Tierärztliche Hochschule Hannover

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf quantitative und qualitative Spermaparameter des Rüden unter besonderer Berücksichtigung der Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms sowie des Spermienchromatins INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Christine Masal Fürth Hannover 2010

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für Kleintiere 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinen Eltern Jeder dumme Junge kann einen Käfer zertreten. Aber alle Professoren der Welt können keinen herstellen. Arthur Schopenhauer

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 13 2 Literaturübersicht Anatomie von Hoden und Nebenhoden Spermienmorphologie Spermatogenese und Spermienreifung Nebenhodenpassage Physiologische Wärmeregulation des Hodens Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf die Ejakulatqualität Bewertung der Spermaqualität Konventionelle Spermaanalyse Durchflusszytometrie Integrität von Plasma- und Akrosommembran Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA TM ) Motilitätsparameter aus computergestützten Analysen 33 3 Material und Methoden Versuchstiere Versuchsaufbau Lokale Wärmeapplikation am Hoden Andrologische Untersuchung und Samengewinnung Biologische Samenuntersuchung Spermienkonzentration und Spermiengesamtzahl Subjektiv geschätzte Motilität Membranintegrität der Spermien Spermienmorphologie Computergestützte Motilitätsanalyse (CASA) Cell Motion Analyser (CMA ) 40

6 3.6.2 SpermVision Durchflusszytometrische Spermaanalyse FITC-PNA / PI-Färbung Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA ) Statistische Auswertung 47 4 Ergebnisse Skrotale Oberflächentemperatur Einfluss skrotaler Hyperthermie auf konventionelle Spermaparameter Ejakulatvolumen Spermiengesamtzahl Spermienmotilität Membranintegrität der Spermien Morphologie der Spermien Einfluss skrotaler Hyperthermie auf computergestützte Motilitätsparameter Cell Motion Analyser (CMA ) SpermVision Einfluss skrotaler Hyperthermie auf durchflusszytometrisch erfasste Spermaparameter Plasmamembran- und Akrosomstatus Chromatinstatus 69 5 Diskussion Skrotale Oberflächentemperatur Einfluss skrotaler Hyperthermie auf konventionelle Spermaparameter Ejakulatvolumen Spermiengesamtzahl Membranintegrität der Spermien Morphologie der Spermien 77

7 5.3 Einfluss skrotaler Hyperthermie auf Spermienmotilität Einfluss skrotaler Hyperthermie auf Membranintegrität und Spermienchromatin Plasmamembran und Akrosomstatus Chromatinstatus Schlussfolgerungen 82 6 Zusammenfassung 83 7 Summary 85 8 Verzeichnisse Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis 90 9 Anhang Technische Ausstattung und Einstellungen des CMA (Cell Motion Analyser) Technische Ausstattung und Einstellungen des SpermVision Messpositionen für Rüdenspermien, SpermVision Settings SpermVision Bezugsquellen für Geräte und Verbrauchsmaterial Bezugsquellen und Materialien zur skrotalen Wärmeapplikation Chemikalien Rezepturen Einzeldaten SpermVision Einzeldaten der konventionellen Ejakulatbeurteilung 135

8 Abkürzungsverzeichnis A. Arteria Abb. Abbildung Abw. Abweichung ALH amplitude of lateral head displacement AO Akridinorange AOC average orientation change B Bos BCF beat cross frequency A. bidest Aqua bidestillata bzw. beziehungsweise C Grad Celsius ca. circa CASA computerassistierte Spermaanalyse CMA Cell Motion Analyser d day (Tag) DAP distance average path DCL distance curvilinear dest. destillata DFI DNA-Fragmentationsindex d.h. das heißt DNA deoxyribonucleic acid DSL distance straight-line et al. et alii Fa. Firma FITC Fluorescein-Isothiocyanat FSH Follikelstimulierendes Hormon kg Kilogramm h hour (Stunde) HBS HEPES-gepufferte Lösung Hz Hertz

9 incl. inklusive LIN linearity M. musculus max. Maximum min. Minimum µl Mikroliter mm Millimeter mmol Millimol µm Mikrometer MW Mittelwert n Anzahl der Tiere/Ejakulate nm Nanometer PI Propidiumjodid PNA peanut agglutinin Proc. Processus PSA Pisum sativum agglutinin eingetragenes Warenzeichen ROS reactive oxygene species (reaktive Sauerstoffspezies) SAS Statistical Analysis System SCSA sperm chromatin structure assay (Spermienchromatinstruktur-Assay) SD standard deviation (Standardabweichung) sek Sekunde sog. sogenannt SD Standard STR straightness T tunica Tab. Tabelle TNE Tris-NaCl-EDTA-Puffer TVC testicular vascular cone u. und u.a. unter anderem V. Vena

10 VAP VCL VSL WOB z.b. velocity averaged path velocity curvilinear velocity straight-line wobble zum Beispiel

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13 Einleitung 1 Einleitung Durch die Globalisierung der Hundezucht und die Möglichkeit des Im- und Exports von Tiefgefriersperma und flüssig konserviertem, gekühltem Samen kam es in den letzten Jahren zu einer Umstrukturierung der Hundezucht. Die Züchter haben heutzutage die Möglichkeit, zur Bedeckung ihrer Hündin Deckrüden zu wählen, die zum Teil mehrere tausend Kilometer entfernt leben. Infolgedessen ist auch die Nachfrage nach Samenkonservierung und künstlicher Besamung in den letzten Jahren deutlich gestiegen. In diesem Zusammenhang finden heute regelmäßig Untersuchungen auf die Zuchttauglichkeit und Fruchtbarkeit der Samenspender statt. Dementsprechend haben sich die Methoden zur Ejakulatbeurteilung weiterentwickelt. Neben der konventionellen Spermaanalyse zur Erstellung des Basisspermiogramms werden mittlerweile auch bei der Tierart Hund vermehrt computergestützte Verfahren wie die computergestützte Motilitätsanalyse (GÜNZEL-APEL et al. 1993), die Durchflusszytometrie an fluoreszenzmarkierten Spermien (PETRUNKINA et al. 2004; PENA et al. 2006) sowie der Spermienchromatinstruktur-Assay nach EVENSON et al. (1980) (STROTMANN 2009; NÚNEZ-MARTINEZ et al. 2007) eingesetzt. Diese modernen Untersuchungstechniken minimieren den subjektiven Einfluss des Untersuchers, erhöhen die Genauigkeit der Ergebnisse und führen somit zu einer präziseren Aussage über die Fertilität des Rüden. In der Reproduktionsmedizin kommt Faktoren, die sich negativ auf die Fruchtbarkeit auswirken, besondere Bedeutung zu. Die Regulation der Hodentemperatur spielt hierbei eine erhebliche Rolle. Physiologischer Weise liegt die Kerntemperatur der Hoden einige Grad Celsius [2,5-4 C, WAITES (1970); 2-8 C, BANKS et al. (2005)] unterhalb der Körpertemperatur. Bei verschiedenen Tierarten, wie z.b. Rind (ALBRECHT 2006), Schaf (MIEUSSET et al. 1992) und Pferd (BADER 2001; SCHWEIZER 2006) konnte gezeigt werden, dass sich eine skrotale Hyperthermie ungünstig auf die Samenqualität auswirkt. Informationen zum Einfluss einer skrotalen Hyperthermie auf die Spermienqualität des Hundes liegen bislang nicht vor. 13

