6. Woche. Glastechnik Glastechnische Arbeiten dürfen nur unter ständiger Überwachung des Praktikumsleiters durchgeführt werden.
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- Eva Ritter
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1 6. Woche Glastechnik Glastechnische Arbeiten dürfen nur unter ständiger Überwachung des Praktikumsleiters durchgeführt werden. Schneiden des Glasrohres Das Schneiden des Glasrohres geschieht mit Glasschneidemesser (od. mit Ampullenfeile). Ein Strich mit dem Glasschneidemesser wird um das Umfang des Glasrohres gemacht (ca. ein achtel des Umfanges soll eingeschnitten werden) so, dass das Werkzeug an das Rohr gedrückt wird und das Rohr von uns gedreht wird. Halten wir das Rohr jetzt mit unseren beiden Händen so, dass beide Daumen an der Gegenseite des Schnittes anlehnen, und gleichzeitig ziehen wir das Rohr stark auseinander. Das Rohr bricht wo eingeschnitten wurde, splitterfrei. Die scharfen Kanten können wir abschmelzen. Anfertigung von Kapillaren Zur Anfertigung von Kapillaren schneidet man einige 6-8 cm lange Rohrstücke (Durchmesser 6-8 mm) aus Weichglas (=Glassorte mit niedrigem Erweichungspunkt). Das Rohr lässt sich auf der Stichflamme eines Bunsenbrenners erweichen. Das Rohrstück wird mit beiden Händen nahe zu den Rohrenden gehalten. Die Mitte des Rohres wird beim ständigen Rühren solange erhitzt bis es weich wird und die Flamme gelb gefärbt wird. Das Rohr wird jetzt aus der Flamme genommen und kräftig auseinander gezogen (ca cm) und in dieser Position gehalten, bis das Glas sich erhärtet (dauert einige Sekunden). Die Kapillare wird nun in 5-7 cm langen Stücken geschnitten und in einem Reagenzglas aufbewahrt. 1
2 CHROMATOGRAPHISCHE ANALYSENVERFAHREN Die Chromatographie ist ein Verfahren zur Trennung von Stoffgemischen oder zur Gewinnung hochreiner Stoffe. Die zu trennenden Substanzen werden über 2 Phasen verteilt. Eine dieser Phasen ist unbeweglich und hat eine große Oberfläche, die andere Phase ist beweglich und bewegt sich durch die andere hindurch. Die unbewegliche Phase kann ein Feststoff (auch Adsorbent genannt), oder eine Flüssigkeit sein. In diesem Fall wird die Flüssigkeit als dünner Film auf einem porösen, kleinkörnigen Feststoff ausgebreitet. Die bewegliche Phase kann eine mit der unbeweglichen Phase nicht mischbare Flüssigkeit, oder ein nichtlösliches Gas sein. Die Komponente des zu trennenden Gemisches binden sich gemäß einem physikalisch-chemischen Mechanismus in unterschiedlichem Maße an die stationäre Phase, und die Probenbestandteile wandern entlang der stationären Phase. Diese Bewegung wird von der mobilen Phase gesichert. Die Chromatographie wurde 1903 von dem russischen Biologen Tswett entdeckt, als er eine Lösung grüner Pflanzenfarbstoffe durch eine mit Kalk gefüllte Säule laufen ließ. Die Farbstoffe passierten die Säule unterschiedlich schnell und trennten sich auseinander. Die Trennung beruht hier auf der unterschiedlich starken Adsorptionsbindung zwischen den einzelnen Farbstoffen (Adsorptiv) und dem Kalk (Adsorbent). Die Methode hat sich allerdings erst in den zwanziger-dreißiger Jahren verbreitet als Ergebnis der Arbeiten von Kuhn, Lederer und Zechmeister. (Zechmeister war der Institutsleiter unseres Institutes von 1924 bis 1940.) Heute ist die Chromatographie eine weit verbreitete Analysenmethode geworden, die in allen Gebieten der chemischen, biochemischen und biologischen Analytik angewendet wird. Einteilung der chromatographischen Verfahren: Nach Aggregatzustand der stationären und mobilen Phase Nach der Technik der Ausführung Nach dem Mechanismus der Trennung Als stationäre Phase kann ein Festkörper mit großer aktiver Oberfläche verwendet werden, dann spricht man bei Verwendung von Gasen als mobile Phase von Gas-Adsorptionschromatographie (gas-solid chromatography GSC) oder, mit flüssiger mobiler Phase, von Flüssig-Adsorptionschromatographie (liquid-solid 2
