1 Lipide: Serumlipide

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1 1 Lipide: Serumlipide Lerninhalt: Allgemeine Eigenschaften von Membranlipiden und Speicherlipiden, Arten von Lipiden: Triglyceride, Glycerinphosphatide, Sphingolipide, Cholesterin, ß-Oxidation, Ketonkörper, Fettsäuresynthese, Hydrophobizität als Grundlage von Trennungsgängen, Dünnschichtchromatographie, Löslichkeitsprofil Hintergrund: Unter der Bezeichnung Lipide fasst man eine Gruppe hydrophober Verbindungen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften zusammen. Lipide haben im Körper zahlreiche Aufgaben. Beispiele sind Speicherlipide, Membranlipide, lipophile Hormone und second messenger. Einteilung der Lipide: Triglyceride oder Triacylglyceride sind als Energiespeicher in grossen Mengen vor allem im Fettgewebe vorhanden. In Triglyceriden sind an alle drei OH-Gruppen des dreiwertigen Alkohols Glycerin Fettsäuren verestert. Vielfältigere Strukturen finden sich bei den Membranlipiden. Glycerinphosphatide oder Phosphoglyceride sehen ähnlich aus wie Triglyceride, jedoch sind nur zwei der OH- Gruppen mit Fettsäuren verestert. Die dritte Gruppe ist phosphoryliert. In dieser Form handelt es sich um die Verbindung Phosphatidsäure. In der Regel ist der Phosphatrest jedoch mit einer stickstoffhaltigen Verbindung (Cholin, Ethanolamin, Serin) oder dem Zucker Inosit kovalent verbunden. Dies ergibt die wichtigen Membranlipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylinositol. Da unterschiedliche Fettsäuren an den beiden anderen OH-Gruppen hängen können, gibt es jeweils eine ganze Reihe von Varianten für diese Verbindungen. Die hydrophile Gruppe, die in der Membran nach aussen orientiert ist, bleibt aber gleich. 1

2 Glycerinphosphatide werden auch als Phospholipide bezeichnet, aber diese Bezeichnung ist problematisch. Zwar enthalten alle Glycerinphosphatide tatsächlich Phosphor, aber es gibt ein wichtiges Membranlipid das zwar auch Phosphor enthält, jedoch nicht auf Glycerinbasis beruht. Man findet es in der Gruppe der Sphingolipide. Statt Glycerin wird hier der langkettige Aminodialkohol Sphingosin als Grundgerüst verwendet. Die lange hydrophobe Kette des Sphingosins übernimmt praktisch die Rolle einer Fettsäure; die Aminogruppe des Spingosins bindet eine Fettsäure in einer Säureamidbindung und die beiden OH-Gruppen sind noch frei. Die gesamte Struktur ist sehr ähnlich zu der von Glycerinphosphatiden, obwohl der chemische Aufbau völlig anders ist. Sphingolipid mit zwei freien OH-Gruppen nennt man Ceramid. Die endständige OH- Gruppe wird in der Regel verestert. Wenn Phosphorylcholin gebunden wird entsteht Sphingomyelin, wenn Kohlenhydrate gebunden werden entstehen Glykosphingolipide. Ein wichtiger Vertreter der Glycosphingolipide ist Cerebrosid, bei dem Galactose gebunden ist. Wenn komplexe Oligosaccaride gebunden werden, entstehen Ganglioside. Steroide sind hauptsächlich als Hormone bekannt (Sexualhomone, Cortisol etc.). Das Grundgerüst der Steroide ist Cholesterin, das aber auch eine wichtige Komponente der eukaryontischen Cytoplasmamembran, und als Auslöser zur Bildung arteriosklerotischer Plaques gesundheitlich bedenklich ist. 2

3 Isoprenlipide sind allgemein Lipide, die formal aus der C5-Verbindung Isopren abgeleitet werden können. Es handelt sich hier um eine rein formale Charakteriserung, da Isopren im Körper nicht vorkommt, wenn sie nicht gerade ein Stück Kunststoff verschluckt haben. Zu den Isoprenlipiden gehören die Steroide, aber auch die fettlöslichen Hormone Vitamin A (Retinol), D 3 (Cholecalciferol), E (Tocopherol) und K (Phyllochinone). Stoffwechsel der Fettsäuren: Wenn das Fettsäureangebot in der Leber grösser ist als der Bedarf, können zwei Wege eingeschlagen werden: Entweder werden die Fettsäuren aktiviert und zur Biosynthese von Lipiden verwendet, oder sie werden im Prozeß der ß- Oxidation in den Mitochondrien abgebaut. Das dabei entstehende AcetylCoA wird entweder über den Citratcyklus oxidiert oder über HMG-CoA in Ketonkörper umgewandelt. Im Gegensatz zum Abbau findet die Synthese der Fettsäuren im Cytoplasma statt, und zwar an der von Feodor Lynen entdeckten Fettsäuresynthetase, einem grossen Multienzymkomplex der alle entscheidenden Syntheseschritte katalysiert. Die unterschiedliche Kompartimentierung von Synthese und Abbau erlaubt eine effiziente Regulation des Fettsäurestoffwechsels. Im Lipidstoffwechsel nehmen AcetylCoA und AcylCoA eine zentrale Stellung ein. AcetylCoA (= AcCoA) ist aktivierte Essigsäure (2 C-Atome), AcylCoA ist aktivierte Fettsäure (mindestens 3 C-Atome, meist aber deutlich mehr). Die Aktivierung von Essigsäure oder Fettsäure erfordert jeweils CoA, ATP und eine Thiokinase. Zunächst bindet ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat an die Carboxylgruppe der Säure, dann reagiert das so gebildete Acyladenylat mit CoA unter Freisetzung von AMP zu AcylCoA. Es gibt eine Reihe von Thiokinasen mit unterschiedlicher Substratspezifität. AcetylCoA wird nach dem gleichen Schema gebildet. 3