14 Einleitung Ziel der vorliegenden Studie war die Gewinnung detaillierter Erkenntnisse über den möglichen Einfluss einer experimentell erzeugten moderaten Hyperthermie am Hundehoden auf die Ejakulatbeschaffenheit und damit die Fertilität gesunder, adulter Beaglerüden. Es sollte der Frage nachgegangen werden, ob qualitative und / oder quantitative Ejakulatparameter betroffen sind. Dabei wurden moderne spermatologische Verfahren wie die computergestützte Motilitätsanalyse, die Durchflusszytometrie und der Spermienchromatinstruktur-Assay eingesetzt. 14

15 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Anatomie von Hoden und Nebenhoden Die Hoden (Testes) sind paarig angelegt und liegen beim Rüden relativ weit kaudal im Zwischenschenkelspalt. Ihre Funktion besteht in der Samenzellproduktion, dem Transport von Spermien sowie der Bildung männlicher Geschlechtshormone. Ihre Größe korreliert beim Rüden mit dem Körpergewicht (GÜNZEL-APEL et al. 1994). Da bei den verschiedenen Hunderassen große Gewichtsunterschiede bestehen, variiert die Größe der Hoden dementsprechend. Die Hoden des Hundes haben eine ovale bis kugelige Form, sind prall-elastisch und liegen frei verschieblich annähernd horizontal im Hodensack (Skrotum) (GÜNZEL-APEL 1986), welcher in der Regel dunkel pigmentiert und kaum behaart ist. Unabhängig von der Tierart unterscheidet man am Hoden ein Kopfende (Extremitas capitata) und ein Schwanzende (Extremitas caudata), weiterhin den mit dem Nebenhoden verwachsenen Nebenhodenrand (Margo epididymalis) sowie den ihm gegenüberliegenden freien Rand (Margo liber). Der Nebenhoden (Epididymis) wird makroskopisch in den kranial liegenden Nebenhodenkopf (Caput epididymidis), den dorsal dem Hoden aufliegenden Nebenhodenkörper (Corpus epididymidis) sowie den kaudal am Hoden gelegenen Nebenhodenschwanz (Cauda epididymidis) eingeteilt. Hoden, Nebenhoden und Samenstrang sind von mehreren Hüllen umgeben. Das Skrotum setzt sich aus der dünnen äußeren Haut, welche viele Schweiß- und Talgdrüsen aufweist, der Unterhaut (Tunica dartos) sowie der Fascia spermatica externa zusammen (EVANS u. CHRISTENSEN 1993; GASSE 1999). Die Tunica dartos besteht aus glatter Muskulatur, die sich bei thermischer und mechanischer Reizung kontrahieren kann, und ist somit durch Oberflächenverkleinerung an der Thermoregulation des Hodens beteiligt (GASSE 1999). Der Innenraum des Skrotums wird durch das Septum scroti in einen linken und rechten Bereich unterteilt, in welchem je ein vom Processus (Proc.) vaginalis umgebener Hoden liegt. Dieser Scheidenhautfortsatz setzt sich aus der Fascia spermatica interna und der Tunica vaginalis zusammen. Der kräftige M. cremaster mit der Fascia cremasterica liegt zwischen Skrotum und Proc. vaginalis. Er agiert reflektorisch und kann durch seine 15

16 Literaturübersicht Befestigung am Proc. vaginalis diesen samt Inhalt anheben. Die dem Hoden unmittelbar anliegende 1-2 mm dicke Tunica albuginea ist reich an Kollagenfasern und bildet eine bindegewebige Organkapsel, die das Hodenparenchym unter Druck hält. Von ihr ausgehend ziehen Bindegewebssepten radiär auf das Hodenzentrum zu und vereinigen sich zum Bindegewebskörper (Mediastinum testis). Die Samenkanälchen (Tubuli seminiferi contorti) sind Ort der Samenzellbildung. Sie liegen in der Peripherie des Hodens und sind stark geschlängelt. Aus ihnen gelangen die Samenzellen in die geraden Tubuli recti, welche in der Mitte des Hodens das Hodennetz (Rete testis) bilden und anschließend über Ausführungsgänge (Ductuli efferentes) in den Nebenhodenkopf münden. Beim Rüden existieren dieser Ausführungsgänge, die sich zum stark geschlängelten, 5-8 Meter langen Nebenhodenkanal (Ductus epididymidis) vereinen, welcher den bindegewebig umhüllten Nebenhodenkörper und schwanz bildet (GASSE 1999; LIEBICH 2003). Das Blutgefäßsystem des Hodens übernimmt wichtige Funktionen bei der Temperatur- und Blutdruckregelung sowie beim Transport von Hormonen. Die arterielle Versorgung des Hodens wird über die aus der Aorta abdominalis entspringende Arteria testicularis gewährleistet. Diese zieht zum tiefen Leistenring und ist ein Bestandteil des Samenstrangs (Funiculus spermaticus), in welchem sie in engen spiraligen Windungen verläuft und so ein Rankenkonvolut bildet (VOLLMERHAUS 1999; CERVENY et al. 1999). An der Extremitas capitata des Hodens tritt die A. testicularis auf den Margo epididymalis über. Die A. testicularis erreicht als Marginalarterie die Extremitas caudata, wo schließlich die Aufteilung in einen lateralen (Ramus lateralis) und einen medialen (Ramus medialis) Ast erfolgt. Beide Rami entlassen während ihres Verlaufes über beide Hodenflächen weitere Äste, die Rami testiculares mediales bzw. laterales, aus denen letztlich die Zentripetalarterien entspringen, welche die Tunica albuginea penetrieren und in den Hodensepten zum Mediastinum testis ziehen. Dort knäueln sich die Arterien erneut auf und laufen als Zentrifugalarterien wieder zurück zur Hodenkapsel (VOLLMERSHAUS 1999; GASSE 1999; SINOWATZ 2001). Der venöse Blutabfluss aus dem Hoden wird über zwei Gefäßsysteme geregelt. Einerseits fließt venöses Blut in zentripetaler Richtung ab. Diese Venen vereinigen sich zur Zentralvene, welche an der Extremitas capitata aus dem Hoden austritt. 16

17 Literaturübersicht Andererseits verlaufen im Parenchym radiär und interlobulär zur Organkapsel venöse Gefäße, die einen zentrifugalen Abfluss bewirken und an der Hodenoberfläche eine Gefäßtapete bilden (GASSE 1999). An der Basis des Samenstranges erfolgt ein Zusammenfluss aller Venen in ein Rankengeflecht, den Plexus pampiniformis, welcher stark verästelt das Rankenkonvolut der A. testicularis umgibt. Auf diese Weise entsteht zwischen Vene und Arterie eine große Austauschfläche, welche die Diffusion erleichtert und den Wärmeaustausch fördet (COULTER u. KASTELIC, 1994). Die aus dem Plexus pampiniformis entspringende V. testicularis mündet schließlich in die V. cava caudalis (GASSE 1999; SINOWATZ 2001; LIEBICH 2003). 2.2 Spermienmorphologie Spermien sind zu eigenständiger Bewegung befähigte männliche Keimzellen. Die Hauptaufgabe dieser hoch spezialisierten Zellen besteht im Transport des männlichen haploiden Genoms in den weiblichen Genitaltrakt, um dieses während der Befruchtung der Oozyte freizusetzen (PENA et al. 2009). Obwohl die Spermien der verschiedenen Tierarten eine jeweils charakteristische Gestalt aufweisen und in ihrer Größe variieren, gibt es in der Grundstruktur diverse Übereinstimmungen (SETCHELL 1982). Das Spermatozoon besteht im Wesentlichen aus dem abgeplatteten Kopf und dem Schwanz, welcher sich in Hals-, Mittel-, Haupt- und Endstück unterteilen lässt (MONESI 1976). Die Gesamtlänge eines Rüdenspermiums beträgt 55,3-62,7 μm (CUMMINS u. WOODALL 1985). Der oval geformte Kopf ist 5,5-7,4 μm lang und durchschnittlich 3,8 μm breit (WOODALL u. JOHNSTONE 1988). Im Spermienkopf befindet sich der aus dicht kondensiertem Chromatin bestehende Zellkern mit dem haploiden Chromosomensatz. Die vorderen 2/3 des Kopfes werden kappenartig vom Akrosom umgeben, welches vom Golgi- Apparat der Spermatiden abstammt. Es enthält hydrolysierende Enzyme wie Akrosin, Esterasen, Hyaluronidasen und saure Proteinasen, denen bei der Penetration der Schutzhüllen der Eizelle (Corona radiata und Zona pellucida) eine besondere Bedeutung zukommt (SINOWATZ 2001; LIEBICH 2003). Die Funktion des 17