3 chromatography LSC) Verwendet man eine Flüssigkeit als stationäre Phase, die von einem inerten Träger mit großem Porenvolumen aufgesaugt ist, dann unterteilt man in Gas-Verteilungschromatographie (gas-liquid chromatography GLC) und Flüssig- Verteilungschromatographie (liquid-liquid chromatography LLC). Nach der Methode der Ausführung unterscheidet man zwischen dreidimensionalen oder Säulenchromatographie und zweidimensionalen Schicht- und Papier- Chromatographie. Für die Entwicklung der Chromatogramme verwendet man bei der Trennung fast ausschließlich die sog. Elutionsverfahren. (Hier wird die Probe in den kontinuierlich strömenden Eluenten gegeben.) Die sich stark an die stationäre Phase bindende Substanz bewegt sich kaum oder langsam, während die sich schwach bindende Substanz sich schneller bewegt (Abb. 1). Abbildung 1. Prinzip der Elution Chromatographische Trennmechanismen: Adsorptionsvorgänge Verteilungsvorgänge Austauschvorgänge Ausschlußeffekte Biospezifische Effekte 3
4 Adsorptionschromatographie In der Adsorptionschromatographie spielen die heterogene Gleichgewichte (gas-fest, flüssig-fest) eine Rolle, die infolge der verschiedenen Absorptionskräften, die zwischen der stationären Phase und den Komponenten des zu trennenden Gemisches auftreten, entstanden sind. (Die mobile Phase darf nur schwach adsorbiert werden, da sonst die adsorbierenden aktiven Stellen blockieren würden.) Die Stärke der Absorption hängt von der Molekülstruktur, von der Zahl und Charakter der Funktionsgruppen der zu trennenden Moleküle, von dem Polaritätsverhältnis zwischen Adsorbent und mobiler Phase ab. Das Adsorptionsgleichgewicht kann in weitem Umfang durch die Wahl der stationären oder mobilen Phase beeinflusst werden. Adsorptionschromatographie kann man sowohl in Säulen als auch in Schichten ausführen. Verteilungschromatographie Verteilungschromatographie basiert auf der abweichenden Löslichkeit der einzelnen zu trennenden Stoffe in den sich miteinander nicht mischenden Flüssigkeiten. Man bindet die als stationäre Phase dienende Flüssigkeit als einen Flüssigkeitsfilm an die Oberfläche eines festen Stoffes (Träger). Der Träger kann z.b. Kieselgel (Silicagel), Aluminiumoxid, Zellulose, künstliches Polymer, (z.b. Polystyrol) sein. Der mit der stationären Phase beladener Träger hält diese auch dann fest, wenn eine damit nicht mischbare Lösung (oder Gas) daran vorbeigeführt wird (mobile Phase). Gewöhnlich ist die stationäre Phase polar, und die mobile Phase weniger polar, aber immer öfter kommt die gegengesetzte Phasenfolge vor: die stationäre Phase ist hydrophob, (kann sogar ein Kohlenwasserstoff sein) und die mobile Phase ist eine polare, hydrophile Flüssigkeit. Diese Phasenordnung nennen wir Chromatographie mit umgekehrter Phase (Reversed Phase Chromatography RPC). 4
5 Ionenaustauschchromatographie Bei der Ionenaustausch-Chromatographie stellt sich ein Austauschgleichgewicht zwischen den Ionen in der Lösung und den sog. Gegenionen ein, die an eine feste stationäre Phase nur elektrostatisch gebunden und deshalb austauschbar sind. Die stationäre Phase ist meistens ein Kunstharz mit entsprechenden funktionellen Gruppen (Kunstharzaustauscher). Prinzipiell unterscheidet man zwischen Kationen-Austauschern und Anionen-Austauschern. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen wird meist durch den ph-wert des Eluenten bestimmt. Die Kationaustauscher enthalten säurige Oberflächen-Gruppen (Sulfonsäure: - SO 3 H, Carboxyl: -COOH, Phenol-OH usw.), die Anionaustauscher basische Oberflächen-Gruppen (Aliphatische oder Aromatische Amine, Hidroxylamine, quaterne Ammoniumgruppen) (Abb. 2). Abbildung 2 Prinzip des Anionenaustausches 5