4 Aktivierung von Fettsäuren durch die Thiokinase Im Versuch wird die spezifische Aktivität von Acetyl-CoA-Synthetase bestimmt, die für die Bildung von AcCoA (aktivierter Essigsäure) verantwortlich ist. In einem zweiten Ansatz werden die im Blutserum enthaltenen Lipide durch Dünnschicht- Chromatographie dargestellt. Aufgabenstellung der Versuche: A: Bestimmung der spezifischen Aktivität von Thiokinase. Die Aktivität von AcetylCoA Synthetase (Synonym: Thiokinase, aus Hefe) wird verfolgt, wobei CoA und Acetat als Substrate zur Verfügung gestellt werden. AcCoA reagiert im Ansatz weiter mit Hydroxylamin zu Acetylhydroxamat, das in Form seines Fe 3+ -Komplexes photometrisch nachgewiesen wird. 4

5 B: Nachweis der Serumlipide. Serum wird mit Chloroform im siedenden Wasserbad unter dem Abzug extrahiert und filtriert. Das Filtrat wird mit Wasser versetzt, die entstehende Emulsion zentrifugiert und die Chloroformfraktion zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und auf DC-Folien aufgetragen. Standardlipide als Referenz werden auf gleicher Höhe aufgetragen. Die Proben werden in geeignetem Laufmittel in Chromatographietanks aufgetrennt und dann getrocknet. Lipide werden durch eine Molybdän-Lösung entwickelt und die Platten werden nochmal getrocknet. Die R f -Werte der Lipide werden berechnet. Durchführung: A: Bestimmung der spezifischen Aktivität von Thiokinase Die folgenden Bestandteile (in µl) werden in der angegebenen Reihenfolge zusammen pipettiert. Ansatz # dest. Wasser M Kaliumacetat mm Coenzym A M ATP M Tris/HCl, ph M NH 2 OH HCl M MgCl mg/ml AcetylCoA-Synthetase Die Proben werden mit einem Vortex gemischt und 30 min im Wasserbad bei 37 C inkubiert. 5

6 Zum Nachweis von gebildetem AcCoA werden zunächst 100 µl einer Lösung aus 2 M FeCl 3 in 4 M HCl zugegeben. Damit das Volumen zur Messung in ½-Mikroküvetten ausreicht, wird nun noch jeweils 380 µl Wasser zugegeben. Mit der 1 ml Pipette werden die Proben nun in Küvetten überführt. Zur Bestimmung der Extinktion wird das Photometer bei 560 nm zunächst mit Ansatz 1 auf Null abgeglichen. Anschließend wird die Extinktion der anderen Proben gemessen. Ansatz # Extinktion 0 Der Extinktionskoeffizient ε 560 für den gebildeten Fe 3+ -Hydroxamat-Komplex ist 1850 (l mol -1 cm -1 ). Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes wird nun die spezifische Aktivität der Thiokinase berechnet. Ergebnis: Ansatz # E 560 [AcCoA] [mol] AcetylCoA- Synthetase [mg] spezifische Aktivität [U/mg] 6