18 Literaturübersicht Spermienhalses liegt in der gelenkigen Verbindung zwischen Spermienkopf und dem restlichen Schwanzteil. Das auf das Halsstück folgende Mittelstück ist laut WOODALL u. JOHNSTONE (1988) durchschnittlich 10,1 μm lang. Es beinhaltet zentral gelegen den sog. Achsenfaden (Axonema). Dieser wird von neun Mantelfasern begleitet, die wiederum schraubenartig von den Mitochondrien des Spermiums umgeben sind (Sinowatz 2001). Deren Hauptaufgabe ist es, durch Bereitstellung von ATP die für die Vorwärtsbewegung benötigte Energie zu erzeugen (PENA et al. 2009). Der Schlussring trennt das Mittelstück vom Hauptstück, welches mit einer Länge von im Durchschnitt 45,2 μm den größten Anteil des Spermienschwanzes ausmacht (CUMMINS u. WOODALL 1985; WOODALL u. JOHNSTONE 1988). Ein direkt unter der Zellmembran gelegenes System aus Ringfasern umgibt hier zusätzlich das Axonema und die Mantelfasern. Das relativ kurze Endstück des Spermienschwanzes (4-6 μm) ist durch Fehlen jeglicher Mantel- und Ringfasern ausgesprochen dünn (Ø 0,2 μm) und besteht hauptsächlich aus dem lediglich von der Zellmembran umgebenen Achsenfaden (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). 2.3 Spermatogenese und Spermienreifung Mit dem Begriff Spermatogenese bezeichnet man jegliche Vermehrungs- und Differenzierungsvorgänge, die während der Entwicklung der Spermien in den Samenkanälchen ablaufen und an deren Ende die reife männliche Keimzelle steht. Von Geburt an existieren in den Tubuli seminiferi contorti teilungsfähige Spermatogonien. Mit Eintritt der Geschlechtsreife und der damit verbundenen Konzentrationssteigerung von FSH und Testosteron beginnt die Spermatogenese. Ein kompletter Spermatogenesezyklus dauert beim Rüden acht bis neun Wochen und besteht aus vier bis fünf Tubulusepithelzyklen (FOOTE et al. 1972; IBACH et al. 1975). FOOTE et al. (1972) teilen den Keimepithelzyklus in 8 Phasen, wohingegen IBACH et al. (1975) eine Unterteilung in 10 Phasen postulieren. Die Spermatogenese lässt sich in zwei aufeinanderfolgende Abschnitte, die Spermatozytogenese und die Spermiogenese, gliedern (LIEBICH 2003). Während der Spermatozytogenese 18

19 Literaturübersicht entstehen aus den von den Primordialkeimzellen abstammenden Spermatogonien die Spermatiden. Nach Teilung der Spermatogonien in zwei Tochterzellen verbleibt eine von ihnen als neue Stammzelle, während die andere mehrere mitotische Teilungen durchläuft, so dass primäre Spermatozyten mit diploidem Chromosomensatz entstehen. In einer ersten meiotischen Reifeteilung werden diese zu sekundären Spermatozyten mit haploidem Chromosomensatz. Die zweite meiotische Reifeteilung beendet die Spermatozytogenese mit dem Entstehen von Spermatiden, die ebenfalls einen haploiden Chromosomensatz aufweisen. Im Verlauf der nun folgenden Spermiogenese kommt es zu einer Reihe von Umgestaltungsprozessen an den Spermatiden, an deren Ende das ausdifferenzierte Spermium steht. Diese Reifungsperiode wird in vier verschiedene Phasen unterteilt: Golgi-, Kappen-, Akrosom- und Reifungsphase. In der Golgi-Phase verschmelzen die im Golgi-Apparat gebildeten Vesikel zur akrosomalen Vakuole, welche sich an der Kernmembran im Bereich des späteren Vorderendes anlagert. Über eine Basalplatte gelangt ein proximales Zentriol in Kontakt mit dem Spermatidenkern, während die Geißelentwicklung am distalen Zentriol stattfindet. Während der Kappenphase kommt es zur Abflachung der akrosomalen Vakuole unter gleichzeitiger Verdichtung ihres Inhalts. Durch die zunehmende Ausbreitung der Vakuole über den Kern der Spermatide entsteht schließlich die Akrosomkappe. In der nun folgenden Akrosomphase streckt sich der Spermatidenkern unter zunehmender Kondensation des Chromatins. Die Akrosomkappe folgt dieser Verlängerung des Spermatidenkerns und entwickelt sich zum Akrosom, welches den Zellkern nun zur Hälfte bis zwei Drittel bedeckt. Gleichzeitig wird auch die Bildung des Geißelapparats aus dem distalen Zentriol abgeschlossen. Die Reifungsphase, in welcher Spermienkopf und schwanz ihre speziestypische Ausprägung erhalten, beendet die Spermiogenese (SCHNORR 1985; RÜSSE u. SINOWATZ 1998; LIEBICH 1999; SINOWATZ 2001). 19

20 Literaturübersicht 2.4 Nebenhodenpassage Nach Ablauf der Spermiogenese werden die Spermien in das Lumen der Samenkanälchen freigesetzt (Spermiation) und gelangen über die Ductuli efferentes des Hodens in den Nebenhodenkopf. Mit dem Verlassen des Hodens sind die Spermien noch nicht befruchtungsfähig. Erst während der epididymalen Spermienreifung erhalten sie durch verschiedene morphologische und biochemische Veränderungen die Fähigkeit zur gerichteten Vorwärtsbewegung, zum Überleben im männlichen und weiblichen Reproduktionstrakt, zur Akrosomreaktion, zur Bindung an die Zona pellucida sowie zur Fusion mit der Vitellinmembran der Oozyte (COOPER 1998; TÖPFER-PETERSEN et al. 1998; KIRCHHOFF 1999). Die Dauer der Nebenhodenpassage der Spermien variiert bei den einzelnen Spezies nur geringgradig. Im Durchschnitt beträgt sie 8 15 Tage (JONES 1989; LIEBICH 2003). Mit Beendigung der Nebenhodenpassage erlangen die Spermien ihre volle Befruchtungsfähigkeit (BAMBERG 1975) und können anschließend als reife Spermatozoen wochenlang im Nebenhodenschwanz gespeichert werden (GENESER 1990). 2.5 Physiologische Wärmeregulation des Hodens Mit Ausnahme einiger weniger Säugetiere (Robben, BLIX et al. 1983; Wale, ROMMEL et al. 1992; Elefanten und Klippschliefer, SETCHELL u. MIEUSSET 1996), liegen die Hoden der geschlechtsreifen Haussäugetiere, so auch die des Rüden, extraabdominal im Skrotum. Diese exponierte Lage stellt sicher, dass die physiologische Kerntemperatur der Hoden einige Grad Celsius unterhalb der Körperinnentemperatur liegt. WAITES (1970) gibt eine Temperaturdifferenz von 2,5-4 C an, BANKS et al. (2005) sogar eine Differenz von 2-8 C. Die niedrigere Hodentemperatur ist essentiell für den ungestörten Ablauf der Spermatogenese (WAITES u. SETCHELL 1969; WAITES 1970; BANKS et al. 2005). Auch die Speicherfähigkeit des Nebenhodenschwanzes ist temperaturabhängig (TÖPFER- PETERSEN und WABERSKI 2001). Die Temperatur nimmt ausgehend vom 20

