöscht. Sie müssen die Aufbewahrungsvorschriften im Bildschirm System Settings (Systemeinstellungen) von Local Run Manager manuell auswählen. MiniSeq Systemhandbuch 57

62 Fehlerbehebung Temporäre Dateien können den freien Speicherplatz der Festplatte füllen. Es wird empfohlen, einen Netzwerkspeicherort für die Laufdaten festzulegen und eine angemessene Aufbewahrungsvorschrift für Local Run Manager entsprechend der Anzahl der durchzuführenden Läufe auszuwählen. 58 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

63 RTA-Fehler Zum Beheben von Fehlern, die bei der Echtzeitanalyse aufgetreten sind, prüfen Sie zunächst das RTA-Fehlerprotokoll. Diese Datei wird im Ordner RTALogs gespeichert. Wenn der Lauf erfolgreich durchgeführt wurde, ist die Datei nicht vorhanden. Fügen Sie das Fehlerprotokoll bei, wenn Sie sich wegen Problemen an den technischen Support von Illumina wenden. RTA-Fehler Fehlerbehandlung RTA2 erstellt Protokolldateien und speichert sie im Ordner RTALogs. Fehler werden im *.tsv-format in einer Fehlerdatei aufgezeichnet. Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, werden die folgenden Protokoll- und Fehlerdateien an das endgültige Ausgabeziel übertragen. } *GlobalLog*.tsv enthält eine Zusammenfassung wichtiger Laufereignisse. } *LaneNLog*.tsv listet die Verarbeitungsereignisse auf. Auf einer MiniSeq-Fließzelle ist N immer 1. } *Error*.tsv protokolliert während des Laufs aufgetretene Fehler. } *WarningLog*.tsv führt während des Laufs aufgetretene Warnungen auf. MiniSeq Systemhandbuch 59

64 Fehlerbehebung Workflow für die Rehybridisierung Ein Rehybridisierungslauf ist ggf. erforderlich, wenn die Kennzahlen der ersten durchgeführten Zyklen Intensitäten unter 2500 zeigen. Einige Bibliotheken mit geringer Diversität können Intensitäten unter 1000 aufweisen, was normal ist und durch eine Rehybridisierung nicht geändert werden kann. HINWEIS Der Befehl zum Beenden eines Laufs ist endgültig. Der Lauf kann nicht wieder aufgenommen werden, die Verbrauchsmaterialien des Laufs können nicht wiederverwendet werden und die Sequenzierungsdaten des Laufs werden nicht gespeichert. Wenn Sie einen Lauf beenden und die Fließzelle speichern, führt die Software die folgenden Schritte durch, bevor der Lauf beendet wird: } Versetzt die Fließzelle in einen sicheren Zustand. } Entsperrt die Fließzellen-RFID für einen nachfolgenden Lauf. } Weist der Fließzelle ein Ablaufdatum für die Rehybridisierung zu. } Erstellt die Laufprotokolle für abgeschlossene Zyklen. Eine Verzögerung ist normal. } Übergeht den automatischen Nachwaschlauf. Wenn Sie einen Rehybridisierungslauf starten, führt die Software die folgenden Schritte durch, um den Lauf durchzuführen: } Erstellt einen Laufordner basierend auf einem eindeutigen Namen des Laufs. } Prüft, ob das Datum der Fließzellenrehybridisierung abgelaufen ist. } Füllt die Reagenzien vor. Eine Verzögerung ist normal. } Überspringt den Clustering-Schritt. } Entfernt den vorherigen Read 1-Primer. } Hybridisiert einen frischen Read 1-Primer. } Fährt bei Read 1 fort und führt den Lauf gemäß den angegebenen Laufparametern durch. Zeitpunkte für das Beenden eines Laufs für die Rehybridisierung Eine spätere Rehybridisierung ist nur beim Beenden eines Laufs zu den folgenden Zeitpunkten möglich: } Nach Zyklus 5: Intensitäten werden nach der Matrizenregistrierung angezeigt, sodass die ersten fünf Sequenzierungszyklen durchgeführt werden müssen. Auch wenn ein Lauf nach Zyklus 1 sicher beendet werden kann, wird das Beenden des Laufs nach Zyklus 5 empfohlen. Beenden Sie einen Lauf nicht während der Clusterbildung. } Read 1 oder Index 1 Read: Beenden Sie den Lauf, bevor die Paired-End-Resynthese beginnt. Die Fließzelle kann nicht für eine spätere Rehybridisierung gespeichert werden, wenn bereits die Paired-End-Resynthese gestartet wurde. Erforderliche Verbrauchsmaterialien Zum Durchführen eines Rehybridisierungslaufs ist eine neue MiniSeq-Reagenzienkartusche erforderlich, unabhängig davon, wann der Lauf angehalten wurde. 60 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