7 B: Nachweis der Serumlipide Extraktion der Lipide aus dem Serum: Dieser Arbeitsschritt wid vom Tutor durchgeführt, da gefahrloses Erhitzen von Chloroform schon etwas Übung verlangt. In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden 8 ml Chloroform, 8 ml Methanol und anschliessend tropfenweise ca. 1 ml Serum gegeben. In einem siedenden Wasserbad wird der Kolben erhitzt bis der Inhalt kräftig aufsiedet, dann wird unter der Wasserleitung gekühlt und nochmals 8 ml Chloroform zugegeben. Die Mischung wird kräftig geschüttelt und filtriert. Der Rückstand besteht hauptsächlich aus Protein. Das Filtrat wird in zwei Zentrifugengläser gefüllt, mit jeweils 2.5 ml dest. Wasser versetzt und kräftig geschüttelt, um Methanol und einige kleinmolekulare Serumkomponenten wie z.b. Harnstoff zu entfernen. Es entsteht eine Emulsion die durch 5 min Zentrifugation wieder in zwei Phasen getrennt wird. Die untere Schicht enthält die Lipide gelöst in Choroform. Diese Schicht wird mit einer Pipette entnommen und zur Trockne eingeengt (Wasserbad C, laufender Abzug). Der Rückstand wird in 500 µl Chloroform gelöst und die Lösung zum Auftragen verwendet. Auftrag und Trennung: Zunächst werden auf der Dünnschichtfolie Startlinie und Auftragspunkte mit Bleistift markiert. Dazu wird im Abstand von 2 cm und 3 cm (gemessen vom unteren Ende der Platte) eine waagrechte Linie gezogen, die durch 8 kurze Striche in etwa gleiche Strecken unterteilt und beschriftet wird. Mit einer Pipette werden je 1 bzw. 2 µl Serumlipidlösung bzw. Vergleichslösungen auf die Kreuzungspunkte der Striche auf der Startlinie aufgetragen. Dabei sollte man sich zur späteren Identifizierung an der unten stehenden Abbildung orientieren. 7

8 Serum: 1 µl Serum: 2 µl freie Fettsäuren ( = Ölsäure): 2 µl Triglyceride ( = Neutralfett): 1 µl Cholesterin: 1 µl Cholesterylester ( = -palmitat): 1 µl Phosphatide ( = Lecithin): 2 µl Mix unbek. Zusammensetzung: 2 µl Nach dem Auftragen der Proben werden die Folien in die Trennkammer gestellt. Als Laufmittel wird ein Gemisch aus Hexan/Essigsäureethylester/Essigsäure im Volumen- Verhältnis 59/10/1 verwendet. Die Trennzeit beträgt etwa 25 min. Beim Herausnehmen der DC-Platte aus der Trennkammer wird die Laufmittelfrontlinie sofort mit einem weichen Bleistift markiert und die Platte für ca.1 min bei RT unter dem Abzug getrocknet. Entwicklung: Die getrockneten Platten werden so gleichmäßig wie möglich bis mindestens zur Frontlinie mit einer Lösung aus 2% Molybdatophosphorsäure in Ethanol bespritzt (unter dem Abzug!!!). Nach kurzer Trockenzeit werden sie bei ca. 200 C für 5 min im Trockenschrank erhitzt. Dabei wird ein Teil das Mo(VI) durch organische Stoffe zu Mo(IV) reduziert, das mit dem verbleibenden Mo(VI) blaugraue Mischoxide bildet. Die Flecken werden nach dem Sichtbarwerden mit einem weichen Bleistift markiert. Die Nachweisgrenze für Lipide liegt mit diesem Verfahren bei ng. Auswertung: Die R f -Werte der Einzelsubstanzen werden nun berechnet: Entfernung Startpunkt Fleckenmitte R f = Entfernung Startpunkt Lösungsmittelfront 8

9 Ergebnis: Lipid freie Triacyl- Cholesterin Cholesterin- Glycerin- Fettsäuren glyceride ester phosphatide R f -Wert Serumkomponenten Mix-Komponenten Durch Vergleich mit den R f -Werten der bekannten Lipide lassen sich nun die Komponenten der zu bestimmenden Probe identifizieren und in obenstehende Tabelle einfügen. Geräte: Pipetten, Photometer (560 nm), ½ Mikroküvetten, Zentrifuge, Wasserbad, Trockenschrank, 50 ml Erlenmeyerkolben, Schliffkolben, Bechergläser, Faltenfilter, Kieselgelplatten 20 x 20 cm, Chromatographietrog Benötigte Lösungen: A: Acetyl-CoA-Synthetase aus Hefe (5 mg Lyophilisat = 1,11 mg Protein mit 5,9 U/mg), 1,92 mg Lyophilisat/ml Tris-HCl, ph 7.0 Reagenz erst unmittelbar vor Gebrauch herstellen! 0.1 mol/l ATP-Kaliumsalz in 0.1 mol/l Kaliumphosphat, ph mm Coenzym A-Lösung in Tris HCl, ph mol/kaliumacetat 0.1 mol/l Tris-HCl, ph mol/l NH 2 OH HCl, mit 6 mol/koh auf ph 7.1 bringen. Reagenz erst unmittelbar vor Gebrauch herstellen! 0.1 mol/l MgCl 2 6 H 2 O 2 mol/l FeCl 3 in 4 mol/l HCl 9

10 B: Serum Chloroform, Methanol 0.2%ige Lösungen von Ölsäure (freie Fettsäuren), Neutralfett (Triglyceride), Cholesterin, Cholesterylpalmitat (-ester), Lecithin (Phosphatide) in Chloroform Laufmittel: Hexan/Essigsäureethylester/Essigsäure im Volumenverhältnis 59/10/1 Färbereagenz: 2% Molybdatophosphorsäure in Ethanol 10