21 Literaturübersicht Nebenhodenkopf über den Nebenhodenkörper kontinuierlich ab, so dass bei Säugetieren im Spermienreservoir des Nebenhodenschwanzes die niedrigste skrotale Temperatur zu finden ist. TÖPFER-PETERSEN und WABERSKI (2001) beschrieben für den Nebenhodenschwanz Temperaturen, die 4-5 C unterhalb der Körperkerntemperatur lagen. Zur Aufrechterhaltung des Temperaturgradienten tragen verschiedene spezifische Mechanismen bei (ROBERTSHAW u. VERCOE 1980). Dazu zählen das Gegenstromprinzip über den sog. testicular vascular cone (TVC) (GUNN u. GOULD 1975; COOK et al. 1994), die Wärmeabstrahlung von der Oberfläche des Skrotums (COULTER 1988), die Veränderung der Hodenlokalisation im Zwischenschenkelspalt über Muskelanteile der Tunica dartos (SETCHELL 1978) und die Entstehung von Verdunstungskühle mit Hilfe der skrotalen Schweißdrüsen (BLANQUEZ et al. 1988). Diese Mechanismen, die für die meisten Säugetiere gelten (ASHDOWN u. HANCOCK 1980; SETCHELL 1991), sind beim Bullen am intensivsten untersucht worden (ROBERTSHAW u. VERCOE 1980; TURNER 1980; COOK et al. 1994; KASTELIC et al. 2000; BRITO et al. 2004). Das Gegenstromprinzip beruht auf den anatomischen Besonderheiten in der Blutversorgung der Hoden. Die A. testicularis bildet oberhalb der Hoden ein stark aufgeknäultes Rankenkonvolut, welches von einem Venengeflecht, dem Plexus pampiniformis, umgeben ist (GASSE 1999). Dieser wirkt als Wärmeaustauscher und kühlt das arterielle Blut ab. Die Schleifenbildung der A. testicularis vor dem Herantreten an den Hoden verlangsamt zudem den Blutfluss und ermöglicht auf diese Weise eine gewisse Wärmeregulation (HARRISON u. WEINER 1949). Eine Wärmeeinwirkung auf den Hoden führt zu einer Entspannung der unter der Skrotalhaut gelegenen Tunica dartos sowie des M. cremaster. Die dadurch erreichte Vergrößerung der skrotalen Oberfläche hat eine höhere Wärmeabstrahlung zur Folge. Gleichzeitig verlagert sich der Hoden nach unten und liegt nun weiter entfernt vom Körper. Damit verringert sich der Wärmeeinfluss der Körpertemperatur auf den Hoden (HARTIG 1954; SETCHELL 1978). Im Gegensatz dazu führt Kälteeinwirkung zu einer Fältelung der Skrotalhaut und somit zu einer Oberflächenverkleinerung des Skrotums. Der Hoden wird über reflektorische Kontraktion des M. cremaster näher an den Körper herangezogen. Als Konsequenz verringert sich die Wärmeabstrahlung 21

22 Literaturübersicht und der Wärmeaustausch mit dem Körperkern kann effektiver erfolgen (HARTIG 1954). Auch die Beschaffenheit der äußeren Skrotalhaut trägt zur testikulären Thermoregulation bei. Sie ist relativ dünn, meist wenig behaart und auf der Oberfläche mit vielen Schweißdrüsen versehen (KASTELIC et al. 2000). Fettgewebe, welches den restlichen Körper isoliert, fehlt hier (HARRENSTEIN 1928). Dafür existiert nur hier ein ausgeprägter subepidermaler Lymphgefäßplexus (ESSER 1932). Die Schweißdrüsen des Skrotums sind größer und produzieren ca. fünfmal mehr Schweiß pro Drüse als die Schweißdrüsen des restlichen Körpers (BLAZQUEZ et al. 1988). ROBERTSHAW und VERCOE (1980) stellten fest, dass bei Bullen, die einer Umgebungstemperatur von 40 C ausgesetzt waren, der Feuchtigkeitsverlust über das Skrotum höher war als der über die gesamte Körperoberfläche zusammengenommen. Ursächlich hierfür sind die speziellen Schweißdrüsen des Skrotums. Desweiteren weist die Skrotalhaut eine im Vergleich zur restlichen Körperhaut erhöhte Wasserdurchlässigkeit auf, wodurch es insgesamt zu einer Steigerung der Wasserdiffusionsrate am Skrotum und in deren Folge auch zu einer Kühlung kommt (ROBERTSHAW u. VERCOE 1980). Unterschiede in der Thermoregulationsfähigkeit zwischen verschiedenen Rassen sowie zwischen Individuen einer Rasse wurden sehr intensiv am Bullen untersucht. So sind Bos (B.) indicus Rinder besser in der Lage, höhere Temperaturen auszugleichen als Rinder der Rasse B. taurus. Dies hängt mit einem vergleichsweise größeren Quotienten aus Hautumfang/Körpergröße, einer vermehrten Anzahl an Schweißdrüsen, einer geringeren Wärmeproduktion sowie einem in der Regel kleineren Körperumriss zusammen (TURNER 1980). BRITO et al. (2004) fanden außerdem Diskrepanzen in der Morphologie der Blutgefäße und des testicular vascular cone, welche eine unterschiedliche Effektivität der skrotalen Thermoregulation zur Folge haben können. So führt eine kürzere A. testicularis und ein damit verbundenes geringeres arterielles Volumen, wie es bei B. taurus der Fall ist, zu einem reduzierten Wärmeaustausch zwischen arteriellem und venösem Blut und in der Folge zu höheren Temperaturen in Hoden und Nebenhoden. Des Weiteren kann auch die Dicke der Arterienwand insofern eine Rolle spielen, als dass eine dünnere Gefäßwand eine größere Wärmeabgabe ermöglicht, was wiederum in 22