65 Beenden des aktuellen Laufs 1 Wählen Sie End Run (Lauf beenden). Wenn Sie zum Bestätigen des Befehls aufgefordert werden, wählen Sie Yes (Ja). 2 Wenn Sie zum Speichern der Fließzelle aufgefordert werden, wählen Sie Yes (Ja). Achten Sie auf das Ablaufdatum für die Rehybridisierung. 3 Entfernen Sie die gespeicherte Fließzelle und lagern Sie sie bei 2 C bis 8 C, bis Sie den Rehybridisierungslauf konfigurieren können. HINWEIS Sie können die Fließzelle bis zu sieben Tage bei 2 C bis 8 C im verschlossenen Fließzellenbehälter aufbewahren. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie die gespeicherte Fließzelle innerhalb von drei Tagen rehybridisieren. Durchführen eines manuellen Waschlaufs 1 Wählen Sie im Startbildschirm Perform Wash (Waschlauf durchführen). 2 Wählen Sie im Bildschirm Wash Selection (Waschlaufauswahl) Manual Post-Run Wash (Manueller Nachwaschlauf). Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Durchführen eines manuellen Gerätewaschlaufs auf Seite 47. HINWEIS Wenn Sie die Reagenzienkartusche aus dem angehaltenen Lauf noch nicht entfernt haben, können Sie sie für den manuellen Waschlauf verwenden. Führen Sie anderenfalls den manuellen Waschlauf mit der Waschlaufkartusche durch. Workflow für die Rehybridisierung Konfigurieren eines neuen Laufs auf der Registerkarte BaseSpace Prep (BaseSpace-Vorbereitung) 1 Wenn das Gerät für BaseSpace oder BaseSpace Onsite konfiguriert ist, richten Sie den neuen Lauf auf der Registerkarte BaseSpace Prep (BaseSpace-Vorbereitung) unter Verwendung derselben Parameter wie für den ursprünglichen Lauf ein. TIPP Klicken Sie auf die Registerkarte Pools und wählen Sie die entsprechende Pool-ID aus, um die Einstellungen des vorherigen Laufs zu übernehmen. Geben Sie anschließend dem neuen Lauf einen eindeutigen Namen. Konfigurieren eines Laufs auf dem Gerät 1 Bereiten Sie eine neue Reagenzienkartusche vor. 2 Wenn die gespeicherte Fließzelle aufbewahrt wurde, lassen Sie sie vor dem Gebrauch Raumtemperatur erreichen (15 30 Minuten). 3 Reinigen und laden Sie die gespeicherte Fließzelle. Das System liest die Fließzellen-RFID als gespeicherte Fließzelle und prüft, ob das Rehybridisierungsdatum gültig ist. 4 Entfernen Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien und entsorgen Sie den Inhalt ordnungsgemäß. Setzen Sie dann die leere Flasche wieder ein. 5 Setzen Sie die neue Reagenzienkartusche ein. MiniSeq Systemhandbuch 61