6 Ausschlusschromatographie Diese, vor allem in der Biochemie und Naturstoffchemie angewandte, chromatographische Methode nutzt die Größenunterschiede der zu trennenden Moleküle zur Trennung aus. Bei der Elution erscheinen die einzelnen Komponenten nacheinander in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße, d.h. die größten Moleküle (mit der höchsten Molmasse) werden zuerst eluiert. Erklärt wird dieser Vorgang durch das sog. Ausschlusskonzept. Danach enthält das Gel Poren definierter Größe. Die größeren Moleküle können nicht in das Innere der stationären Phase eindringen und werden daher vom Lösungsmittel (mobile Phase) rascher fortgeführt als kleine, diffusionsfähige Moleküle. Somit erscheinen alle Moleküle, deren Molekülgröße (und damit ihre Molmasse auch) außerhalb der Ausschlussgrenze liegt, praktisch gleichzeitig im Eluat. Mittelgroße Moleküle dringen demgegenüber unterschiedlich (je nach Molekülgröße) in das Gel ein. Sie können dadurch voneinander getrennt werden. Ihnen steht für diese Diffusion ein Teil des Volumens der Gelporen zur Verfügung. Kleine Moleküle durchdringen die gesamte Gelmatrix und werden ungetrennt am spätesten eluiert. Muss man nur sehr große Moleküle von sehr kleinen trennen, spricht man oft von Gelfiltration. Überschreitet das zu trennende Gemisch einen großen Fraktionsbereich (Molmassenbereich), nennt man es diesen Prozess Ausschluss-chromatographie (Gelchromatographie) (Abb. 3). Als stationäre Phasen werden soft-gele und hard-gele verwendet. Softgele müssen vor Gebrauch erst in Wasser gequellt werden, um die entsprechende Porenstruktur zu erreichen. Hardgele haben eine von der mobilen Phase unbeeinflussbare Porenstruktur. Die verwendeten so genannten Molekülfilter sind perlförmige, im Wasser unlösliche Polymere (Dextran, Agarose, Polyakrylamid, Polystyrol, usw.). Der Fraktionierungsbereich bedeutet die untere und obere Grenze der Molekülgröße, die mit dem Gel getrennt werden kann. Die ausschließende Molekülgröße (Ausschlussgrenze) bedeutet die Molekülgröße, die nicht mehr ins Gel eindringen kann. 6
7 Abbildung 3. Prinzip der Ausschlusschromatographie Spezielle Mechanismen Über Affinitätschromatographie sprechen wir, wenn die stationäre Phase aktive Stellen enthält, die spezifisch für eine gewisse Verbindungsgruppe besonders hohe Affinität zeigen. Ein Beispiel ist die Komplexbildung zwischen einem Enzym und seinem Substrat. Chromatographische Trennsysteme werden als chiral bezeichnet, wenn sie Moleküle mit asymmetrischen Kohlenstoffatomen besitzen. Mit Hilfe von chiralen Trennsystemen können Enantiomere von biologisch aktiven Substanzen getrennt werden. Die Chromatographie als analytische Methode Wenn Chromatographie als analytische Methode angewendet wird, taucht die Frage auf, ob die Methode für qualitative oder für quantitative Analyse geeignet ist? Die Antwort ist: für beide. Die qualitative Auswertung der Chromatogramme erfolgt so, dass die getrennten Substanzen durch bestimmte Kenngrößen charakterisiert 7