23 Literaturübersicht einer besseren Samenqualität resultieren kann (COOK et al. 1994; BRITO et al. 2004). Auch die Distanz zwischen Arterie und Vene im TVC beeinflusst den Wärmeaustausch. Je näher die beiden Gefäße aneinander liegen, desto besser kann die Wärmeabgabe erfolgen. Bei B. inducus liegen Arterie und Vene enger zusammen als bei B. taurus und der gemessene Temperaturabfall nach Passage des TVC ist deutlich höher (BRITO et al. 2004). 2.6 Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf die Ejakulatqualität Die Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf die Ejakulatbeschaffenheit wurden bereits bei verschiedenen Tierarten (Kaninchen, PLOEN 1973; Schwein, STONE 1982; Hund, SHAFIK 1991; Rind, BRITO et al. 2004, WU 2005, ALBRECHT 2006; Pferd, FREIDMANN et al. 1991, SCHWEIZER 2006; Lama, SCHWALM et al. 2007) untersucht. Die Erwärmung der Hoden kann durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden. Dazu gehören das Anlegen eines Suspensoriums, das Eintauchen der Hoden in ein Wasserbad, der künstlich induzierte Kryptorchismus sowie das Verbringen des ganzen Tieres in einen Raum mit erhöhter Umgebungstemperatur (SETCHELL 1998). Prinzipiell sind die Auswirkungen auf die Ejakulatqualität sowohl von der Höhe der Temperatur als auch von der Dauer der Temperatureinwirkung abhängig (VAN OORDT u. VAN DER HEYDE 1927; MIEUSSET et al. 1992). Die bislang einzige Arbeit zur Untersuchung der Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf die Ejakulatbeschaffenheit beim Rüden wurde 1991 von Shafik durchgeführt. Die Hoden von 20 adulten Rüden mit Normospermie wurden in den Skrotalhals verlagert und dort für den Zeitraum von einem Jahr fixiert. Durch die nähere Lage zum Abdomen und die eingeschränkte Mobilität konnte eine intraskrotale Temperaturerhöhung um durchschnittlich 2 C erreicht werden. Zwischen der 2. und 4. Woche nach Versuchsbeginn begann die Spermiendichte zu sinken. Vor Anlegen des Suspensoriums betrug sie mindestens 40 x 10 6 / ml. Drei Monate nach Versuchsbeginn zeigte sich bei allen Rüden eine hochgradige Oligozoospermie mit Spermienkonzentrationen unter 20 x 10 6 und nach 12 Monaten 23

24 Literaturübersicht lag bei 16 der 20 Rüden eine Azoospermie vor. Die Spermienmotilität nahm ebenfalls stark ab und erreichte bei den vier verbliebenen Rüden nach 12 Monaten mit durchschnittlich 14,6% vorwärtsmotilen Spermien ein Minimum. Bereits 4 Wochen nach Versuchsbeginn war ein Anstieg der formabweichenden Spermien zu verzeichnen, welcher nach 12 Monaten bei den vier verbliebenen Rüden ein mittleres Maximum von 90% aufwies. Nach Lösen der Fixation und Rückverlagerung der Hoden in die physiologische Position befand sich die Spermiengesamtzahl nach 3 Monaten wieder auf Ausgangsniveau bzw. war zum Teil sogar höher als vor der Temperatureinwirkung. Der Anteil formabweichender Spermien sank bei allen Rüden auf weniger als 40% ab. Die Spermienmotilität, die vor Versuchsbeginn bei mindestens 70% motilen Spermien gelegen hatte, betrug drei Monate nach Rückverlagerung der Hoden bei 12 Rüden > 70% und bei acht Rüden < 70%. HERR (2010) untersuchte die Auswirkungen einer 48stündigen skrotalen Hyperthermie auf Hoden und Nebenhoden mittels histologischer und immunhistochemischer Verfahren. Bei den insgesamt sieben Rüden wurde eine skrotale Temperaturerhöhung um durchschnittlich 3,7 C erreicht. Zwei der Tiere wurden neun Wochen später kastriert. Fünf Rüden erhielten eine zweite Hyperthermiephase mit einer durchschnittlichen Temperaturerhöhung um 3,8 C. Mittels TUNEL- und Caspase-3 Verfahren wurde nach skrotaler Hyperthermie tendenziell eine Zunahme der Anzahl apoptotischer Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Wärmeapplikation beobachtet. Auch neun Wochen nach der Wärmeeinwirkung war die Anzahl apoptotischer Zellen noch erhöht, während nach der zweiten Hyperthermie vermehrt Nekrosen im Keimepithel nachweisbar waren. Das Nebenhodentubulusepithel wies bei den wärmebehandelten Tieren vor allem vakuolige Veränderungen auf. Mit Hilfe der Ki-67-Methode war bei der Versuchsgruppe im Gegensatz zur Kontrollgruppe ein kompensatorischer Anstieg der Proliferation zu verzeichnen. Die durch die skrotale Wärmeapplikation hervorgerufenen Schädigungen des Hodengewebes waren reversibel, jedoch nach einem Spermatogenesezyklus noch nicht vollständig behoben. Bei Hengsten konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Skrotaltemperatur um 2-3 C schwerwiegende Auswirkungen auf die Samenqualität 24

25 Literaturübersicht haben kann (FREIDMANN et al.1991; LOVE u. KENNEY 1999; BADER 2001). SCHWEIZER (2006) rief bei drei Hengsten mit Normospermie durch Anlegen eines Suspensoriums über 48 Stunden eine Erhöhung der skrotalen Oberflächentemperatur um 2-4 C hervor. Während der folgenden 3 Monate zeigte sich bei allen drei Hengsten ein kontinuierlicher Abfall des Prozentsatzes vorwärtsbeweglicher Spermien bis Woche 4, von durchschnittlich 64 % auf 35 %. In der 5. Woche nach Versuchsbeginn trat ein kurzzeitiger Ansteig der Vorwärtsmotilität um 15 % ein, bevor in Woche 7 ein durchschnittlicher Minimalwert von 27 % festgestellt wurde. Der durchschnittliche Prozentsatz an Spermien mit intakter Plasmamembran stieg in Woche 3 von anfangs 34 % auf 51 % an. Dies erklärte die Autorin damit, dass in der Studie Junghengste eingesetzt wurden die erst nach einigen Absamungen Normwerte erreichten. Ab der 4. Woche sank der Anteil plasmamembranintakter Spermien ab und erreichte in Woche 7 nur noch 19 %. Die Spermiengesamtzahl wies bei zwei Tieren in den Wochen 7 bzw. 8 nach Wärmeapplikation eine deutliche Reduzierung auf. Bei zwei Hengsten stieg der Anteil an Spermien mit erhöhter DNA-Fragmentation (%DFI) deutlich an, und zwar bei einem Tier bis zur 5. Woche von 7 auf 22 %, bei dem zweiten Hengst von 17 auf 35 % in Woche 3 bis Woche 5. Nach Erreichen des Maximums fielen bei beiden Hengsten die DFI-Werte wieder bis Woche 9 auf 6 % und blieben bis zum Ende der 12 Wochen dauernden Untersuchungsperiode konstant. Der dritte Hengst wies nur geringgradige Schwankungen im DFI-Wert auf. Die detailliertesten Untersuchungen zur Auswirkung skrotaler Hyperthermie auf die Ejakulatbeschaffenheit liegen bei der Tierart Rind vor. Schon 1966 beschrieben SKINNER und LOUW, dass durch eine erhöhte Umgebungstemperatur die Anzahl morphologisch abnormer Spermien im Ejakulat zunimmt. Im selben Jahr führte EL AZAB (1966) eine testikuläre Hyperthermie durch Inkubation der Hoden in einem Wasserbad herbei und erzielte ähnliche Ergebnisse. Auch bei Bullen wurde durch Anlegen eines Suspensoriums über einen Zeitraum von 48 Stunden eine Störung der Spermiogenese induziert (WILDEUS und ENTWISTLE, 1983; VOGLER et al. 1991, 1993). Die Spermiogramme der Tiere wiesen in den 25