66 Fehlerbehebung 6 Wählen Sie im Laufkonfigurationsbildschirm eine der folgenden Konfigurationsoptionen aus: } BaseSpace, BaseSpace Onsite oder Local Run Manager: Wählen Sie den Lauf aus und prüfen Sie die Laufparameter. } Standalone (Eigenständig): Geben Sie den Namen des Laufs ein und legen Sie dieselben Parameter wie für den ursprünglichen Lauf fest. 7 Wählen Sie Next (Weiter), um mit dem Selbsttest fortzufahren und den Lauf zu starten. 62 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

67 Systemprüfung Eine Systemprüfung ist für den normalen Betrieb oder die Gerätewartung nicht erforderlich. Möglicherweise werden Sie von einem Mitarbeiter des technischen Supports von Illumina gebeten, eine Systemprüfung zwecks Fehlerbehebung durchzuführen. HINWEIS Falls ein Gerätewaschlauf fällig ist, führen Sie zuerst den Waschlauf durch, bevor Sie die Systemprüfung starten. Beim Starten der Systemprüfung werden die Steuerungssoftware automatisch beendet und die MiniSeq Service Software gestartet. Die Servicesoftware wird gestartet und der Bildschirm Load (Laden) wird geöffnet. Er enthält eine erweiterte Ladeoption. Systemprüfung Abbildung 29 Verfügbare Systemprüfungen Nach dem Laden der Verbrauchsmaterialien wird der Bildschirm Select (Auswählen) geöffnet. In diesem Bildschirm sind die verfügbaren Systemprüfungen aufgeführt. Inaktive Kontrollkästchen im Bildschirm Select (Auswählen) geben an, dass für die Durchführung der entsprechenden Tests die Unterstützung eines Illumina-Mitarbeiters benötigt wird. Durchführen einer Systemprüfung 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Check (Systemprüfung). Wenn Sie aufgefordert werden, die Steuerungssoftware zu schließen, wählen Sie Yes (Ja). 2 Geben Sie 40 ml deionisiertes Wasser in die Waschlaufkartusche. Der richtige Behälter entspricht Position 40 auf der vorgefüllten Reagenzienkartusche. MiniSeq Systemhandbuch 63

68 Fehlerbehebung Abbildung 30 Position für Waschlösung A Waschlösung 3 Laden Sie die Verbrauchsmaterialien wie folgt: a b c Wenn sich noch keine gebrauchte Fließzelle im Gerät befindet, setzen Sie eine gebrauchte Fließzelle ein. Leeren Sie die Flasche für verbrauchte Reagenzien und setzen Sie sie wieder in das Gerät ein. Setzen Sie die Waschlaufkartusche ein. 4 Wählen Sie Load (Laden). Die Fließzelle und die Waschlaufkartusche werden in Position gebracht. 5 Wählen Sie Next (Weiter). Die Systemprüfung wird gestartet. 6 [Optional] Wählen Sie nach Abschluss der Systemprüfung View (Anzeigen) neben dem entsprechenden Namen, um die jedem Test zugeordneten Werte anzuzeigen. 7 Wählen Sie Next (Weiter). Der Systemprüfungsbericht wird geöffnet. 8 Wählen Sie Save (Speichern), um den Bericht in einer verzippten Datei zu speichern. Wählen Sie einen Netzwerkspeicherort für die Datei aus. 9 Wählen Sie Exit (Beenden), wenn Sie fertig sind. 10 Wenn Sie aufgefordert werden, die Servicesoftware zu schließen und die Steuerungssoftware neu zu starten, wählen Sie Yes (Ja). Die Steuerungssoftware wird automatisch neu gestartet. 64 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