8 werden. Diese sind für eine große Anzahl von Verbindungen bekannt und können daher in vielen Fällen zur Identifizierung verwendet werden. Im Allgemeinen beziehen sich die Kenndaten darauf, wie lange eine Substanz braucht, bis sie vom Eingangspunkt (Einlaß, Start) zum Endpunkt (Ausgang) gelangt, d.h. wie stark sie zurückgehalten wird (Retention) (Abb.4). Als Retentionszeit bezeichnet man in der Gas- und Säulenchromatographie die Zeit, die vom Start bis zum Auftreten des Substanzmaximums am Ausgang vergangen ist. Die quantitative Bestimmung basiert darauf, dass die Größe des am Chromatogramm ersichtlichen Signals im (möglichst linearen) Verhältnis zu der Menge des betroffenen Stoffes steht. Für die quantitative Auswertung der Chromatogramme werden meist die Flächen der Banden (auch Signalen, Peaks genannt) integriert und miteinander verglichen. Auch ein Schichtchromatogramm kann quantitativ ausgewertet werden, wenn mit Hilfe von optischem Densitometer die Schicht abgetastet, und ein Chromatogramm aufgezeichnet wird. Da bekommen wir ein Chromatogramm, ähnlich wie bei der Säulenchromatographie. Abbildung 4 Das Chromatogramm 8
9 Papierchromatographie Träger der stationären Phase ist reine Cellulose, ein spezielles Filterpapier (sog. Chromatographie-Papier). Die eigentliche stationäre Phase ist Wasser. Die Cellulosenfaser ist entweder schon mit Wasser benetzt oder man lässt das wasserhaltige, organische Laufmittel durchsickern, so dass ein Teil des Wassers vom Papier adsorbiert werden kann und mit ihm zusammen die stationäre Phase bildet. Als mobile Phase (Fließmittel) verwendet man z.b. wasserhaltiges n-butanol, Ethylacetat usw. Arbeitsphasen der Papierchromatographie: Auftragen der Probe: Die zu trennende Probe wird mit Hilfe von Kapillar- Mikropipette, Mikrospritze oder einfach mit einer Glaskapillare als möglichst kleiner Substanzfleck auf den Papierstreifen aufgetragen und trocknen gelassen (Startpunkt). Die Größe des Fleckes soll nicht über 0.5 cm sein. Die untere Grenze der Probenmenge wird durch die Empfindlichkeit der Entwicklungsmethode angegeben. Trennung: Das Papier wird in eine mit der benötigten Menge Laufmittel gefüllte Trennkammer gehängt oder gestellt. a.) Aufsteigende Chromatographie (Abb. 5): Die Lösungsmittelfront läuft nach oben. Da die Schwerkraft den Kapillarkräften entgegenwirkt, nimmt die Sauggeschwindigkeit allmählich ab, die Laufstrecke ist begrenzt (20-30 cm). Der Startpunkt liegt cm von dem unteren Ende des Streifens. Abbildung 5. Aufsteigende Papierchromatographie 9
10 b.) Absteigende Chromatographie Hier wird das Papier über den Rand einer Wanne herangehängt und nur mit seinem oberen Ende in die mobile Phase eingetaucht. Die Trennung erfolgt schneller, da Kapillarkräfte und Schwerkraft gemeinsam wirken. c.) Zirkular-Chromatographie Da läuft die mobile Phase von der Mitte eines Rundfilters aus kontinuierlich nach außen. Das Laufmittel wird mit Hilfe eines Papierdochtes von unten angesaugt (Abb. 6.). Abbildung 6. Zirkular-Chromatographie Bei keinen Verfahren darf das Lösungsmittel während der Durchführung der Trennung verdunsten. Man verwendet deshalb geschlossene Apparaturen (meist Glaskammer), deren Atmosphäre mit den Dämpfen des verwendeten Lösungsmittelgemisches gesättigt ist. Nachweis der einzelnen Substanzen ( Entwicklung ) Zum Nachweis der einzelnen Substanzflecken werden diese, sofern sie keine Eigenfarbe haben, mit einem Sprühreagenz besprüht, die zusammen mit den Substanzflecken Farbeffekte gibt ( Entwicklung ). 10
11 Aminosäuren und Proteine sind z.b. mit Ninhydrin, reduzierende Zucker mit Ammoniak-Silber-Nitrat, Phenols mit Eisen(III)Chlorid, Karbonsäuren mit Säure-Base Indikatoren, usw. hervorzurufen. Das Reagenz bringt man mit einem Zerstäuber auf Abb. 7). Abbildung 7. Zerstäuber Oft hilft es auch, das Chromatogramm im UV-Licht zu betrachten, falls die Substanzen entsprechend absorbieren (z.b.steriode) (Abb. 8). Abbildung 8. Nachweis mit UV-Lampe 11