26 Literaturübersicht Merkmalen Formabweichungen und Motilität deutliche Abweichungen von der Norm auf. Insbesondere wurden in den Tagen 6 bis 30 nach Wärmeapplikation vermehrt Spermien mit abgelösten Köpfen beobachtet. ACEVEDO (2001) stellte 27 Tage nach Erzeugung einer 48-stündigen skrotalen Hyperthermie durch Isolierung der Hoden mittels Suspensorium bei sechs Bullen mit Normospermie einen Abfall des Prozentsatzes vorwärtsmotiler Spermien auf 47 % fest. Der Anteil formabweichender Spermien stieg ab Tag 13 an und erreichte ein Maximum zwischen Tag 20 und 23 nach Wärmeapplikation. Am Tag 34 waren wieder Ausgangswerte erreicht. Veränderungen in der Spermienmorphologie wurden auch in dieser Studie insbesondere im Bereich des Kopfes und der Kopfkappe festgestellt. WU (2005) erreichte bei vier Bullen ebenfalls mittels Suspensorium eine Erhöhung der skrotalen Temperatur um 6 7 Celsius über einen Zeitraum von 48 Stunden. Bereits 12 Tage später kam es zu einer deutlichen Abnahme der Spermiengesamtzahl. Gleichzeitig war eine signifikante Zunahme von Spermien mit Anomalien im Kopfbereich zu verzeichnen. Nachdem am Tag 23 ein Maximum an Kopfveränderungen vorlag, befanden sich die Werte am Tag 33 wieder auf Ausgangsniveau. ALBRECHT (2006) erhöhte bei vier Bullen über 48 Stunden die Skrotaltemperatur um durchschnittlich 3,2-5,1 C durch das Anlegen eines Suspensoriums. Daraus resultierte eine Abnahme der Spermiengesamtzahl nach einer bis zwei Wochen. Bei drei Tieren lag das Minimum mit Werten von 0,3, 0,2 und 3,7 Mrd. Spermien pro Ejakulat in Woche 4 oder 5, während der vierte Bulle zwischen Woche 3 und 8 durchgehend niedrige Spermiengesamtzahlen von unter 0,2 Mrd. aufwies. Der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien sank auf unter 10 bzw. 5 % ab. Der Anteil sekundärer Spermienanomalien stieg bei allen vier Tieren stark an und zwar von durchschnittlich 1,8 % auf 59,0-60,9 %. Der DFI-Wert betrug vor der Wärmeapplikation durchschnittlich 8,9 % und stieg danach stetig an. In den Wochen 4 oder 5 wurden Höchstwerte zwischen 64,3 % und 89,5 % gemessen. Am Ende der 10-wöchigen 26

27 Literaturübersicht Versuchsphase lagen alle untersuchten Parameter annähernd oder wieder vollständig auf Ausgangsniveau. MIEUSSET et al. (1992) führten bei 12 Schafböcken mittels eines Suspensoriums eine skrotale Temperaturerhöhung um ca. 2 C herbei. Bei 8-stündiger Wärmeapplikation pro Tag über einen Zeitraum von insgesamt 162 Tagen zeigten sich in der Spermiengesamtzahl keine Veränderungen. Der durchschnittliche Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien lag jedoch während des gesamten Zeitraumes unterhalb des Niveaus der Kontrollgruppe. Bei 16-stündiger Wärmeapplikation pro Tag über 144 Tage sank die Spermiengesamtzahl unter die Werte der Kontrollgruppe ab. Dieser Unterschied war signifikant. Auch der Abfall vorwärtsmotiler Spermien fiel in dieser Gruppe deutlicher aus als bei 8-stündiger Hyperthermie pro Tag. Bei einer 24-stündigen Temperaturerhöhung über einen Zeitraum von 30 Tagen war bereits nach 12 Tagen ein Abfall der Spermiengesamtzahl zu verzeichnen, welcher sich binnen 80 Tagen nach Beendigung der Wärmeapplikation regenerierte. Der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien verringerte sich ab Tag 9 der Wärmeapplikation und sank auf beinahe 0 %. Siebzig Tage nach Beendigung der Hyperthermie waren auch hier wieder Ausgangswerte erreicht. Bei zwei Javaneraffen (Macaca fascicularis) führte ein 30minütiges Erwärmen der Hoden in einem Wasserbad bei 43 C über 6 Tage zu einer Azoospermie in Woche 6 bzw. 8. Ein drittes Tier entwickelte eine Olizozoospermie 6 Wochen nach Wärmeapplikation. Es zeigten sich keine signifikanten Änderungen bezüglich der Spermienmotilität und Spermienmorphologie (LUE et al. 2002). PÈREZ-CRESPO et al. (2008) führten eine ähnliche Studie mit identischer Wärmeapplikation bei Mäusen durch. Die Spermienkonzentration war 7, 14, 21, 28 und 60 Tage nach Hitzeeinwirkung signifikant erniedrigt. An Tag 14, 21 und 28 zeigte sich eine signifikante Herabsetzung der Spermienmotilität und an den Tagen 7, 14, 21 und 28 war die Anzahl toter Spermien deutlich erhöht. 27

28 Literaturübersicht 2.7 Bewertung der Spermaqualität Konventionelle Spermaanalyse Die klassische Ejakulatanalyse umfasst die Bestimmung von Volumen, Aussehen, Samendichte, Spermiengesamtzahl, ph-wert, Spermienmotilität und morphologie (GÜNZEL 1986). Das Ejakulat wird in drei Fraktionen, - Vorsekret, spermienreiche Phase und Nachsekret -, aufgefangen. Den Hauptanteil des Gesamtvolumens bildet das aus der Prostata stammende Nachsekret. Durch die Dichtebestimmung in der spermienreichen Phase lässt sich die Spermiengesamtzahl des Ejakulates durch Multiplikation von Volumen mal Dichte errechnen, welche einen bedeutsamen Parameter für die Beurteilung des Ejakulates darstellt (GÜNZEL 1986; GÜNZEL- APEL et al. 1993; PENA-MARTINEZ 2004; ROOT KUSTRITZ 2007). Die physiologische Spermiengesamtzahl eines Ejakulats ist vom Körpergewicht und damit von der Größe der Hoden abhängig. So sollten Ejakulate von Rüden zwischen 10 und 20 kg Körpergewicht mindestens 500 x 10 6 Spermien aufweisen, die durchschnittliche Spermienzahl pro Ejakulat beträgt 800 x 10 6 (GÜNZEL-APEL et al. 1994). Die Bewertung des Aussehens erfolgt subjektiv nach Konsistenz und Farbe. Sekret aus der Prostata ist wässrig und klar, während die spermienreiche Phase milchig bis molkig und weißlich erscheint. Eine Abweichung, z.b. in Form einer Hämospermie, kann auf ein pathologisches Geschehen hinweisen, dessen Ursache abgeklärt werden sollte (ROOT KUSTRITZ 2007). Der normale ph-wert in Hundesperma beträgt 6,7 ± 0,2 (GÜNZEL-APEL 1986). Die Messung sollte zügig nach der Samenentnahme erfolgen (THRELFALL 2003). Die Motilität ist ein wichtiger Indikator für die Funktionsfähigkeit von Spermien. Die funktionale und strukturelle Kompetenz des Spermatozoons spiegelt sich in der Bewegungsfähigkeit wider (PENA-MARTINEZ 2004). Es besteht eine positive Korrelation zwischen progressiver Motilität einerseits und der Plasmamembranintegrität (KUMI-DIAKA 1993; RODRIGUEZ-GIL et al. 1994) sowie der physiologischen Morphologie von Spermien andererseits (ELLINGTION et al. 1993). Üblicherweise wird zur Erhebung der Spermienmotilität der Anteil vorwärts-, 28