69 Bewegungsprüfungen Systemprüfung FCLM & FAM Stage Tests (Tisch- Prüfungen) Beschreibung Prüft den Ertrag und den Abstand des Fließzellenlademechanismus (Flow Cell Load Mechanism, FCLM) und des Fluidikautomatisierungsmoduls (Fluidics Automation Module, FAM), um sicherzustellen, dass die Module ordnungsgemäß funktionieren. Prüft die Bewegungsgrenzen und die Leistung des xy- und des z-tisches. Systemprüfung Optik-Prüfung Systemprüfung Flow Cell Registration (Fließzellenregistrierung) Beschreibung Misst die Fließzellen-Neigung auf einer optische Ebene, testet die Funktionalität von Kamera und Bildmodul und prüft, ob die Fließzelle in der korrekten Bildgebungsposition registriert ist. Fluidikprüfung Systemprüfung Valve Response (Ventilreaktionszeit) Pressure Decay (Druckdämpfung) Flow Rate (Fließrate) Beschreibung Prüft die Genauigkeit der Ventil- und Pumpenbewegungen und testet den Bewegungsbereich der Pumpenspritze. Prüft die Leckrate eines versiegelten Fluidiksystems, um nachzuweisen, dass die Fließzelle ordnungsgemäß in der Sequenzierungsposition eingesetzt ist. Prüft die Funktion der Blasensensoren, die zum Ermitteln von Luft in den Reagenzienleitungen verwendet werden. Misst die Fließraten, um Verschlüsse oder Lecks auszuschließen. Thermische Prüfungen Systemprüfung Fans (Lüfter) Thermal Probes (Wärmefühler) Beschreibung Prüft die Geschwindigkeit der Systemlüfter in Pulse pro Minute (PPM), um sicherzustellen, dass die Lüfter funktionieren. Lüfter, die nicht funktionieren, geben einen negativen Wert zurück. Prüfen die durchschnittliche Temperatur jedes Wärmesensors. Wärmesensoren, die nicht funktionieren, geben einen negativen Wert zurück. MiniSeq Systemhandbuch 65

70 Fehlerbehebung Netzwerkkonfigurationseinstellungen Netzwerkeinstellungen werden während der Installation konfiguriert. Falls eine Neukonfiguration des Systems erforderlich ist, können Sie die Einstellungen im Bildschirm Network Configuration (Netzwerkkonfiguration) ändern oder zurücksetzen. Die Konfigurationseinstellungen umfassen die IP-Adresse, die Adresse des DNS-Servers und den Domänennamen. Festlegen der Netzwerkkonfiguration 1 Wählen Sie im Bildschirm Manage Instrument (Gerät verwalten) die Option System Configuration (Systemkonfiguration). 2 Wählen Sie Network Configuration (Netzwerkkonfiguration). 3 Wählen Sie die Option Obtain an IP address automatically (IP-Adresse automatisch abrufen), um die IP-Adresse über den DHCP-Server abzurufen. HINWEIS DHCP (Dynamic Host Configuration Protocol) ist ein in IP-Netzwerken für die dynamische Verteilung von Netzwerkkonfigurationsparametern verwendetes Standardnetzwerkprotokoll. Alternativ können Sie die Option Use the following IP address (Folgende IP-Adresse verwenden) wählen, um das Gerät manuell mit einem anderen Server zu verbinden. Führen Sie hierzu die folgenden Schritte aus. Wenden Sie sich an den Netzwerkadministrator Ihres Unternehmens, um die spezifischen Adressen Ihrer Einrichtung zu erhalten. } Geben Sie die IP-Adresse ein. Die IP-Adresse ist eine Reihe von vier Zahlen, die jeweils durch einen Punkt getrennt sind, z. B } Geben Sie die Subnetzmaske ein, die eine Untergruppe des IP-Netzes ist. } Geben Sie das Standard-Gateway ein, bei dem es sich um den Router im Netzwerk handelt, der die Verbindung mit dem Internet herstellt. 4 Wählen Sie Obtain a DNS server address automatically (DNS-Server-Adresse automatisch beziehen), um das Gerät mit dem DNS-Server zu verbinden, dem diese IP-Adresse zugeordnet ist. Alternativ können Sie die Option Use the following DNS server addresses (Folgende DNS-Server-Adressen verwenden) wählen, um das Gerät manuell mit dem DNS-Server zu verbinden. Führen Sie hierzu die folgenden Schritte aus. } Geben Sie die bevorzugte DNS-Adresse ein. Die DNS-Adresse ist der Name des Servers, der zum Übersetzen von Domänennamen in IP-Adressen verwendet wird. } Geben Sie die alternative DNS-Adresse ein. Die alternative Adresse wird verwendet, wenn der bevorzugte DNS-Server einen bestimmten Domänennamen nicht in eine IP-Adresse übersetzen kann. 5 Wählen Sie Save (Speichern). 66 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