12 Die Komponente eines Substanzgemisches werden durch ihre Wanderungsgeschwindigkeit charakterisiert. In der Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie gibt man meist die sog. R F -Werte an (retention factor). Entfernung des Substanzflecks (Mitte) vom Start R F = Entfernung der Lösungsmittelfront vom Start R F ist eine Zahl zwischen 0 und 1. R F ist für ein Stoff charakteristisch, aber nur bei konstanten Verhältnissen: gleiches Papier, gleiches Lösungsmittel-System, konstante Temperatur, gleiche Laufzeit, usw.). Zur Sicherheit lässt man meist bei einem Chromatogramm eine bekannte Vergleichsubstanz (Referenzsubstanz) mitlaufen, um Veränderungen der R F -Werte kontrollieren zu können. Versuch 1 Untersuchung von Faserschreiber-Farben mittels Zirkular-Chromatographie Durchführung: Vom Fließmittel (Gemisch Toluol-Methanol 10:1, oder 50:1) gieße man ca. 10 cm 3 in den Unterteil einer Petri-Schale, und decke man sie mit dem Oberteil ab. Markiere und durchlöche man den Mittelpunkt des Chromatographie-Papiers (Marke: Whatman No 1). Zeichne man mit Bleistift (Grafit!) mit Hilfe eines 2 Forint Geldstückes einen Kreis um die Mitte des Papiers. Mit Faserschreibern verschiedener Farben ziehe man 8-10 mm lange Bögen entlang des Kreises (3-4 Bögen). Die Bögen sollen einander nicht berühren! Stecke man einen ungefähr 1,5 cm langen Filterpapierdocht in das Loch, wodurch das Lösungsmittel aufgesaugt werden kann. Dann lege man das Filterpapier in die Petrischale so, dass das Docht 2-4 mm ins Lösungsmittel hineinhängt, und decke man sie mit dem Oberteil ab. Das Chromatogramm entwickelt sich in Minuten. Die Front darf den Rand der Petrischale nicht erreichen. Die Trennleistung des Systems kann gut veranschaulicht werden, wenn auf einem Feld alle Farben, die auch separat aufgebracht wurden, aufeinander gezeichnet werden. 12
13 Versuch 2 Trennung von Metallionen mit Papierchromatographie Die Papierchromatographie eignet sich nicht nur für die Trennung von organischen Verbindungen, sondern man kann sie auch in der anorganischen Analytik anwenden. Zum Beispiel für die Trennung von Cu 2+, Co 2+, Ni 2+, Fe 3+ Ionen. Durchführung: Gießen man den Laufmittel (9:1 Gemisch von Aceton und 20% Salzsäure) in den Unterteil einer Petri-Schale, und decke man den mit dem Oberteil sorgfältig ab. Die Proben der einzelnen Ionen liegen in Lösungen vor. Die Proben werden mittels einer Kapillare in den Mittelpunkt des Chromatographie-Papiers aufeinander aufgetragen. Dazu muss die Kapillare mit der Lösung ruhig und senkrecht auf das Chromatographie-Papier aufgesetzt werden, die Lösung darf nicht auf das Papier aufgetropft werden. Nach dem Trocknen des Flecks stecke man den Docht durch den Mittelpunkt des Papiers. Entwickelt wird das Chromatogramm auf ähnlicher Weise, wie im Versuch 1. Nach Trocknen wird das Chromatogramm mit 0.5% Rubeanwasserstoffsäure-Lösung besprüht. Die Methode ist empfindlicher, wenn das Papier nach Besprühen kurz mit Ammoniak-Dampf behandelt wird. Reihenfolge der Ionen vom Mittelpunkt Richtung Rand des Papiers ist: Ni 2+, Co 2+, Cu 2+, Fe 3+. Bemerkung: Rubeanwasserstoffsäure ergibt mit vielen Metallionen farbige Komplexe. Die Beurteilung wird erleichtert, wenn vor der Entwicklung in die 4 Ecken des Papiers 1-1 Tropfen Probe-Lösung aufgebracht wird. Die Farben der Referenzflecken können leicht mit den Farben der Bänder des Chromatogramms verglichen werden. 13
Polyacrylamid-Gelelektrophorese Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit qeladener Teilchen im elektrischen Feld.
Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrund ihrer Ladung und ihrer Grösse aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteine nur
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