29 Literaturübersicht orts- und unbeweglicher Spermien mikroskopisch geschätzt (ROTA et al. 1997). Aufgrund der subjektiven Beurteilung durch unterschiedliche Untersucher kann es zu einer großen Variation der Ergebnisse kommen (LINFORD et al. 1976; IGUER- OUADA u. VERSTEGEN 2001). In frisch gewonnenen Ejakulaten sollte der Anteil vorwärtsmotiler Spermien bei >60 % liegen (GÜNZEL-APEL et al. 1994). Laut JOHNSTON et al. (2001) und IGUER-OUADA u. VERSTEGEN (2001) beträgt der Anteil motiler Spermien in einem normalen Ejakulat zwischen 70 und 90 %. Nach LARSEN (1980) sollte das Ejakulat fertiler Rüden mindestens 70 % vorwärtsbewegliche Spermien aufweisen. Zusätzlich ist zur Bestimmung der Fertilität eines Rüden die Spermienmorphologie ein wichtiger Parameter (SALLAM et al. 2003). Nach dem Ort ihrer Entstehung unterscheidet man primäre und sekundäre Abweichungen. Primäre Spermiendefekte entstehen während der Spermatogenese wohingegen sich sekundäre während der Spermienausreifung im Nebenhoden oder im Samenleiter während der Ejakulation entwickeln (OETTLÈ u. SOLEY 1986; GÜNZEL-APEL et al. 1994). Sie sind Folge eines kurzzeitigen Stresses und werden als weniger bedenklich in Bezug auf die Fruchtbarkeit eingestuft als primäre Defekte, wobei ein hoher Prozentsatz sekundärer Veränderungen die Motilität und somit die Fruchtbarkeit einschränkt (PENA-MARTINEZ 2004). Nach KRAUSE (1965) liegt der Prozentsatz formabweichender Spermien bei Rüden mit Normospermie unter 20 %. Dies entspricht dem von GÜNZEL (1986) in insgesamt 74 Hundeejakulaten ermittelten Durchschnittswert von 17,6 %. Generell kann ein Ejakulat als normal beurteilt werden, wenn der Anteil formabweichender Spermien nicht mehr als 30 % beträgt (CHRISTIANSEN 1984; GÜNZEL-APEL et al. 1994; VEZNIK et al. 2003) Durchflusszytometrie Nach FOOTE (1975) ist die Akrosomintegrität der verlässlichste Parameter für die Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit von Spermien. Mit der Methode der Durchflusszytometrie können heutzutage die akrosomale Integrität und der Plasmamembranstatus sowie die Integrität der DNA-Doppelhelix bestimmt werden. 29

30 Literaturübersicht Nach PENA (2007) ist der Durchflusszytometrie im Vergleich zur mikroskopischen Bestimmung der Spermienmotilität der Vorzug zu geben, da eine subjektive Beeinflussung der Ergebnisse durch den Untersucher ausgeschlossen ist. Die Durchflusszytometrie ist ein sensitives und objektives Verfahren und ermöglicht die Analyse vieler lebender Zellen in kurzer Zeit (PENA et al. 1998). Die gegenüber der Auswertung am Mikrosokop erhöhte Sensitivität resultiert aus der Analyse von Zellen. Aus diesem Grund ist auch die Erfassung geringer Abweichungen mit hoher Wiederholbarkeit und Genauigkeit möglich (PENA et al. 2001). Außerdem erlaubt die Durchflusszytometrie die gleichzeitige Messung multipler Samenqualitätsparameter (BALLACHEY et al. 1986; PENA et al. 1998; GRAHAM 2001). Das Prinzip der Methode besteht in der Markierung von Spermien mit einem fluoreszierenden Farbstoff. Diese werden in einem Flüssigkeitsstrom an einem fokussierten Laser vorbeigeführt. Ein optisches System detektiert die Lichtemissionen der einzelnen Zellen und wandelt sie in digitale Signale um. Anschließend erfolgt die Auswertung der Daten über einen an das Durchflusszytometer angeschlossenen Computer (BALLACHEY et al. 1986) Integrität von Plasma- und Akrosommembran Da die Spermienmembran einen exakten Biosensor für den gesamten Zellstatus darstellt, ist die Erfassung subtiler Veränderungen von großer Bedeutung (PENA 2007). Die Integrität der Plasmamembran sowie die Akrosomintegrität sind für die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen essentiell (PENA et al. 1998). Das Lektin Peanut Agglutinin (PNA) bindet selektiv an der Innenseite der äußeren Akrosommembran (FLESCH et al. 1998). Der an das PNA gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) emittiert nach Laseranregung Licht im grünen Bereich. FITC-PNA gefärbte Spermien mit geschädigtem Akrosom können so anhand ihrer Grünfärbung durchflusszytometrisch ermittelt werden. Da Lektine intrazellulär an akrosomgebundenes Material binden (CROSS u. MEIZEL 1989), können lediglich permeable bzw. geschädigte Akrosome gefärbt werden (THOMAS et al. 1997), während sich intakte Akrosome nicht anfärben lassen 30

31 Literaturübersicht (ASHWORTH et al. 1995; SZÀSZ et al 2000). Die Zellmembran vitaler Spermien ist für FITC-PNA undurchlässig (CHENG et al. 1996). Propidiumjodid (PI) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der aufgrund seiner Molekülgröße nur in Zellen mit geschädigter Plasmamembran eindringen kann (GROGAN u. COLLINS 1990; HARRISON u. VICKERS 1990; ORTMANN u. RODRIGUEZ- MARTINEZ 1994). Es handelt sich um einen DNA-bindenden Farbstoff, der nach Laseranregung rot fluoresziert (ROTA et al. 1995). Auf diese Weise ist eine Unterscheidung zwischen vitalen (membranintakten) und geschädigten (membrandefekten) Spermien möglich (HARRISON u. VICKERS 1990; GARNER et al. 1999; RATHI et al. 2001) Spermienchromatinstukturanalyse (SCSA TM ) Das Spermienchromatin enthält die genetische Information der Samenzelle und füllt den Spermienkopf fast vollständig aus (MONESI 1976). Es besteht aus DNA, niedermolekularen basischen Kernproteinen, Lipiden und Ionen wie Kalium, Magnesium, Kupfer, Zink und Phosphat. Durch starke Komprimierung der Chromatinsubstanz während der Spermatogenese und der epididymalen Reifungsphase wird die Erbsubstanz wirkungsvoll gegen äußere Schadeinwirkungen geschützt und ihre Integrität bis zur Fertilisation aufrechterhalten (LOVE u. KENNEDY 1998; EVENSON u. JOST 2000). Chromatindefekte Spermien sind zwar grundsätzlich in der Lage, die Oozyte zu befruchten, führen aber zu einer erhöhten embryonalen Mortalität (TEJADA et al. 1984). Dementsprechend kann das vermehrte Vorliegen chromatindefekter Spermien im Ejakulat auf eine verminderte Fruchtbarkeit des männlichen Individuums hinweisen. Nach EVENSON et al. (2002) empfiehlt sich zur genaueren Einschätzung der Befruchtungsfähigkeit von Spermien zusätzlich die Beurteilung des Spermienchromatinstatus. Mit dem von EVENSON et al. (1980) entwickelten Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA TM ) wird die Integrität des Spermienchromatins analysiert. Das Verfahren beruht auf der erhöhten Empfindlichkeit von abnormal strukturiertem Chromatin 31