71 Konfigurieren der Computerdomäne HINWEIS Der Name des Gerätecomputers wird bei der Herstellung des Computers vergeben. Falls der Computername geändert wird, kann dies die Konnektivität beeinträchtigen. Zudem kann der Name möglicherweise nur durch einen Netzwerkadministrator geändert werden. 1 Gehen Sie folgendermaßen vor, um den Gerätecomputer mit einer Domäne oder Arbeitsgruppe zu verbinden: } Bei Geräten, die mit dem Internet verbunden sind: Aktivieren Sie die Option Member of domain (Mitglied der Domäne) und geben Sie den Namen der Domäne ein, die der Internetverbindung Ihrer Einrichtung zugewiesen ist. HINWEIS Für Domänenänderungen sind der Benutzername und das Kennwort eines Administrators erforderlich. } Bei Geräten, die keinen Internetzugang haben: Wählen Sie Member of work group (Mitglied der Arbeitsgruppe) und geben Sie den Namen einer Arbeitsgruppe an. Der Name der Arbeitsgruppe ist unternehmensspezifisch. 2 Wählen Sie Save (Speichern). Netzwerkkonfigurationseinstellungen MiniSeq Systemhandbuch 67

72 Fehlerbehebung Anwendungsspezifische Genome Sie können Ihre eigene Referenz im FASTA-Format auf den Gerätecomputer hochladen. Sie können mehrere FASTA-Dateien einzeln oder eine einzige Multi-FASTA-Datei (empfohlen) hochladen. Die Kombination beider Methoden ist jedoch nicht möglich. Prüfen Sie, ob folgende Anforderungen erfüllt werden, um Fehler zu beheben, die bei Verwendung einer anwendungsspezifischen Genomdatei auftreten: 1 Stellen Sie sicher, dass die Datei die Dateierweiterung *.fa oder *.fasta hat und im dafür vorgesehenen Ordner für Referenzen gespeichert wurde. 2 Vergewissern Sie sich, dass der Name des Chromosoms nicht eines der folgenden Zeichen enthält: # -? ( ) [ ] / \ = + < > : ; " ', * ^ & Verwenden Sie für Chromosomennamen nur alphanumerische Zeichen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. 68 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

73 Ausschalten des Geräts Unter normalen Bedingungen gibt es keinen Grund, das Gerät auszuschalten. 1 Wählen Sie Manage Instrument (Gerät verwalten). 2 Wählen Sie Shutdown options (Ausschaltoptionen). 3 Wählen Sie Shut down (Ausschalten). Mit diesem Befehl wird die Software sicher heruntergefahren und das Gerät ausgeschaltet. Warten Sie mindestens 60 Sekunden, bevor Sie das Gerät erneut einschalten. Vor dem nächsten Sequenzierungslauf ist die Durchführung eines Waschlaufs erforderlich. VORSICHT Bewegen Sie das Gerät nicht an einen anderen Standort. Ein unsachgemäßes Bewegen des Geräts kann zur Beeinträchtigung der Ausrichtung der optischen Elemente und der Datenintegrität führen. Falls Sie den Standort des Geräts ändern müssen, wenden Sie sich an Ihren Illumina-Vertreter. Ausschalten des Geräts MiniSeq Systemhandbuch 69

74 70 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

75 Anhang B Echtzeitanalyse Echtzeitanalyse Überblick über die Echtzeitanalyse 72 Eingabe- und Ausgabedateien 73 Echtzeitanalyse-Workflow 74 Anhang B MiniSeq Systemhandbuch 71

76 Echtzeitanalyse Überblick über die Echtzeitanalyse Die Echtzeitanalyse ist eine auf dem Computer des Geräts ausgeführte Software. Sie extrahiert für das Base-Calling Intensitäten aus Bildern und weist dann dem Base-Call einen Qualitäts-Score zu. Das MiniSeq-System verwendet eine Implementierung der Echtzeitanalyse namens RTA2. Die Systemsteuerungssoftware und RTA2 kommunizieren über ein HTTP-Webinterface und gemeinsame Speicherbereiche. Wenn RTA2 beendet wird, wird die Verarbeitung nicht wieder aufgenommen und die Laufdaten werden nicht gespeichert. 72 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

77 Eingabe- und Ausgabedateien Eingabedateien Ausgabedateien Die Echtzeitanalyse-Software benötigt für die Verarbeitung Folgendes: } Die im lokalen Speicher des Systems gespeicherten Plattenbilder. } RunInfo.xml, die zu Beginn des Laufs automatisch generiert wird und den Laufnamen, die Anzahl der Zyklen, die Angabe, ob ein Read indiziert ist, sowie die Anzahl der Platten auf der Fließzelle enthält. Die Echtzeitanalyse-Software erhält von der Steuerungssoftware Befehle bezüglich des Speicherorts von RunInfo.xml und ob ein optionaler Ausgabeordner angegeben wird. Bilder von jedem Kanal werden gespeichert und im Hauptspeicher als Platten übergeben. Platten sind kleine Bildgebungsbereiche auf der Fließzelle, die von der Kamera als das Bildfeld betrachtet werden. Die Software generiert von diesen Bildern die Primäranalyse- Ausgabe, die mehrere hinsichtlich ihrer Qualität ausgewertete Base-Call-Dateien und Filter- Dateien umfasst. Ausgabedateien werden für die nachgeschaltete Analyse mit Analysemodulen von Local Run Manager bzw. auf BaseSpace verwendet. Eingabe- und Ausgabedateien Dateityp Base-Call-Dateien Filterdateien Clusterpositionsdateien Base-Call-Indexdateien Beschreibung Jede analysierte Platte wird in eine zusammengefasste Base-Call-Datei (*.bcl) für jede Lane und für jeden Zyklus aufgenommen. Die zusammengefasste Base-Call-Datei enthält den Base-Call und den zugeordneten Qualitäts-Score für jeden Cluster in dieser Lane. Jede Platte liefert Filterinformationen, die pro Lane in einer Filterdatei (*.filter) zusammengefasst werden. Die Filterdatei gibt an, ob ein Cluster die Filter passiert hat. Clusterpositionsdateien (*.locs) enthalten die X- und Y-Koordinaten aller Cluster einer Platte. Während der Matrizenbildung wird eine Clusterpositionsdatei für jede Lane generiert. Eine Base-Call-Indexdatei (*.bci) wird für jede Lane erzeugt, um die ursprünglichen Platteninformationen beizubehalten. Die Indexdatei enthält ein Wertepaar für jede Platte: die Plattennummer und die Anzahl der Cluster für die Platte. RTA2 liefert Echtzeitkennzahlen zur Laufqualität, die in InterOp-Dateien gespeichert werden. InterOp-Dateien sind binäre Ausgabedateien mit Kennzahlen zu Platten, Zyklen und zur Read-Ebene. Sie werden benötigt, um Echtzeitkennzahlen in der Sequenzierungsanalyse-Viewer-Software ansehen zu können. MiniSeq Systemhandbuch 73