32 Literaturübersicht gegenüber säure- oder hitzevermittelter Denaturierung und liefert somit Informationen über die Stabilität des Spermienchromatins. Das Sperma wird hierzu mit einem stark sauren Medium (ph = 1,2) versetzt, wodurch eine Denaturierung der normalerweise doppelsträngig vorliegenden DNA-Moleküle in zwei Einzelstränge herbeigeführt wird. Da nur die DNA chromatininstabiler Spermien anfällig für diesen Denaturierungsprozess ist, hängt das Ausmaß der provozierten Denaturierung vom Grad der Spermienchromatinintegrität ab. Nach Färbung mit dem metachromatischen Akridinorange wird mittels Durchflusszytometrie die Fluoreszenz überprüft. Jedes Spermium passiert einen fokussierten Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm (blaues Licht). Bei Auftreffen des Laserstrahls auf die Zellen werden diese zur Fluoreszenz angeregt. Beim Vorliegen doppelsträngiger, also intakter, DNA lagert sich das Akridinorange als Monomer zwischen zwei parallele Basen, was grüne Fluoreszenz (Emissionsmax. 530 nm) zur Folge hat. An Einzelstränge bindet der Farbstoff als Polymer und ruft rote Fluoreszenz (Emissionsmax. 640 nm) hervor (ICHIMURA et al. 1971; DARZYNKIEWICZ et al. 1975; EVENSON et al. 1980; ROYERE et al. 1988; KOSOWER et al. 1992). Für jedes einzelne Spermium wird der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoresz (rot + grün) errechnet (BALLACHEY et al. 1986; EVENSON et al. 1991). Laut EVENSON et al. (2002) wird dieser Wert nach neuer Nomenklatur als DNA-Fragmentationsindex (DFI) bezeichnet. Der DFI kann Werte zwischen 0 und 1 annehmen und quantifiziert das Ausmaß der Denaturierung jedes Spermiums. Je mehr Spermien eine chromatininstabile DNA aufweisen, desto höher ist der Wert. In einem Verteilungshistogramm werden die gemessenen DFI-Werte abhängig von ihrer Höhe dargestellt. Spermien mit einer hohen Rotfluoreszenz werden als DFI-Spermien bezeichnet (EVENSON et al. 2002). Bei mehreren Tierarten wurde eine negative Korrelation zwischen dem DFI-Wert und der Fertilität nachgewiesen (Eber, EVENSON et al. 1994; Hengst, KENNEY et al. 1995, MORRELL et al. 2008; Bulle, BALLACHEY et al. 1986). Bei Hunden wurde die Chromatinstruktur sowohl von frischem als auch von tiefgefrorenem Sperma in diversen Studien untersucht (NUNEZ-MARTINEZ et al. 2005; SHAHIDUZZAMAN u. LINDE-FORSBERG 2007; KODERLE et al. 2009). STROTMANN (2009) stellte bei Rüden eine Korrelation zwischen dem DFI und dem Anteil vorwärtsbeweglicher, membrangeschädigter 32

33 Literaturübersicht sowie dem Gesamtanteil morphologisch abweichender Spermien fest. Ferner bestand ein Zusammenhang zwischen dem Anteil chromatininstabiler Spermien einerseits und dem Gesamtanteil kopfkappenveränderter Spermien, dem Anteil sekundärer Kopfkappenveränderungen, dem Anteil an Kopfveränderungen und dem Anteil an Spermien mit Veränderungen am Halsbereich oder Veränderungen an Haupt- und Endstück andererseits. Der Spermienchromatinstatus kann demzufolge als zusätzlicher Fertilitätsparameter herangezogen werden (EVENSON u. JOST 2000). 2.8 Motilitätsparameter aus computergestützten Analysen Nach SAACKE und WHITE (1972) und LINFORD et al. (1976) ist die mikroskopische Schätzung der Spermienmotilität keine verlässliche Methode, um eine Aussage über die zu erwartende Fruchtbarkeit treffen zu können. Aufgrund des subjektiven Einflusses durch den Untersucher können sogar innerhalb eines Labors große Unterschiede bestehen (JØRGENSEN et al. 1997). Zur objektiven Beurteilung der Spermienmotilität wurde Mitte der achtziger Jahre die computerassistierte Spermaanalyse (CASA) eingeführt (BLACH et al. 1989; JASKO et al. 1988; SCHROEPPEL 1988). Bei diesem Verfahren werden mittels einer Videosequenz Einzelbilder mit variierender Frequenz von dem zu untersuchenden Sperma angefertigt. Ein Computerprogramm wertet anschließend die Motilität der einzelnen Spermien aus (KATZ et al. 1985). Diese Methode liefert eine Vielzahl von Informationen über die kinetischen und morphometrischen Charakteristika einer Samenprobe (GÜNZEL-APEL et al. 1993; VERSTEGEN et al. 2002; RIJSSELAERE et al. 2004). Neben den Anteilen vorwärts- und ortsbeweglicher Spermien werden zusätzlich die Geschwindigkeit sowie die Bewegungsrichtung bestimmt (LEIDL et al. 1987; WEITZE 2001). Insgesamt können bis zu 20 Variable erfasst werden (LENZI 1997). 33

34 Material und Methoden 3 Material und Methoden Eine Materialliste der verwendeten Laborgegenstände (9.5) und Chemikalien (9.7) sowie Geräteeinstellungen (9.2, 9.3, 9.4) sind im Anhang aufgeführt. 3.1 Versuchstiere Zur Durchführung der Studie wurden sieben (A - G) institutseigene geschlechtsgesunde Beaglerüden mit Normospermie im Alter von zwei bis drei Jahren verwendet. Das durchschnittliche Gewicht der Rüden betrug 14,5 ± 0,9 kg. Die Rüden wurden in Zweier- oder Dreiergruppen in einem Außenzwinger gehalten. Dieser beinhaltete einen Auslauf und eine mit Stroh eingestreute Schutzhütte. Den Tieren stand Wasser ad libitum zur Verfügung. Sie wurden einmal täglich mit einer Mischung aus handelsüblichem Trocken- und Nassfutter gefüttert. Alle Rüden waren sowohl zu Beginn als auch während der gesamten Studienzeit klinisch allgemeingesund. 3.2 Versuchsaufbau Alle sieben Rüden wurden über einen Zeitraum von drei Wochen auf die Samenentnahmen konditioniert. In der darauffolgenden Versuchsphase wurden die Rüden zweimal wöchentlich im Abstand von drei bis vier Tagen zur Samengewinnung herangezogen. Die Studie begann mit einer viereinhalb Wochen dauernden Vorlaufphase (Kontrollperiode). Danach wurde am Skrotum der Rüden für 48 Stunden ein Suspensorium angelegt, um eine skrotale Hyperthermie hervorzurufen (Abb. 1 u. 2). Es folgte eine Nachlaufphase von neun Wochen. Zwei Rüden (A, B) wurden anschließend kastriert. Den verbleibenden fünf Rüden (A - E) wurde abermals für 48 Stunden ein Suspensorium angelegt. Bei drei Rüden (C - E) erfolgte die Kastration zehn Tage, bei zwei Rüden (F, G) 40 Tage nach der zweiten Wärmeapplikation. Die Hoden sowie Nebenhoden aller Rüden wurden histologisch im Rahmen der Dissertation von HERR (2010) untersucht. 34