78 Echtzeitanalyse Echtzeitanalyse-Workflow Matrizenbildung Registrierung und Intensitätsextraktion Korrektur der Phasierung Base-Calling Definiert die Clusterpositionen. Zeichnet die Position der einzelnen Cluster auf der Fließzelle auf und ermittelt einen Intensitätswert für jeden Cluster. Korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und Vorphasierung. Legt für jeden Cluster einen Base-Call fest. Qualitätsbewertung Weist jedem Base-Call einen Qualitäts-Score zu. Matrizenbildung Der erste Schritt im RTA-Workflow ist die Matrizenbildung. Hierbei werden die einzelnen Clusterpositionen in einer Platte anhand von X- und Y-Koordinaten definiert. Für die Matrizenbildung werden die Bilddaten der ersten fünf Zyklen des Laufs benötigt. Nachdem der letzte Matrizenzyklus für die Platte aufgenommen wurde, wird die Matrize generiert. HINWEIS Damit bei der Matrizenbildung Cluster erkannt werden, muss mindestens eine andere Base als G in den ersten fünf Zyklen vorhanden sein. Die Matrize dient im nachfolgenden Schritt Registrierung und Intensitätsextraktion als Referenz. Die Clusterpositionen für die gesamte Fließzelle werden in Clusterpositionsdateien (*.locs) gespeichert. Für jede Lane wird eine Datei erstellt. Registrierung und Intensitätsextraktion Die Registrierung und Intensitätsextraktion beginnen nach der Matrizenbildung. } Bei der Registrierung werden Bilder, die bei jedem weiteren Zyklus der Bildgebung erzeugt werden, an der Matrize ausgerichtet. } Die Intensitätsextraktion ermittelt für ein bestimmtes Bild einen Intensitätswert für jeden Cluster in der Matrize. Wenn die Registrierung für ein Bild in einem Zyklus fehlschlägt, werden keine Intensitäten extrahiert und die Base-Calls aller Basen für diese Platte in diesem Zyklus lauten N. Prüfen Sie mithilfe der Sequenzierungsanalyse-Viewer-Software, ob die Registrierung von Platten und Zyklen fehlgeschlagen ist. Registrierungsfehler lassen sich leicht erkennen, da die entsprechenden Platten und Zyklen den Wert 0 in der Spalte P90 der Registerkarte Imaging (Bildgebung) haben. Korrektur der Phasierung Während der Sequenzierungsreaktion erweitert sich jeder DNA-Strang in einem Cluster um eine Base pro Zyklus. Die Phasierung und Vorphasierung finden statt, wenn eine Phasenverschiebung eines Strangs mit dem aktuellen Inkorporationszyklus eintritt. } Eine Phasierung tritt ein, wenn eine Base zurückfällt. } Eine Vorphasierung tritt ein, wenn eine Base vorauseilt. 74 Material-Nr Dokument-Nr v00 DEU

79 Abbildung 31 A B Base-Calling Phasierung und Vorphasierung Read mit einer phasierenden Base Read mit einer vorphasierenden Base RTA2 korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und der Vorphasierung, sodass bei jedem Zyklus des Laufs eine maximale Datenqualität erzielt wird. Beim Base-Calling wird eine Base (A, C, G oder T) für jeden Cluster einer bestimmten Platte eines bestimmten Zyklus festgelegt. Das MiniSeq-System verwendet die Zweikanal- Sequenzierung, bei der nur zwei Bilder benötigt werden, um die Daten für vier DNA- Basen zu kodieren: eines vom roten Kanal und eines vom grünen Kanal. Die von einem Bild extrahierten Intensitäten gegenüber einem anderen Bild ergeben vier verschiedene Populationen, die jeweils einem Nukleotid entsprechen. Der Base-Calling- Prozess bestimmt die Population, zu der jeder Cluster gehört. Echtzeitanalyse-Workflow Abbildung 32 Darstellung der Clusterintensitäten Tabelle 1 Base Base-Calls bei einer Zweikanal-Sequenzierung Roter Kanal Grüner Kanal Ergebnis A 1 (ein) 1 (ein) Cluster, die Intensitäten sowohl im roten als auch im grünen Kanal aufweisen. C 1 (ein) 0 (aus) Cluster, die Intensitäten nur im roten Kanal aufweisen. G 0 (aus) 0 (aus) Cluster, die keine Intensitäten bei einer bekannten Position aufweisen. T 0 (aus) 1 (ein) Cluster, die Intensitäten nur im grünen Kanal aufweisen. MiniSeq Systemhandbuch 75